3-3-Bactériologie :
3-3-1-Méthodes de cultures :
Choix des milieux :
Milieux non
chromogènes
Les milieux les plus usuels étaient adaptés
à la croissance des entérobactéries + indicateur de
l'attaque du lactose permettant une différenciation des colonies
*non sélectifs: CLED, milieu lactose au
bromocrésol pourpre BCP
OU
*sélectifs: géloses Mac Conkey / GS+ANC
Milieux chromogènes :
Utilisation des substrats synthétiques qui sont des
analogues structuraux d'une molécule naturellement clivée par une
enzyme caractéristique d'une espèce bactérienne ou d'un
groupe d'espèces bactériennes
Le substrat clivé acquiert des
propriétés chromogéniques et précipite en colorant
la colonie sans diffuser dans la gélose
La plupart des milieux chromogènes utilisent un jeu
de différents substrats permettant une bonne différenciation des
colonies et une identification présomptive de ou des espèces
bactériennes présentes dans l'urine
Mode d'ensemencement :
L'ensemencement doit répondre au double but de
dénombrer les
Bactéries et d'isoler la ou les bactéries en
cause en obtenant des colonies bien Distinctes les unes des autres.
Méthode originale de KASS
:
On fait des dilutions en série de 10 en 10, Un volume
connu de Chaque dilution est étalé sur une boîte de
pétri
Méthode simplifiée de Veron :
L'urine est diluée au 1/100 en eau distillée
stérile. On étale 0,1 ml de Cette dilution. Une colonie
correspond à 1000 bactéries par ml.
Méthode de la lame immergée
:
Dans l'urine préalablement diluée
Au 1/1000.
Elle permet l'ensemencement des urines dès
l'émission. L'urine
Fraîchement émise est versée dans un pot
a spatule (pot a selles). La spatule (Qui retient 40 ul d'urine environ) est
agitée dans un flacon-diluant contenant 40 ml d'eau stérile. La
lame est immergée dans cette dilution. Une colonie Correspond a 4.104
bactéries par ml.
3-3-2-Coloration :
Réalisation du frottis :
ü sur une lame bien dégraissée a la
chaleur ou a l'alcool :
ü déposer une goutte d'eau
distillée
ü Ajouter a l'anse de platine
stérilisée une goutte d'une colonie isolée
ü Étaler et fixer a la chaleur a environ
40°C pendant 10 a 15 minutes
ü Poser la lame séchée sur le portoir
reposant sur un bac de coloration
Coloration de Gram :
La coloration de gram doit son nom au
bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mit au point le
protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence
les propriétés de la paroi bactérienne, et
d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier.
Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries
présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la
forme.
Voici successivement les différentes étapes de
cette coloration :
ü Coloration par le violet de gentiane ou
cristal violet. Laisser agir de 30 seconds
ü Rincer a l'eau
déminéralisée
ü Mordançage au luge (solution
d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 1
munite
ü Rincer a l'eau
déminéralisée
ü Décoloration (rapide) à
l'éthanol (95%) verser goutte à goutte, et surveiller la
décoloration (5 a 10 secondes). Le filet doit être clair a la fin
de la décoloration.
ü Rincer a l'eau
déminéralisée
ü Recoloration a la safranine ou a la
fuchsine. Laisser agir de 30 secondes a 1 minute
ü Laver doucement a l'eau
déminéralisée. Sécher la lame sur une platine
chauffante a 40°C, 10 a 15 minutes.
ü Observer avec une goutte d'huile a immersion objectif
100 (grossissement x1000).
Schéma représentant la coloration de
gram
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