Purification et caractérisation chimique et biologique partielles des principes actifs des feuilles de Pechia Madagascariensis

UNIVERSITE D'ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE

BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE

En vue de l'obtention du Diplôme d'Etudes Approfondies (DEA)

Option : BIOCHIMIE APPLIQUEE AUX SCIENCES MEDICALES

PURIFICATION ET CARACTERISATION CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE PARTIELLES DES PRINCIPES ACTIFS DES EXTRAITS DE FEUILLES DE Pechia madagascariensis (APOCYNACEAE)

Présenté par : BOTOSOA Jean Ariel

Maître ès Sciences

Soutenu le 16 Avril 2010

Devant le jury composé de :

Président	: Professeur RALISON Charlotte
Rapporteur	: Professeur JEANNODA Victor
Examinateurs	: Docteur RANDRIANIERENANA Ando
	Docteur RAZAFIARIMANGA Zara

TABLES DES MATIERES

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DEDICACES.......................................................................................... REMERCIEMENTS................................................................................. ABREVIATIONS..................................................................................... GLOSSAIRE.......................................................................................... LISTE DES TABLEAUX......................................................................... LISTE DES FIGURES............................................................................... INTRODUCTION GENERALE................................................................... PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE 1 INTRODUCTION................................................................................. 2 MATERIELS ET METHODES.................................................................. 2.1 MATERIELS 2.1.1 MATERIEL VEGETAL 2.1.1.1 Classification 2.1.1.2 Description botanique de Pechia madagascariensis 2.1.1.2.1 Description du genre Pechia 2.1.1.2.2 Description de l'espèce............................................. 2.1.1.3 Distribution géographique de la plante................................. 2.1.1.4 Date et lieu de récolte...................................................... 2.1.1.5 Utilisation de la plante...................................................... 2.1.1.6 Les produits chimiques................................................... 2.2 METHODES............................................................................... 2.2.1 Préparation et conservation du matériel végétal 2.2.2 METHODES D'EXTRACTION 2.2.2.1 Extraction à froid 2.2.2.2 Extraction à chaud......................................................... 2.2.3 METHODES DE PURIFICATION............................................. 2.2.3.1 Traitement par la chaleur................................................ 2.2.3.1.1 Principe.................................................................. 2.2.3.1.2 Mode opératoire........................................................ 2.2.3.2 Dialyse........................................................................ 2.2.3.2.1 Principe.................................................................. 2.2.3.2.2 Mode opératoire...................................................... a) Préparation de la membrane de dialyse............................. b) Mise en route de la dialyse .......................................... 2.2.3.3 Traitement par l'acétate d'éthyle....................................... 2.2.3.3.1 Principe.................................................................. 2.2.3.3.2 Mode opératoire...................................................... 2.2.3.4 Traitement par l'acétate neutre de plomb................................. 2.2.3.4.1 Principe.................................................................. 2.2.3.4.2 Mode opératoire...................................................... 2.2.4 METHODE DE CALCUL DE RENDEMENT................................. 2.2.5 METHODE DE CONCENTRATION............................................. 2.2.6 METHODES D'ANALYSE........................................................... 2.2.6.1 Chromatographie sur couche mince...................................... 2.2.6.1.1 Principe ............................................................... 2.2.6.1.2 Mode opératoire...................................................... a) Dépôt de l'échantillon................................................... b) Développement de la plaque.......................................... c) Révélation du chromatogramme....................................... 2.2.6.2. Réaction de détection des familles chimiques........................ 2.2.6.2.1 Les alcaloïdes......................................................... a) Test de MAYER......................................................... b) Test de WAGNER...................................................... c) Test de DRAGENDORFF 2.2.6.2.2 Les flavonoïdes et leucoanthocyanes a) Les flavonoïdes (test de WILSTATER) b) Les leucoanthocyanes (test de BATE-SMITH) 2.2.6.2.3 Les tanins et polyphénols a) Test à la gélatine b) Test à la gélatine salée c) Test au chlorure ferrique 2.2.6.2.4 Les anthraquinones (test de BORNSTRÄGER) 2.2.6.2.5 Les désoxyoses (test de KELLER-KILIANI) 2.2.6.2.6 Les irridoïdes 2.2.6.2.7 Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés............ a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD.............................. b) Test de SALKOWSKI................................................... 2.2.6.2.8 Les saponines......................................................... 3. RESULTATS...................................................................................... 3.1 EXTRACTION ET PURIFICATION DES PRINCIPES TOXIQUES......... 3.1.1 EXTRACTION..................................................................... 3.1.1.1 Extraction aqueuse à froid 3.1.1.2 Extraction hydroéthanolique à froid 3.1.2.1 Extraction aqueuse à chaud 3.1.2.2 Extraction hydroéthanolique à chaud 3.1.2 PURIFICATION 3.1.2.1 Traitement par la chaleur................................................ 3.1.2.2 Dialyse........................................................................ 3.1.2.3 Traitement par l'acétate d'éthyle....................................... 3.1.2.4 Précipitation par l'ANP................................................... 3.2 RENDEMENT............................................................................. 3.3 DEGRE D'HOMOGENEITE DES EXTRAITS.................................... 3.4 CARACTERISATION CHIMIQUES................................................ 3.4.1 Propriétés physico-chimiques................................................... 3.4.2 Nature chimique .................................................................. 4 DISCUSSION ET CONCLUSION............................................................. DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE 1 INTRODUCTION................................................................................. 2 MATERIELS ET METHODES 2.1 MATERIELS 2.1.1 LES ANIMAUX D'EXPERIMENTATION 2.1.1.1 Les souris.................................................................. 2.1.1.2 Le sang de mouton......................................................... 2.1.1.3 Les têtards de grenouille................................................ 2.1.1.4 Les alevins de poisson.................................................... 2.1.1.5 Les larves de moustique................................................ 2.1.2 LES VEGETAUX D'EXPERIMENTATION 2.1.3 LES MATERIELS DE MICROBIOLOGIE................................. 2.1.3.1 Les microorganismes utilisés.......................................... 2.1.3.2 Les milieux utilisés......................................................... 2.1.3.3 Les disques pour les tests d'antibiogramme........................ 2.2 METHODES.............................................................................. 2.2.1 METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD........................................................................ 2.2.1.1 Test sur souris............................................................ 2.2.1.1.1 Estimation de la toxicité aigüe.......................................... 2.2.1.1.2 Détermination de la DL50 (24 h).................................... 2.2.1.2 Test hémolytique......................................................... 2.2.1.2.1 Principe.................................................................. 2.2.1.2.2 Mode opératoire......................................................... 2.2.2 METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID......................................................................... 2.2.2.1 Principe 2.2.2.2 Mode opératoire 2.2.2.2.1 Test sur les têtards de grenouille 2.2.2.2.2 Test sur les alevins de poisson 2.2.2.2.3 Test sur les larves de moustique 2.2.3 METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX 2.2.3.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines 2.2.3.2 Eude des effets sur la croissance des jeunes plantules 2.2.3.3 Etude des effets sur les bourgeons axillaires 2.2.4 METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROOGANISMES............................................................ 2.2.4.1 Techniques de stérilisation............................................... 2.2.4.2 Méthodes d'identification des germes.................................. Coloration Gram................................................................. a) Principe....................................................................... b) Mode opératoire 2.2.4.3 Methode d'étude de l'activité antimicrobienne........................ a) Principe....................................................................... b) Test d'activité antimicrobienne........................................... 2.2.4.4 Détermination de la CMI................................................. 3 RESULTATS....................................................................................... 3.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX................................. 3.1.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD... 3.1.1.1 Effets sur les souris...................................................... 3.1.1.2 Détermination de la valeur de la DL50 (24h)........................ 3.1.1.3 Effets sur les hématies de mouton.................................... 3.1.2 EFFETS DE L'EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID.......................................................................... 3.1.2.1 Effets sur les têtards de grenouille 3.1.2.2 Effets sur les alevins de poisson 3.1.2.3. Effets sur les larves de moustique 3.2 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX 3.2.1 EFFETS DE L'EXTRAIT BRUT SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES........................................................... 3.2.1.1 EFFETS DE L'EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES................................................... 3.2.1.1.1 Croissance de l'épicotyle et de l'hypocotyle en fonction des conditions de trempage....................................................... 3.2.1.1.2 Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur la croissance de l'épicotyle et de l'hypocotyle........................... 3.2.3 EFFETS SUR LA CROISSANCE DES BOURGEONS AXILLAIRES............................................................................ 3.3 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES 3.3.1 Caractère d'identification morphologique.................................... 3.3.2 Activité antimicrobienne de l'extrait brut en milieux solide............... 4 DISCUSSION ET CONCLUSION.............................................................. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES D'AVENIR............................. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................... ANNEXES RESUME

VI VII VIII IX X XI 1 5 5 5 5 5 6 6 6 8 8 8 8 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 10 11 11 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 13 13 13 13 14 14 14 14 14 14 15 15 15 15 15 15 16 16 16 16 16 17 17 17 18 18 18 18 18 18 19 19 20 20 20 20 22 22 23 23 23 25 26 26 26 26 26 27 27 27 27 27 28 28 29 29 29 29 29 29 29 30 30 30 32 32 32 33 33 33 33 33 34 34 35 35 35 35 35 35 36 36 36 37 38 38 38 38 38 40 41 41 42 43 44 44 45 46 49 52 53 53 53 55 57 58

DEDICACES

A Notre Seigneur Dieu, Roi de l'univers « Je te loue parce que tu m'as exaucé, parce que tu m'as sauvé » Psaume 118 : 21.

A ma mère : tes sacrifices et ton amour m'ont aidé à rester dans la bonne voie. Merci infiniment pour ce précieux héritage.

A mes soeurs, pour les durs sacrifices que vous avez acceptés durant mes longues années d'études Vos conseils et vos aides resteront toujours un trésor inestimable. Recevez l'assurance de mon total dévouement et de tout mon amour. Que Dieu vous bénisse.

A toute ma famille, mes sincères remerciements. A mon oncle qui m'a toujours encouragé et aidé à surmonter les difficultés que j'ai rencontrées pendant l`élaboration de cet ouvrage. Avec toute mon affection.

A toute ma promotion, en souvenir des stages de laboratoire et des années d'études universitaires. Je vous souhaite une suite de carrière scientifique fructueuse.

REMERCIEMENTS

Le présent travail a été réalisé dans le laboratoire du département de Biochimie fondamentale et appliquée de la Faculté des Sciences de l'Université d'Antananarivo.

Nous exprimons nos chaleureux remerciements à Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Responsable de la formation en 3^me cycle, encadreur de notre stage. Nous tenons à le remercier pour ses conseils et son aide considérable dans l'élaboration et la finition de ce mémoire, malgré ses nombreuses responsabilités.

Nous témoignons notre vive et sincère reconnaissance à Madame le Docteur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle A. Doll, Chef du département de Biochimie fondamentale et appliquée, co-encadreur de notre stage pour ses conseils et suggestions, ainsi que son apport précieux dans la réalisation du manuscrit, malgré ses nombreuses occupations.

Nous adressons notre profonde gratitude à Madame le Professeur RALISON Charlotte qui nous fait l'honneur de présider le jury de ce mémoire malgré ses nombreuses tâches.

Nous tenons à remercier sincèrement Madame le Docteur RANDRIANIERENANA Ando.et Madame le Docteur RAZAFIARIMANGA Zara pour nous avoir fait l'honneur d'accepter de juger ce travail malgré leurs multiples obligations.

Nous remercions aussi toutes les personnes qui ont apporté une aide technique tout au long de ce travail, en particulier Monsieur le Docteur RANDRIANARIVO Ranjana, ainsi que l'équipe du laboratoire de Biochimie fondamentale et appliquée.

Enfin, nos remerciements s'adressent à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

ABREVIATIONS

ANP  : Acétate neutre de plomb

B/A/E  : Butanol/Acide acétique/Eau distillée

CCM  : Chromatographie sur couche mince

CL50 (24 h) : Concentration létale 50% en 24h

CMI  : Concentration minimale inhibitrice

Da   : Dalton

DL50 (24 h) : Dose létale 50% en 24h

DO  : Densité optique

EB : Extrait brut

ED  : Eau distillée

h   : Heure

IMVAVET  : Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires

IPM : Institut Pasteur de Madagascar

LABASM : Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales

min : Minute

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PBS : Phosphate buffered saline

P/P/P : Poids par poids

P/V : Poids par volume

qsp  : En quantité suffisante pour

UV  : Ultraviolet

V/V : Volume par volume

GLOSSAIRE

Analgésique : qui supprime ou atténue la douleur.

Anthère : partie globuleuse de l'étamine des Phanérogames, dans laquelle se forment les grains de pollen et qui s'ouvre à maturité pour laisser échapper ceux-ci.

Antiasthmatique : qui prévient ou soulage la crise d'asthme.

Antiappétent(e) : qui diminue l'appetit.

Calice : ensemble des sépales d'une fleur.

Cyme : Type d'inflorescence centrifuge dont l'axe principal se termine par une fleur.

Convulsion clonique : altenance de contractions et de relâchements des muscles.

Corolle : ensemble des pétales d'une fleur.

Décoction : procédé consistant à faire bouillir une substance dans un liquide, pour extraire les principes solubles.

Glabre : dépourvu de poils ; se dit également des parties d'une plante qui est très jeune.

Drupoïde : ayant la forme d'un fruit charnu dont l'endocarpe lignifié forme un noyau.

Furonculose : état caractérisé par l'apparition simultanée ou successive de plusieurs furoncles disséminés dans diverses régions cutanées.

Hypotensif : qui diminue la pression artérielle.

Morphine : alcaloïde le plus important et le plus actif extrait de l'opium.

Pédoncule : support ou queue d'une fleur ou d'un fruit.

Sempervirent(e) : qui porte des feuilles vertes toutes l'année, à feuilles persistantes.

Tonique : qui augmente la vigueur de l'organisme (fortifiant, reconstituant, stimulant).

LISTE DES TABLEAUX

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Tableau 1 : Caractéristiques des différents extraits bruts préparés à partir des feuilles de Pechia madagascariensis...................................... Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique de l'extrait brut (EB) et de l'extrait purifié (E3)......................................................... Tableau 3 : Végétaux d'expérimentation................................................ Tableau 4 : Composition des différents milieux pour le test hémolytique.......... Tableau 5 : Normes utilisées pour l'expression des résultats......................... Tableau 6 : Résultats de la détermination de la DL50................................. Tableau 7 : Valeurs utilisées pour la détermination de la DL50 (24 h) par la méthode graphique.......................................................... Tableau 8 : Effets de l'extrait brut et de l'extrait E3 à différentes concentrations sur les hématies de mouton................................................. Tableau 9 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les têtards de grenouille..................................................................... Tableau 10 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les alevins de poisson..................................................................... Tableau 11 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les larves de moustique..................................................................... Tableau 12 : Effets de l'extrait brut à 1mg/ml sur le pouvoir germinatif des différentes graines........................................................... Tableau 13 : Caractéristiques des souches bactériennes.............................. Tableau 14 : Effets de l'extrait brut sur les germes utilisés..........................

19 24 28 31 37 39 39 41 42 43 44 45 53 54

LISTE DES FIGURES

LISTES DES FIGURES

LISTES DES FIGURES

LISTES DES FIGURES

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Figure 1 : Rameau feuillu de Pechia madagascariensis.............................. Figure 2 : Schéma résumant le protocole d'extraction et de purification des principes toxiques des feuilles de Pechia madagascariensis............. Figure 3 : CCM dans le système B/A/E 60/20/20  (P/P/P) des différents extraits obtenus au cours de la purification des principes toxiques des feuilles de Pechia madagascariensis.................................................. Figure 4 : Détermination graphique de la DL50 (24 h)................................. Figure 5 : Test hémolytique de l'extrait brut et de E3 sur les hématies de mouton.......................................................................... Figure 6 : Schéma résumant les différentes étapes de l'expérience sur la croissance des jeunes plantules.............................................. Figure 7 : Croissance de l'épicotyle de riz en fonction des conditions de trempage.......................................................................... Figure 8 : Croissance de l'ypocotyle de riz en fonction des conditions de trempage......................................................................... Figure 9: Croissance de l'épicotyle de petit pois en fonction des conditions de trempage........................................................................ Figure 10 : Croissance de l'hypocotyle de petit pois en fonction des conditions de trempage........................................................................ Figure 11 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur le développement de l'épicotyle de riz.......................................... Figure 12 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur le développement de l'hypocotyle de riz...................................... Figure 13 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur le développement de l'épicotyle de petit pois.................................. Figure 14 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur le développement de l'hypocotyle de petit pois............................... Figure 15 : Effets des extraits sur le développement des bourgeons axillaires..............................................................................................

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INTRODUCTION GENERALE

Depuis des temps anciens, l'Homme s'est toujours intéréssé aux poisons. Bien que conscient du danger présenté par ces derniers, l'Homme a toujours su en tirer profit pour diverses fins, notamment pour la chasse, la pêche, la lutte contre les animaux nuisibles, la guerre, l'élimination des ennemis ou le traitement de certaines maladies.

Des travaux de recherche ont montré que de nombreux organismes animaux et végétaux et microbiens élaborent des substances toxiques pouvant avoir une hétérogénéité structurale et des propriétés physico-chimiques très variées. Ces substances communément appelées toxines, une fois introduites dans un organisme vivant, engendrent des pertubations majeures et conduisent souvent à la mort de l'organisme touché.

Les connaissances sur les diverses toxines et leur mécanisme d'action n'ont cessé d'être enrichies grâce à la toxicologie, qui est une branche de la science traitant les poisons. L'apport de diverses disciplines scientifiques comme la pharmacologie, la biochimie, la physiologie, la chimie, et la médecine ont permis à la toxicologie de connaître un essor considérable.

Aujourd'hui, plusieurs toxines d'origines diverses ont pu être isolées et caractérisées sur le plan chimique et biologique. Certaines ont servi à l'élucidation des phénomènes biologiques et à comprendre certaines voies métaboliques. D'autres ont des intérêts agricoles (biopesticides) ou thérapeutiques. Citons par exemple :

- la colchine, un alcaloïde d'une plante égyptienne Colchicum autumnale qui a une propriété antimitotique et qui est utilisée comme anticancéreux (BRUNETON, 1993) ;

- l'atropine issue d'Atropa belladona, douée d'une propriété vagolytique, qui est utilisée comme antispasmodique et comme dilatateur de la pupille (GOLDSTEIN et coll., 1974) ;

- la toxine cholérique, isolée du bacille Vibrio cholerae qui est un activateur universel de l'adénylate cyclase. Ainsi elle a constitué un outil essentiel pour l'investigation des effets biologiques de l'AMPc et du mécanisme de régulation de ce messager, ainsi que pour la mise en évidence de la structure et de la fonction des membranes cellulaires (BENNET et CUATRECASAS, 1977) ;

- la roténone, isolée des PAPILIONACÉES, qui a considérablement contribué à la compréhension du fonctionnement de la chaîne respiratoire (MORELAND, 1980) ;

- la toxine tétanique ou tétanospasmine, protéine isolée de la bactérie Clostridium tétani, qui a été un outil très précieux dans l'exploration du fonctionnement du système nerveux central (BIZZINI, 1977) ;

- la morphine, extraite de Papaver somniferum, qui est un analgésique très efficace (BRUNETON, 1993) ;

- la toxine issue du venin de crotale, préconisée pour traiter l'épilepsie et certaines tumeurs malignes (MENEZ et coll., 2006) ;

- l'azadirachtine une toxine issue des graines de Azadirachta indica, à activité anti-appétente et inhibitrice de croissance pour les insectes. L'huile de ces graines est utilisée depuis des siècles pour protéger les stocks de céréales contre les attaques d'insectes (MENEZ et coll., 2006).

Aujourd'hui, les toxicologues ne cessent de rechercher davantage de nouvelles toxines en vue de les exploiter et les utiliser à des fins utiles.

Madagascar, par sa richesse en biodiversité (faune et flore) renferme de nombreuses espèces. On y dénombre plus de 12 000 espèces végétales dont 80% sont endémiques (RABESA, 1986). Bon nombre d'entre elles ont des vertus thérapeutiques et sont utilisées par les paysans en pharmacopée traditionnelle. Mais certaines espèces sont réputées toxiques. Citons quelques exemples de plantes médicinales mais connues pour leur toxicité :

- les écorces de tronc et de racine de Cabucala cryptophella (APOCYNACEES) contenant principalement des alcaloïdes, qui ont des vertus thérapeutiques considérables (BOITEAU, 1993) ;

- le decocté de feuilles Dodonea viscosa (SAPINDACEE) utilisé comme molluscicide qui sert à soigner la goutte et les maladies rhumatismales (LAVERGNE, 1989).

- les feuilles écrasées de Sophora denudata (FABACEE) à activité rodenticide qui permet également de soigner les cancers de la peau (LAVERGNE, 1989) ;

- le decocté des écorces d'Albizia lebbeck (FABACÉE), une plante réputée toxique, qui est utilisé pour traiter les manifestations allergiques telles que l'asthme, l'eczéma ou le prurit (TRIPATHI et coll., 1979) ;

- le décocté de feuilles d'une autre plante toxique, Psiadia altissima, efficace pour calmer les maux de ventre, rétablir une indigestion et guérir la blennorragie (RABESA, 1986) ;

- le décocté de feuilles de Gambeya boiviniana une SAPOTACEE toxique, qui est utilisé pour guérir l'enfant sujet à des crises convulsives hyperthermiques simples (RASOATAHINA, 2005).

Le laboratoire de Biochimie fondamentale et appliquée (LABASM) a orienté depuis quelques années ses travaux de recherche vers l'étude chimique et toxicologique des principes actifs des plantes, en particulier les principes toxiques. Plusieurs végétaux issus de diverses familles ont déjà fait l'objet d'etudes approfondies. Parmi les plantes déjà étudiées, on peut citer :

- une BOLETACEE, Boletus affinis Peck (RAZANAMPARANY, 1987) ;

- une GENTIANACEE, Tachiadenus longiflorus (RAKOTO-RANONOROMALALA, 1989) ;

- des FABACEES, Albizia arenicola (RANDRIANARIVO, 1996 ; 2003), Albizia odorata (RAJEMIARIMOELISOA, 2000), Albizia bernieri (RAHARISOA, 1999), Abizia sp (RAMAMONJISON, 1998) ;

- une SAPINDACEE, Deinbollia boinensis (RAKOTOBE, 2003) ;

- une CUCURBITACEE, Xerosicyos danguyi (RAKOTONDRAZANAKA, 1999) ;

- une PITTOSPORACEE, Pittosporum senacia (RAZAFINTSALAMA, 2006) ;

- une SAPOTACEE, Gambeya boiviniana (RASOATAHINA, 2005);

- une BIGNONIACEE, Phyllarthron madagascariense (IBRAHIM, 2005);

- une EUPHORBIACEE, Uapaca thouarsii (RANDRIANANDRASANA, 2004) ;

- une MORACEE, Pachytrope dimepate (KANIZA, 2007) ;

- une ANNONACEE, Xylopia humblotiana (RASOLONDRAIBE, 2007)

- des CONNARACEES, Rourea orientalis (RAKOTO-RANOROMALALA, 1984) ; Cnestis glabra et Cnestis polyphylla (JEANNODA, 1986).

Pour notre part, notre choix s'est fixé sur les feuilles de Pechia madagascariensis, une APOCYNACEE malgache, pour les raisons suivantes :

- D'autres plantes de la même famille ont été étudiées et ont montré une forte toxicité, en particulier Cabucala erythrocarpa (RAKOTO ANJANOROSOA, 2007);

- Une activité toxique sur souris a été mise en évidence lors des tests préliminaires sur les feuilles de la plante.

- Les enquêtes ethnobotaniques menées sur le lieu de récolte, ont montré que la plante possède des vertus thérapeutiques. En effet, le décocté de la feuille de la plante est utilisé par les villageois pour soigner les maux de ventre et les rhumatismes ;

- L'espèce est endémique de Madagascar ;

- A notre connaissance; aucune étude chimique et toxicologique concernant les principes actifs contenus dans la plante n'a été entreprise.

Le présent travail comprend deux grandes parties :

- la première partie est consacrée à l'étude chimique qui comprend la purification et la caractérisation physico-chimique des principes actifs ;

- la seconde partie, traite l'étude des propriétés toxicologiques des extraits obtenus à partir des feuilles de Pechia madagascariensis.

Les deux parties sont précédées d'une introduction générale et suivies d'une conclusion générale accompagnée des perspectives d'avenir.

PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE

1. INTRODUCTION

D'après la littérature, aucune étude autre que botanique n'a été effectuée jusqu'à présent sur Pechia madagascariensis (APOCYNACEAE). Dans cette première partie, une étude chimique des principes toxiques contenus dans les feuilles de la plante a été entreprise. Cette étude a pour objectifs :

- de mettre au point un procédé d'extraction des principes toxiques à partir de la poudre de feuilles ;

- d'établir un procédé de purification permettant d'obtenir un extrait suffisamment purifié ;

- d'étudier les propriétés physico-chimiques des principes toxiques et déterminer leur nature chimique.

2. MATERIELS ET METHODES

2.1. MATERIELS

2.1.1. MATERIEL VEGETAL

2.1.1.1. Classification

Règne : VEGETAL

Embranchement : SPERMAPHYTES

Sous-embranchement : ANGIOSPERMES

Classe : DICOTYLEDONES

Sous-classe : ASTERIDAE

Ordre : GENTIANALES

Famille : APOCYNACEAE

Genre : Pechia

Espèce : madagascariensis

Nom vernaculaire : Tongoborano

La plante a été identifiée au laboratoire du Parc botanique et zoologique de Tsimbazaza par comparaison à un échantillon d'herbier déposé sous le numéro 13762 par LEEWWENBERG, en 1985.

2.1.1.2. Description botanique

2.1.1.2.1 Description du genre Pechia (MARKGRAF, 1976)

Les représentants du genre Pechia sont des arbustes ou petits arbres. Les feuilles sont persistantes, glabres, verticillées par 3 à 5 sur les rameaux plus forts et souvent par 3 sur les derniers noeuds des rameaux florifères. Elles sont opposées sur les rameaux plus jeunes et sont pourvues de glandes stipiliformes intrapétiolaires et/ou interpétiolaires.

Les inflorescences sont terminales et axillaires, en cymes, bractéolées et glabres. Les sépales sont petits, ovales-triangulaires et brièvement soudés à la base. La corolle est odorante et jaunit rapidement après l'anthèse. Le tube est glabre en dehors et le dedans est poilu. Il est cylindrique et renflé sous la gorge, laquelle est rétrécie en anneau calleux. Plus courts que le tube, les lobes sont oblongs, se recouvrent à gauche et sont non infléchis dans le bouton. L'anthère est aussi oblongue et aiguë, avec un filet court inséré sur le renflement du tube. Les ovaires ont deux loges séparées glabres, ogivales ou coniques qui sont plus longues que le calice et qui renferment des ovules peu nombreux.

Les fruits, de couleur rouge, sont apocarpes, monoliformes et drupoïdes. Chaque article contient son propre endocarpe, lequel est dur et rugueux, incluant une graine ellipsoïdale, aplatie, à testa mince et lisse, et à albumen charnu et non ruminé. L'embryon est droit et à cotylédon ovale oblong.

2.1.1.2.2 Description de l'espèce

Pechia madagascariensis figure 1 (p. 7) est un arbuste à latex blanc, atteignant 10 m de haut. L'écorce est lisse, souvent fissurée transversalement. Les feuilles sont en verticilles de 3 à 4. Elles sont opposées, simples et entières avec des pétioles de 1 à 15 mm de long. Le limbe est elliptique jusqu'à 23,5 cm × 10,5 cm, avec une base cunéiforme, un apex acuminé et à nervure latérale droite en 15-20 paires.

L'inflorescence est en cyme terminal souvent par groupes de plusieurs portant des fleurs peu nombreuses, lâches. Le pédoncule a 2,5-6 cm de long et les bractées sont aussi longues que les sépales. Les fleurs sont bisexuées et régulières en pentamères, avec un pédicelle de 2 à 11 mm de long. Les sépales sont ovales. La corolle, de couleur vert pâle ou jaune pâle, est munie d'une ceinture de poils au-dessous de l'insertion des étamines.

Les étamines sont insérées dans la partie supérieure de la corolle. Les ovaires supères sont formés de 2 carpelles distincts, le style est mince et la tête du pistil petite.

Les fruits sont composés de 2 follicules cylindriques. Chaque follicule est composé de 1 à 13 drupes de couleur orangée et chaque drupe renferme une seule graine.

Figure 1 : Rameau feuillu de Pechia madagascariensis

2.1.1.3. Distribution géographique de la plante

Pechia madagascariensis est une espèce endémique de Madagascar. Rencontrée dans les forêts humides sempervirentes près des côtes, elle pousse principalement dans la région Atsinanana (Toamasina), c'est-à-dire aux alentours de Foulpointe, dans la forêt d'Analalava, à Analangavo et dans la forêt du nord du Sihanaka, ainsi que dans la région Sava (Antsiranana), à Nosy Komba.

2.1.1.4. Date et lieu de récolte

La plante a été récoltée dans la forêt d'Analalava, à 115 km au nord de Toamasina, en Octobre 2007. Elle était au stade végétatif.

2.1.1.5. Utilisations de la plante

D'après les enquêtes ethnobotaniques auprès des villageois, le décocté de feuilles est utilisé contre les maux de ventre et le rhumatisme. Il est aussi pris comme tonique.

2.1.2. LES PRODUITS CHIMIQUES

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés sont de qualité pour analyse et de marque MERCK ou PROLABO.

Les supports utilisés pour la CCM (chromatographie sur couche mince) sont des plaques de gel de silice 60F₂₅₄ (marque MERCK) ; de dimensions 20 × 20 cm, l'épaisseur de la couche étant de 0,2 mm. Les plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues.

2.2. METHODES

2.2.1. PREPARATION ET CONSERVATION DU MATERIEL VEGETAL

Les feuilles sont séchées à l'abri du soleil (à l'intérieur) pendant 2 semaines puis réduites en poudre par une série de broyages à l'aide d'un mixer de marque BLENDER (Robot coupe GT₅₅₀). La poudre de feuilles ainsi obtenue est conservée dans un bocal hermétique à la température ambiante.

2.2.2. MÉTHODE D'EXTRACTION

2.2.2.1. Extraction à froid

La poudre de feuilles est mise en suspension dans le solvant d'extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) selon le rapport 1/10 (P/V) (10 ml de solvant pour 1g de poudre). Le mélange est soumis à une agitation magnétique durant 3 h à la température ambiante, puis laissé macérer à +4°C pendant une nuit. Le macérat est ensuite filtré sur quatre épaisseurs de gaze après avoir été agité à nouveau pendant 1 h. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10 000 tours /min (centrifugeuse JOUAN, T52), pendant 15 min. Le culot est écarté et le volume du surnageant est réduit jusqu'au rapport 1/1 (P/V) (1 ml d'extrait pour 1 g de poudre de feuilles) par évaporation du solvant d'extraction (voir méthode au paragraphe 2.2.5, p. 13)

La solution obtenue constitue l'extrait brut (EB).

2.2.2.2. Extraction à chaud

La poudre de feuilles est mise en suspension dans le solvant d'extraction (eau distillée ou mélange hydroéthanolique 75%) selon le rapport 1/10 (P/V). Le mélange est chauffé à reflux sous agitation magnétique, à la température d'ébullition du solvant d'extraction pendant 3 h après la tombée de la première goutte. Après refroidissement, l'ensemble est laissé macérer pendant une nuit à +4° C.

La suite de la manipulation est identique à celle de l'extraction à froid.

2.2.3. METHODES DE PURIFICATION

(MAHUZIER et HAMON, 1990 ; KAMOUN, 1991, AUGIDIER et coll. ; 1982)

2.2.3.1. Traitement par la chaleur

2.2.3.1.1. Principe

Cette méthode est utilisée au cours de la purification d'extraits biologiques, pour éliminer certaines macromolécules telles que les protéines ou les acides nucléiques qui coagulent sous l'effet de la chaleur.

2.2.3.1.2. Mode opératoire

L'extrait à traiter est chauffé au bain-marie bouillant à 96°C pendant environ 15 min. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à 3 000 x g pendant 15 min (centrifugeuse BREMSE, TH12), puis le surnageant est récupéré.

2.2.3.2. Dialyse

2.2.3.2.1. Principe

La dialyse est une technique de séparation des molécules en fonction de leur taille. Au cours de la dialyse, la membrane poreuse joue le rôle de tamis. Ceci s'explique par sa perméabilité ou non à certaines substances selon leur taille. Les molécules traversent la membrane en diffusant vers le liquide de contre-dialyse (à l'extérieur de la membrane). La diffusion des grosses molécules étant lente ou nulle, celle des petites est rapide car elle est peu freinée par les frottements sur les parois (AUDIGIER et coll., 1982).

D'autres phénomènes peuvent aussi intervenir pendant la dialyse :

- l'adsorption de certains solutés sur la membrane, entraînant des modifications locales de concentration ;

- le phénomène d'osmose.

2.2.3.2.2. Mode opératoire

La membrane à dialyse utilisée se présente sous forme d'un cylindre en cellophane de 33 mm de largeur à plat, appelé boudin ou sac à dialyse. La membrane laisse passer des substances dont le poids moléculaire est inférieur à 6000-8000 Da.

a) Préparation de la membrane de dialyse

Le boudin à dialyse est bouilli dans l'eau distillée pendant 15 min, afin d'éliminer les glycérines, les composés sulfurés et les métaux lourds qui protègent la membrane, puis l'eau est éliminée. Cette opération est répétée 3 à 4 fois. Après refroidissement, le boudin ainsi préparé peut être conservé à +4°C pendant quelques jours dans la dernière eau bouillie.

Avant l'utilisation, le boudin doit de nouveau être rincé à l'eau distillée.

b) Mise en route de la dialyse

Le boudin à dialyse contenant l'extrait est fermé à ses extrémités par un noeud. Il est immergé dans le liquide de contre-dialyse qui est l'eau distillée de volume égal à 100 fois celui de l'extrait à l'intérieur du boudin. L'ensemble est agité magnétiquement pour empêcher la formation d'un gradient de concentration autour du boudin de dialyse. Le liquide de contre-dialyse doit être renouvelé fréquemment afin d'accélérer la disparition des substances diffusibles dans le boudin et de maintenir la différence de concentration entre les deux milieux.

A la fin de la dialyse, la solution à l'intérieur du boudin (adialysat) ainsi que celle à l'extérieur (dialysat) sont concentrées par évaporation jusqu'à leur volume initial.

2.2.3.3. Traitement par l'acétate d'éthyle

2.2.3.3.1. Principe

Cette technique permet le fractionnement des substances selon leur solubilité relative vis-à-vis de deux solvants non miscibles tels que l'acétate d'éthyle et l'eau.

2.2.3.3.2. Mode opératoire

L'extrait à fractionner est mélangé volume à volume avec l'acétate d'éthyle dans une ampoule à décanter. Le mélange est agité énergiquement puis laissé reposer jusqu'à ce qu'il y ait séparation totale de deux phases : une phase organique supérieure et une phase aqueuse inférieure.

La phase organique est recueillie alors que la phase aqueuse est soumise à deux autres traitements identiques au premier. Les trois phases organiques rassemblées ainsi que la phase aqueuse sont filtrées sur papier filtre pour éliminer les éléments insolubles. L'acétate d'éthyle est évaporé de la phase organique. Il est nécessaire d'ajouter un grand volume d'eau pour éliminer totalement le solvant.

Dans la phase aqueuse, le résidu d'acétate d'éthyle est évaporé après addition d'eau distillée. La solution finale est enfin ramenée à son volume initial par concentration.

2.2.3.4. Traitement par l'acétate neutre de plomb (ANP)

2.2.3.4.1. Principe

Les sels de métaux lourds comme l'ANP permettent d'éliminer par précipitation les grosses molécules telles que les protéines, les acides nucléiques et les acides organiques. Les extraits ainsi traités sont déféqués.

2.2.3.4.2. Mode opératoire

Une solution d'ANP à 20% (P/V) est versée goutte à goutte dans un extrait placé sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à 12 000 tours/min (BREMSE, TH12) pendant 15 min. Cette opération est répétée jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de précipité.

L'excès de plomb dans le surnagent est éliminé par précipitation à l'aide d'une solution aqueuse de phosphate disodique (Na₂HPO₄) à 10% (P/V).

2.2.4. METHODE DE CALCUL DU RENDEMENT

Après chaque étape de purification, l'extrait toxique est évaporé à sec et le résidu obtenu est pesé. Le rendement, exprimé en pourcentage par rapport au poids du matériel de départ, est déterminé par la relation suivante :

R=	(Pc-Pv) x 100
	Q

Avec R : rendement (en %)

Pc : poids du ballon avec le contenu (en g)

Pv : poids du ballon vide (en g)

Q : poids du matériel végétal de départ (en g)

2.2.5. MÉTHODE DE CONCENTRATION

Toutes les opérations d'évaporation de solvants et de réduction de volume d'extraits sont réalisées à l'aide d'un évaporateur rotatif BÜCHI (R 110) à la température 50-55°C. La pression est réduite à l'aide d'une pompe à vide.

2.2.6. MÉTHODES D'ANALYSE

2.2.6.1. Chromatographie sur couche mince

2.2.6.1.1. Principe

La chromatographie sur couche mince est un procédé d'analyse au cours duquel les substances à séparer migrent suivant une direction déterminée. La vitesse de déplacement des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile organique d'une part et des forces d'adsorption dues au support d'autre part.

2.2.6.1.2. Mode opératoire

a) Dépôt de l'échantillon

Les extraits sont analysés sur une plaque de gel de silice prête à l'emploi (voir paragraphe 2.1.2, p. 8) découpée aux dimensions voulues. Ils sont déposés à l'aide d'un capillaire à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque, et à 1,3 cm à partir des bords latéraux, en tirets de 7 mm de large espacés de 6 mm. Les dépôts sont séchés au moyen d'un séchoir à main.

b) Développement de la plaque

La plaque est ensuite placée dans une cuve à chromatographie DESAGA préalablement saturée par les vapeurs de solvant de migration grâce à l'application de papier filtre imprégné du solvant contre les parois internes du récipient. Le solvant de migration utilisé est le système Butanol/Acide acétique /Eau (BAE, 60/20/20, P/P).

Le solvant migre par capillarité vers le haut de la plaque (chromatographie ascendante), et lorsque le front du solvant se trouve à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque, la chromatographie est arrêtée. La plaque est ensuite retirée de la cuve puis séchée à l'aide d'un séchoir à main.

c) Révélation du chromatogramme

La révélation se fait :

- soit par visualisation des substances ayant migré sous lumière ultraviolette à 254 nm et à 366 nm. Les constituants apparaissent sous forme de taches fluorescentes ;

- soit par pulvérisation de la plaque avec le réactif à la vanilline sulfurique. Les constituants apparaissent sous forme de taches rose-violacé qui deviennent noires après chauffage à 120°C pendant 5 min.

La composition du réactif à la vanilline sulfurique est donnée en ANNEXE I.

2.2.6.2. Réaction de détection des familles chimiques

(FONG et coll., 1977 ; DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981 ; HEMINGWAY et KARCHESY, 1989 ; NOHARA, 1989 et AL-YAHYA, 1986).

Pour chaque méthode de détection, 1ml de l'extrait à étudier est évaporé à sec.

2.2.6.2.1. Les alcaloïdes

Le résidu d'évaporation à sec de l'extrait à analyser est mis à macérer dans 3 ml d'acide chlorhydrique (HCl) 2N. La solution ainsi obtenue est répartie dans 4 tubes à essai dont le premier sert de témoin. Les autres sont utilisés pour les tests de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF.

a) Test de MAYER

Cinq gouttes de réactif de MAYER sont ajoutées dans le second tube à essai. L'apparition d'une floculation ou d'un précipité indique la présence d'alcaloïdes.

b) Test de WAGNER

Cinq gouttes de réactif de WAGNER sont versées dans le troisième tube. L'apparition d'une floculation ou d'un précipité indique la présence d'alcaloïdes.

c) Test de DRAGENDORFF

Cinq gouttes de réactif de DRAGENDORFF sont versées dans le quatrième tube. La formation d'une floculation ou d'un précipité révèle la présence d'alcaloïdes.

Les compositions des réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF sont données en ANNEXE II.

2.2.6.2.2. Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes

Le résidu d'évaporation à sec est repris dans 10 ml d'éthanol 80%. La solution ainsi obtenue est répartie dans 4 tubes à essai. Le premier tube sert de témoin et les 3 autres contenant chacun 3 ml de solution vont servir pour les tests ci-dessous.

a) Les flavonoïdes : test de WILSTATER

La solution dans le second tube est additionnée de 0,5 ml de HCl 12,07 N et 2 tournures de magnésium. Dans le troisième tube, l'opération précédente est répétée, puis 1ml d'eau distillée et 1ml d'alcool isoamylique sont ajoutés au mélange.

Au bout de 10 min, le virage de la coloration au rouge dans le deuxième tube marque la présence de flavones, tandis qu'un changement de la coloration au rouge-pourpre ou rouge-violacé dans le troisième tube indique la présence de flavonols ou flavonones.

b) Les leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH

Dans le quatrième tube, 0,5 ml de HCl concentré (12,07N) est versé, puis, la solution est chauffée dans un bain-marie à 100°C pendant 30 min.

L'apparition d'une coloration rouge après refroidissement indique la présence de leucoanthocyanes.

2.2.6.2.3. Les tanins et autres polyphénols

Le résidu d'évaporation à sec de l'extrait à tester est dissous dans 3 ml d'eau distillée chaude à 96°C. Le mélange obtenu est réparti dans 4 tubes à essai. Le premier tube est utilisé comme témoin, tandis que les 3 autres sont destinés aux 3 tests suivants :

a) Test à la gélatine

Le deuxième tube reçoit 4 gouttes de gélatine à 1% (P/V). L'apparition d'une floculation blanche indique la présence de tanins hydrosolubles de type catéchique.

b) Test à la gélatine salée

Quatre gouttes de gélatine salée (10 g de NaCl dans 100 ml de gélatine aqueuse à 1%) sont versées dans le troisième tube. La présence de tanins condensés de type pyrogallique se traduit par la formation d'un précipité.

c) Test au chlorure ferrique

Quatre gouttes de chlorure ferrique (FeCl₃) 10% en solution méthanolique sont ajoutées dans le quatrième tube. L'apparition d'un précipité de couleur vert-noir indique la présence de tanins de type catéchol, tandis qu'une coloration bleuâtre dénote la présence de tanins de type pyrogallol.

Une réaction négative aux tests à la gélatine salée ou non, accompagnée d'une coloration verte pour le test au chlorure ferrique, indique la présence d'autres composés phénoliques au lieu des tanins.

2.2.6.2.4. Les anthraquinones (test de BORNSTRÄGER)

Un millilitre de solution aqueuse du résidu d'évaporation à sec est mélangé à 5ml de benzène. L'ensemble est placé dans une ampoule à décanter, puis agité énergiquement. Après décantation, la phase organique (phase supérieure) est recueillie et mélangée à 1 ml d'ammoniaque 25%. Le mélange est alors agité jusqu'à ce que la phase alcaline (phase inférieure) vire au rouge : cela indique la présence d'anthraquinones. Dans le cas contraire, le test est négatif.

2.2.6.2.5. Les désoxyoses (test de KELLER-KILIANI)

Dans un tube à essai, le résidu sec est redissous dans 1 ml de solution aqueuse de chlorure ferrique (FeCl₃) à 10% additionnée de 4 ml d'acide acétique glacial. Après une légère agitation, le mélange est additionné de 0,5 ml d'acide sulfurique (H₂SO₄) 36 N en inclinant le tube de 45°C.

L'apparition d'un anneau pourpre à l'interface indique la présence de désoxyoses.

2.2.6.2.6. Les irridoïdes

Le résidu sec est pris dans 1 ml d'eau distillée. Le mélange obtenu est agité, puis 0,5 ml de HCl 12N est ajouté. Le tout est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. La présence d'irridoïdes est marquée par l'apparition d'une coloration bleue, après refroidissement.

2.2.6.2.7. Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés

Le résidu sec est dissous dans 3 ml de chloroforme. Après l'avoir agité, le mélange est filtré puis distribué dans 3 tubes à essai dont le premier sert de témoin.

a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD

Deux gouttes d'anhydride acétique sont ajoutées dans le deuxième tube. Le mélange est légèrement agité, puis quelques gouttes de H₂SO₄ 36 N y sont ajoutées.

L'évolution de la coloration est observée pendant 1h. La coloration verdâtre dénote la présence des stéroïdes, tandis que l'apparition d'un anneau rouge ou violet indique la présence de triterpènes.

Les deux phénomènes peuvent être observés simultanément.

b) Test de SALKOWSKI

Un millilitre de H₂SO₄ 36 N est versé dans le troisième tube en l'inclinant.

L'apparition d'un anneau rouge au niveau de l'interface indique la présence de stérols insaturés.

2.2.6.2.8. Les saponines

Le résidu d'évaporation à sec de l'extrait à analyser est dissous dans 1 ml d'eau distillée. La solution aqueuse obtenue est soumise à une agitation énergique pendant 3 s. La présence de saponines se traduit par la formation d'une mousse de 3 cm de hauteur, qui persiste pendant 30 min.

3. RESULTATS

Des expériences préliminaires sur les feuilles de Pechia madagascariensis ont montré que les principes toxiques sont thermostables. Toutes les manipulations ont ainsi été réalisées à la température ambiante et toutes les opérations de concentration et d'évaporation de solvant se déroulent à +55°C.

3.1. EXTRACTION ET PURIFICATION DES PRINCIPES TOXIQUES

3.1.1. EXTRACTION

Quatre types d'extraits bruts ont été préparés à partir 15 g de poudre de feuilles et 150 ml de solvant (voir paragraphe 2.2.2, p. 9), et leur toxicité a été testée sur souris (voir méthode au paragraphe 2.2.1.1, p. 30).

Pour chaque extraction, le rendement est déterminé selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.4 (p.12).

3.1.1.1. Extraction aqueuse à froid

L'extrait brut aqueux à froid est préparé en mélangeant la poudre de feuilles et l'eau distillée selon le rapport 1/10 (P/V). Puis l'extraction se poursuit selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.1. (p. 9). Un extrait amer, de couleur orange foncé, d'aspect limpide et de pH 5,33 a été obtenu. Il est toxique sur souris.

3.1.1.2. Extraction hydroéthanolique à froid

L'extrait brut hydroéthanolique à froid est préparé en délayant la poudre de feuilles dans un mélange hydroéthanolique 75%. L'extraction est ensuite réalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.1. (p. 9). Un extrait amer, de couleur orange foncé, d'aspect limpide et de pH 5,24.a été obtenu. Il est toxique sur souris.

3.1.1.3. Extraction aqueuse à chaud

L'extrait brut aqueux à chaud est préparé à partir de la poudre de feuilles et d'eau distillée selon la méthode décrite dans le paragraphe 2.2.2.2. (p. 9). Un extrait amer, de couleur orange foncé, d'aspect limpide et de pH 5,36 a été obtenu. Il est toxique sur souris.

3.1.1.4. Extraction hydroéthanolique à chaud

L'extrait brut hydroéthanolique à chaud est préparé en mélangeant la poudre de feuilles et le mélange hydroéthanolique 75% selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.2.2. (p. 9).

Un extrait amer, de couleur orange foncé, d'aspect limpide et de pH 5,39 a été obtenu. Il est toxique sur souris.

Les résultats des différentes extractions sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 : Caractéristiques des différents extraits bruts préparés à partir de feuilles de Pechia madagascariensis

Extraction	Aqueuse à froid	Hydroéthanolique à froid	Aqueuse à chaud	Hydroéthanolique à chaud
Aspect	limpide	limpide	limpide	limpide
Couleur	orange foncé	orange foncé	orange foncé	orange foncé
pH	5,33	5,24	5,36	5,39
Goût	amer	amer	amer	amer
Toxicité*	4 min	2 min	3 min	3min
Rendement	2,01 %	8,68 %	2,71 %	6,36 %

*temps de survie des souris après administration par voie intrapéritonéale de l'extrait

Ces résultats montrent que tous les extraits sont toxiques sur souris. Cependant, nous avons adopté l'extraction hydroéthanolique à froid pour la suite de nos travaux car :

- il est le plus toxique du point de vue du temps de survie ;

- il donne le meilleur rendement.

3.1.2. PURIFICATION

A partir de l'extrait brut hydroéthanolique 75% (EB), plusieurs techniques de purification reposant essentiellement sur la différence de poids moléculaire et de solubilité ont été effectuées pour isoler les principes actifs. Cependant, certaines d'entre elles ont été écartées à cause de leur faible performance, voire même l'absence de toxicité des extraits obtenus sur souris. Néanmoins, elles seront citées car elles ont apporté des informations sur les propriétés physico-chimiques des principes toxiques.

La purification est bioguidée par des tests de toxicité sur souris (voir méthode au paragraphe 2.2.1.1, p. 29) et d'homogénéité sur CCM (voir méthode au paragraphe 2.2.6.1, p. 13).

3.1.2.1. Traitement par la chaleur

L'EB (15 ml) subit un traitement thermique selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.3.1. (p. 10). Le surnagent recueilli est limpide et de couleur orange foncé. Il est toxique sur souris. Cette technique constitue ainsi la première étape du procédé de purification. L'extrait obtenu s'appelle E1.

3.1.2.2. Dialyse

L'extrait E1 (15 ml) est dialysé contre 1 500 ml d'eau distillée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.3.2. (p. 10).

A la fin de la dialyse, le liquide à l'intérieur du boudin (adialysat) et celui à l'extérieur du boudin (dialysat) sont tous les deux concentrés jusqu'à un volume final de 15 ml.

Les tests sur souris révèlent que l'adialysat est non toxique tandis que le dialysat se révèle toxique. Ce dernier, de couleur jaune orange et d'aspect limpide, constitue l'extrait E2.

3.1.2.3. Traitement par l'acétate d'éthyle

L'extrait E2 (15 ml) est mélangé volume à volume avec l'acétate d'éthyle. Trois fractionnements sont effectués selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.3.3. (p. 11). La phase organique de couleur jaune clair est non toxique tandis que la phase aqueuse de couleur orange clair et d'aspect limpide, est toxique. Cette dernière constitue l'extrait E3 dans le protocole de purification.

3.1.2.4. Traitement par l'ANP

L'EB de volume 1,5 ml est soumis à un traitement par 0,1 ml d'ANP 20% et 0,1 ml de Na₂HPO₄ 10%, selon la méthode décrite au 2.2.3.4. (p. 12). Un surnagent limpide et incolore est obtenu. Cette étape n'a pas été retenue dans le procédé de purification car cet extrait n'est pas toxique sur souris. On en déduit que les principes toxiques sont précipités par l'ANP.

En résumé, le procédé d'extraction et de purification comprend : une extraction hydroéthanolique à froid, un traitement par la chaleur, une dialyse et enfin un traitement par l'acétate d'éthyle. Il est montré sur la figure 2 ci-dessous.

Fractionnement par l'acétate d'éthyle

Poudre de feuilles

15 g

Extrait brut (EB)

1,62 g

Surnageant E₁

1,27 g

Dialysat E₂

1,22 g

Phase aqueuse E₃

0,73 g

Extraction hydroéthanolique à froid

Précipitation par la chaleur

Dialyse

Précipité (écarté)

Adialysat (éliminé)

Phase organique (écartée)

Figure 2 : Schéma résumant le protocole d'extraction et de purification des principes toxiques des feuilles de Pechia madagascariensis

Les chiffres représentent les poids du résidu d'évaporation à sec des extraits.

3.2. RENDEMENT

A chaque étape de la purification les extraits sont évaporés à sec et les résidus d'évaporation à sec sont pesés. Ainsi, à partir de 15g de poudre de feuilles de la plante 1,62 g de résidu d'evaporation à sec de l'EB et 0,73 g de E3 ont été obtenus.

Selon la méthode de calcul décrite au paragraphe 2.2.4. (p. 12), le rendement de purification par rapport à l'EB est de 45,06%, et le rendement en toxines par rapport au matériel de départ est de 4,86 %.

3.3. DEGRE D'HOMOGENEITE DES EXTRAITS

L'évolution de l'homogénéité des différents extraits obtenus au cours de la purification a été suivie par CCM selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.5.1. (p. 13). Le solvant utilisé est le système (B/A/E 60/20/20 ; P/P/P). Le chromatogramme est révélé à l'aide du réactif à vanilline sulfurique après qu'on l'a observé sous lumière ultraviolette de longueurs d'onde ë = 254 nm et ë = 366 nm.

Le chromatogramme des différents extraits obtenus par les différentes étapes de purification après révélation par le réactif à vanilline sulfurique est présenté sur la figure 3 ci-dessous.

Figure 3 : Chromatographie dans le système B/A/E 60/20/20  (P/P/P) des différents extraits obtenus au cours de la purification des principes toxiques de feuilles de Pechia madagascariensis

Révélation au réactif à la vanilline sulfurique

Avec EB = Extrait brut hydroéthanolique à froid

E1 = Extrait E1 (surnagent du traitement par la chaleur)

E2 = Extrait E2 (dialysat)

E3 = Extrait E3 (phase aqueuse)

Ces résultats indiquent que l'EB comporte 8 bandes majeures alors que E3 n'en présente que 2. La purification a donc permis d'éliminer 6 bandes majeures.

3.4. CARACTERISATION CHIMIQUE

3.4.1. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES

L'application de diverses techniques d'extraction et de purification a permis de déterminer certaines propriétés physico-chimiques du (ou des) principe(s) toxique(s) de Pechia madagascariensis.

Ainsi :

- le résidu obtenu après évaporation à sec des différents extraits (EB, E1, E2, E3) se présente comme une poudre fine de couleur orange ;

- les principes actifs ont un goût amer ;

- ils résistent à des températures élevées ;

- ils sont solubles dans l'eau et l'ethanol ;

- ils sont insolubles dans l'acétate d'éthyle ;

- ils traversent la membrane de dialyse, par conséquent, leur poids moléculaire serait inférieur à 6000-8000 Da, seuil de filtration de la membrane ;

- ils sont précipitables par les sels de métaux lourds comme l'ANP ;

- leur toxicité n'est pas affectée par les opérations de congélation et de décongélation répétées.

3.4.2. NATURE CHIMIQUE

La nature chimique du (ou des) principe(s) toxique(s) a été cernée par criblage phytochimique de l'EB et de E3, selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.6.2 (p. 14). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 (p. 24).

Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique de l'extrait brut et de l'extrait E3

Famille chimique	Test	Résultats
		EB	E3
Alcaloïdes	MAYER	-	-
	WAGNER	+	-
	DRAGENDORFF	+	+
Flavonoïdes	WILSTATER	+	-
Leucoanthocyanes	BATE-SMITH	+	-
Tanins	Gélatine 1% Gélatine salée	-	-
Polyphénols	Chlorure ferrique	-	-
Stéroïdes	LIEBERMANN BURCHARD	+	+
Triterpènes		-	-
Désoxyoses	SALKOWSKI	-	-
Irridoïdes	HCl concentré à chaud	-	-
Saponines	Test de mousse	-	-

(-) : Test négatif (+) : Test positif 

Le criblage phytochimique montre que l'EB renferme des flavonoïdes, des leucoanthocyanes et de stéroïdes tandis que l'extrait E3 ne réagit positivement qu'aux tests des alcaloïdes et des stéroïdes.

Ces 2 extraits pourraient renfermer des alcaloïdes mais les tests de confirmation n'ont pas été réalisés faute de matériel végétal.

4. DISCUSSION ET CONCLUSION

L'étude chimique a permis de mettre en évidence la présence de principes toxiques dans les feuilles de Pechia madagascariensis.

Parmi les diverses techniques d'extraction testées, la méthode d'extraction hydroéthanolique à froid a été adoptée car elle permet d'avoir l'extrait brut limpide le plus toxique, avec le meilleur rendement de 8,68%.

A partir de l'extrait brut, différentes techniques de purification ont été effectuées mais nous avons retenu trois d'entre elles, à savoir dans l'ordre, le traitement par la chaleur, la dialyse et le fractionnement par l'acétate d'éthyle. Le protocole ainsi établi a permis d'obtenir un extrait partiellement purifié avec un rendement en toxines de 4,86% et un rendement de purification de 45,06%.

Du point de vue physico-chimique, les principes actifs sont des composés thermostables, solubles dans l'eau et l'éthanol et insolubles dans l'acétate d'éthyle. Ils sont également précipitables par des sels de métaux lourds comme l'ANP. Il se pourrait ainsi qu'ils présentent des groupements acides ou qu'ils soient de poids moléculaire élevé. Or, leur capacité à traverser la membrane à dialyse démontre qu'il s'agit de composés de poids moléculaire inférieur à 6 000-8 000 Da.

Les résultats du criblage phytochimique révèlent que le(s) principe(s) toxique(s) pourraient être des stéroïdes, car les flavonoïdes ou les leucoanthocyanes mis en évidence dans l'extrait brut ont été éliminés au cours de la purification.

La présence d'alcaloïdes devrait être confirmée par la vérification de la solubilité des précipités dans l'éthanol à 80% (DALTON, 1979). En effet, d'après la littérature, cette famille de plante est riche en alcaloïdes si nous ne citons que Cabucala cryptophella (BOITEAU, 1993), Cantharantus roseus (MARKGRAF, 1976) et Cabucala erythrocarpa (RAKOTO ANJANOROSOA, 2007).

DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE

1. INTRODUCTION

L'étude chimique a permis d'aboutir à partir des feuilles de Pechia madagascariensis, à un extrait partiellement purifié dénommé E3, toxique sur souris.

Dans cette deuxième partie, notre objectif est d'étudier les propriétés toxicologiques de l'extrait brut (EB) et de l'extrait purifié E3.

Ainsi, nous avons examiné :

- les symptômes d'intoxication ainsi que l'effet-dose chez la souris ;

- le pouvoir hémolytique sur les hématies de mouton ;

- les effets sur les animaux à sang froid, notamment les larves de moustique, les alevins de poisson et les têtards de grenouille ;

- les effets sur la germination de graines de Monocotylédones et de Dicotylédones, sur la croissance des jeunes plantules et celle des bourgeons axillaires ;

- les effets sur la croissance de microorganismes.

L'EB est utilisé pour les expériences nécessitant une quantité importante d'extrait toxique, l'extrait partiellement purifié E3 n'étant disponible qu'en petite quantité.

2. MATERIELS ET METHODES

2.1. MATERIELS

2.1.1. LES ANIMAUX D'EXPERIMENTATION

2.1.1.1. Les souris

Des souris blanches (Mus musculus) mâles de poids 25 #177; 2g sont utilisées pour les différents tests. Elles sont issues de la souche « TANA-SWISS » stabilisée depuis plusieurs années à l'Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Elles ont été élevées à l'animalerie du laboratoire de Biochimie fondamentale et appliquée, de la Faculté des sciences.

2.1.1.2. Le sang de mouton

Pour le test hémolytique, du sang de mouton sain défibriné provenant de l'Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires d'Ampandrianomby (IMVAVET) est utilisé.

2.1.1.3. Les têtards de grenouille

Les têtards de grenouille (Ptychadena mascareniensis) utilisées proviennent des rizières situées aux alentours du campus de l'Université d'Antananarivo (Ankatso).

Dans cette étude, nous avons utilisé des têtards âgés d'une à deux semaines. Ils ont été capturés le jour même du test.

2.1.1.4. Les alevins de poisson

Les alevins de carpe (Cyprius carpio) âgés de deux mois ont été fournis par le ministère de l'Agriculture, de l'élevage et de la pêche sis à Ampandrianomby. Les tests sont effectués après quelques jours d'adaptation dans un aquarium bien aéré.

2.1.1.5. Les larves de moustique

Les larves de moustique utilisées ont été capturées le jour du test dans les eaux stagnantes situées aux alentours du campus de l'Université d'Antananarivo (Ankatso). Elles sont au stade trois avancé de développement.

2.1.2. LES VEGETAUX D'EXPERIMENTATION

Les échantillons de plantes utilisés sont des graines séchées, bien conservées dans un emballage en plastique et mises en vente par AGRIVET, Antananarivo. Les informations concernant ces plantes sont présentées dans le tableau 3 (p. 28).

Tableau 3 : Les plantes utilisées dans les expérimentations

Classe	Nom usuel	Famille	Nom scientifique
DICOTYLEDONES	Laitue	ASTERACEAE	Lactuca sativa
	Tissam	BRASSICACEAE	Brassica sp
	Concombre	CUCURBITACEAE	Cucumis sp
	Courgette		Cucurbita pepo
	Tomate	SOLANACEAE	Lycopersicum esculentum
	Carotte	APIACEAE	Daucus carotta
	Haricot	FABACEAE	Pisum sativum
	Petit pois		Phaseolus vulgaris
MONOCOTYLEDONES	Maïs	POACEAE	Zea maÿs
	Riz		Oryza sativa

2.1.3. LES MATERIELS DE MICROBIOLOGIE

2.1.3.1. Les microorganismes utilisés

Les germes utilisés pour les tests d'activité antimicrobienne des extraits étaient déjà disponibles au laboratoire de Microbiologie du département de Biochimie fondamentale et appliquée. Il s'agit d'Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Vibrio fischeri et Vibrio harveyi. Leurs caractéristiques sont données plus loin (voir paragraphe 3.3.1 p. 53).

2.1.3.2. Les milieux utilisés

Des milieux de qualité pour analyse et de marque LIOFILCHEM sont utilisés :

- le milieu de MUELLER HINTON : un milieu solide utilisé pour l'étude de l'activité antimicrobienne des extraits ;

- le milieu MARINE AGAR : un milieu solide servant à l'isolement, la culture et la numération des bactéries marines hétérotrophes comme Vibrio harveyi et Vibrio fischeri.

- le milieu ZOBELL : un milieu liquide permettant le développement des vibrions.

Les compositions de ces milieux sont données en ANNEXE III.

2.1.3.3. Les disques pour les tests d'antibiogramme

Les disques utilisés pour les tests d'activité en milieu solide sont des disques de papier stériles de 6 mm de diamètre. Ils sont fournis par BIOMERIEUX.

2.2. METHODES

2.2.1. METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD

2.2.1.1. Test sur souris

2.2.1.1.1. Estimation de la toxicité aiguë

La toxicité des différents extraits est estimée par injection par voie intrapéritonéale (ip) de ceux-ci, à raison de 0,3 ml pour 25 g de souris. Pour chaque test, un lot de trois souris de 25 g #177; 2 g est utilisé. Un autre lot de trois souris de même poids, recevant 0,3 ml d'eau physiologique sert de témoin.

2.2.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)

La dose létale 50% (24 h) ou dose qui tue 50% des animaux testés pendant 24 h, est estimée par la méthode de REED et MUENCH (1938). Par cette méthode, la valeur de la DL50 (24 h) est calculée de deux façons :

- Soit par la formule suivante :

log DL50 = log B +	(0,5 - N)	log R
	(M - N)

Avec : B = dose immédiatement inférieure à la DL50

N = mortalité provoquée par la dose B

M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50

R = raison de la progression géométrique

- Soit par la méthode graphique qui consiste à projeter le point d'intersection de la courbe des totaux cumulatifs des survivants et celle des morts, en fonction des doses injectées.

Six doses en progression géométrique de l'extrait à étudier sont injectées à six lots de cinq souris de même sexe de 25 #177; 2g. Ces doses se situent entre la plus faible dose entraînant la mort de 100% des animaux testés (DL100) et la dose la plus élevée provoquant 0% de mortalité (DL0). L'extrait à tester est administré par voie ip à raison de 0,3 ml pour 25g de poids de souris. Les souris sont laissées à jeun 24h avant le test.

2.2.1.2. Test hémolytique

2.2.1.2.1. Principe

En présence d'une substance hémolytique, les hématies sont lysées, libérant ainsi l'hémoglobine, et rendant le surnageant rouge. Les hématies qui restent intactes sédimentent.

2.2.1.2.2. Mode opératoire

Une suspension de sang de mouton est utilisée pour le test. Pour la préparer, le sang est mélangé volume à volume avec du sérum physiologique. Le mélange est ensuite centrifugé à 3 000 tours/min pendant 5 min (JOUAN, T52). Le surnageant est écarté tandis que le culot est récupéré. Cette opération de lavage est répétée 3 fois. Le culot obtenu au troisième lavage constitue les hématies à 100%.

Le culot est mélangé volume à volume avec du sérum physiologique, donnant ainsi une suspension d'hématies à 50%. A 0,2 ml de cette dernière sont ajoutés 4,8 ml de tampon PBS (Phosphate buffered saline) pour obtenir une suspension à 2%.

La composition du PBS est donnée en ANNEXE IV.

La suspension d'hématies à 2% est répartie dans les puits d'une microplaque à cupules à fond en «V», à raison de 50 ul par puits. Une dilution en cascade de demi en demi de l'extrait à tester avec du PBS, est ensuite effectuée à partir du premier puits.

Deux témoins sont nécessaires pour le test :

- un témoin positif (T+) composé de 50 ul de suspension d'hématies à 2% et 50 ul d'eau distillée : une hémolyse des hématies est observée ;

- un témoin négatif (T-) composé de 50 ul de suspension d'hématies à 2% et 50 ul de PBS : aucune hémolyse n'apparaît.

La composition des différents milieux pour le test hémolytique est présentée dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4 : Composition des différents milieux pour le test hémolytique

Puit n°	T+	T-	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Extrait à tester à 1 mg/ml (ul)	0	0	50	25	12,5	6,25	3,12	1,56	0,78	0,39	0,20	0,097
PBS (ul)	0	50	0	25	37,5	43,75	46,87	48,44	49,22	49,61	49,80	49,90
Suspension d'hématies à 2% (ul)	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
Eau distillée (ul)	50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Concentration finale (mg/ml)	0	0	1	0,5	0,25	0,125	0,065	0,031	0,015	0,007	0,003	0,001
Volume final du mélange (ul)	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100

Il est à noter que chaque test se fait en double.

Après une légère agitation, la microplaque est incubée à 37°C pendant 3 h, puis laissée à +4°C pendant une nuit pour arrêter la réaction.

La lecture des résultats se fait à l'oeil nu, par comparaison avec les témoins positif et négatif, c'est-à-dire :

- le test est positif si le contenu du puits est coloré en rouge ;

- le test est négatif quand il se forme un culot au fond du puits ;

- une hémolyse partielle est notée lorsque le liquide du surnagent se colore en rouge et un culot d'hématies se forme au fond du puits.

2.2.2. METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID

2.2.2.1. Principe

La méthode consiste à observer les réactions des animaux aquatiques quand l'extrait à étudier est introduit dans leur milieu.

2.2.2.2. Mode opératoire

Des lots d'animaux à tester sont sélectionnés puis placés dans des cristallisoirs contenant 100 ml d'eau de pluie. L'extrait à étudier y est ensuite ajouté de manière à avoir différentes concentrations en progression géométrique de raison r. Ces concentrations sont comprises entre la CL0 (concentration la plus élevée tolérée par les animaux) et la CL100 (concentration la plus faible qui tue 100% des animaux testés).

La concentration létale 50% (24h) ou CL50 (24h) (concentration qui provoque la mort de 50% des animaux testés en 24 h), est déterminée par la méthode graphique utilisant la régression linéaire de la relation :

% de mortalité = f (log C)

avec C = concentration en mg/ml

L'équation de la droite de régression est de la forme :

Y= A+BX

avec : Y = pourcentage (%) de mortalité

A = constante

B = coefficient de régression

X = logarithme décimal de la concentration (log C)

2.2.2.2.1. Test sur les têtards de grenouille

Six concentrations différentes de l'extrait à étudier sont testées sur six lots de cinq têtards de grenouille âgés d'une à deux semaines.

2.2.2.2.2. Test sur les alevins de poisson

Six lots de cinq alevins de carpe âgés de deux mois sont testés avec six concentrations différentes de l'extrait.

2.2.2.2.3. Test sur les larves de moustique (OMS 1970)

Cinq lots de dix larves de moustique au stade 3 de développement sont utilisés pour ce test. Ces larves sont prélevées au moyen d'un tamis puis placées dans des cristallisoirs contenant 100 ml d'eau de pluie. L'extrait à étudier est ensuite ajouté de manière à avoir différentes concentrations. Un autre lot placé dans 100 ml d'eau de pluie en absence d'extrait à étudier sert de témoin.

Le calcul du pourcentage de mortalité pour chaque concentration se fait en additionnant le nombre de larves moribondes et de larves mortes au bout de 24 h.

Les larves sont qualifiées de :

- moribondes, lorsqu'elles sont incapables de plonger ou d'atteindre la surface quand on agite légèrement l'eau ;

- mortes, quand touchées par une aiguille dans la région cervicale, elles ne bougent plus.

2.2.3. METHODES D'ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX

(MAYER et POLJAKOFF-MAYBER, 1963; DAVID, 1952 ; HELLER et coll., 1995)

2.2.3.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines

Pour chaque espèce étudiée (voir paragraphe 2.1.2, p. 28), les graines groupées en deux lots de dix sont trempées dans de l'eau de robinet pendant 48 h à l'obscurité et à 30°C. Après le trempage, un des lots de 10 graines de chaque espèce est mis à germer dans une boite de Petri contenant du coton imbibé d'extrait à tester de concentration déterminée, le deuxième lot de 10 graines est mis à germer sur du coton imbibé d'eau. Les graines ayant germé sont comptées 72 h après l'incubation.

2.2.3.2. Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules

L'expérience est effectuée sur des graines d'une Monocotylédone et d'une Dicotylédone. Neuf lots de dix graines de chaque plante sont utilisés pour cette expérience. Deux d'entre eux sont trempés dans l'extrait à tester à une concentration déterminée puis placés à l'obscurité à 30°C pendant 48 h. Les sept autres sont trempés dans l'eau de robinet et placés ensuite dans les mêmes conditions que précédemment.

Après lavage à l'eau de javel 10 %, puis à l'eau de robinet, l'un des deux lots trempés dans l'extrait à étudier est mis à germer sur du coton imprégné d'eau de robinet, tandis que le deuxième lot est placé sur du coton arrosé avec le même extrait.

Six sur les sept lots trempés dans de l'eau de robinet sont transférés sur du coton et sont arrosés avec l'extrait à étudier à six concentrations différentes croissantes. Le septième lot, servant de témoin, est arrosé avec de l'eau.

La longueur des hypocotyles et des épicotyles est mesurée tous les deux jours pendant environ deux semaines pour apprécier l'effet de l'extrait à étudier sur la croissance des jeunes plantules.

2.2.3.3. Etude des effets sur les bourgeons axillaires

L'effet de l'extrait à étudier sur le développement des bourgeons axillaires est apprécié par comparaison à celui de deux hormones végétales : l'auxine et la gibbérelline. La gibbérelline est une hormone stimulatrice de la croissance du bourgeon axillaire tandis que l'auxine, participant surtout au phénomène de dominance apicale, ne favorise pas cette croissance.

Un lot de cinq jeunes plantules de petit pois âgées de sept jours est utilisé. Il est obtenu après trempage à l'obscurité, germination, et croissance des graines en présence d'eau de robinet. Les jeunes plantules sont ensuite décapitées au-dessus du deuxième bourgeon axillaire. Chaque solution à étudier de volume 1 ul, est mélangée avec de la lanoline. Le mélange est ensuite déposé sur la partie sectionnée. Ainsi :

- sur la première et la deuxième plantule sont déposés 50 ug d'extrait à étudier ;

- la troisième plantule reçoit 50 ug de gibbérelline ;

- la quatrième plantule reçoit 50 ug d'auxine ;

- la dernière plantule, servant de témoin, reçoit 1 ul d'eau distillée.

Il est à noter que l'expérience est réalisée en double.

Les plantules sont arrosées quotidiennement avec de l'eau. Les résultats sont notés en mesurant la longueur des bourgeons axillaires tous les deux jours pendant deux semaines.

2.2.4. METHODES D'ÉTUDE DES EFFETS SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES

2.2.4.1 Techniques de stérilisation

Il est nécessaire de stériliser les matériels pour éviter toute contamination. Pour cela toute la verrerie, les milieux de culture, l'eau physiologique et les disques pour antibiogramme doivent être stérilisés à l'autoclave à 121°C pendant 40 min. Les mains et les paillasses doivent être nettoyées avec de l'alcool 70°C et toutes les manipulations doivent se dérouler près de la flamme d'un bec Bunsen.

2.2.4.2. Méthodes d'identification des germes

(LE MINOR et VERON, 1989 1992 ; MARCHAL, 1992 ; SINGLETON, 1994)

Coloration Gram :

a) Principe

Cette technique est basée sur l'affinité de la paroi bactérienne pour certains colorants. En effet, le colorant cristal violet, une fois lié à la paroi cellulaire des bactéries forme, après action de l'iode, un complexe « colorant-iode ». On distingue alors les bactéries Gram positif (+) des bactéries Gram négatif (-). Pour les bactéries Gram (+), les décolorants comme l'alcool ou l'acétone ne sont pas capables de dissoudre ni d'éliminer le complexe « colorant-iode » et la cellule garde une coloration violette. Par contre, pour les bactéries Gram (-), le complexe «  colorant-iode » est dissous et la cellule bactérienne est colorée en rose par la safranine.

b) Mode opératoire

Une partie d'une colonie de germe à étudier est prélevée à l'aide d'une anse de platine et mise en suspension dans 3 gouttes d'eau distillée. Le mélange ainsi obtenu est déposé sur une lame bien propre de manière à obtenir un frottis. Celui-ci est séché au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen, puis fixé par trois passages sur la flamme.

Le frottis est ensuite coloré successivement par du cristal violet pendant 1 min. Après lavage rapide avec de l'eau, la lame est recouverte par une solution de lugol-PVP (Polyvinylpyrrolidone) pendant 60 s puis décolorée avec de l'alcool pendant environ 30 à 50s. La préparation est ensuite rincée à l'eau puis séchée.

La lame est recolorée avec la safranine pendant 10 à 20 s, puis rincée. Elle est ensuite séchée entre deux feuilles de papier filtre, puis recouverte de deux gouttes d'huile à immersion pour l'observation au microscope optique (OLYMPUS, CH 20) au fort grossissement (G x 100). Les bactéries Gram (+) sont colorées en violet et les bactéries Gram (-) sont colorées en rose.

2.2.4.3. Méthodes d'étude de l'activité antimicrobienne

La détermination de l'activité antimicrobienne d'une substance est effectuée par la méthode de diffusion en milieu solide ou méthode des disques.

a) Principe

L'activité est déterminée par mesure du diamètre de la zone d'inhibition (halo ou auréole d'inhibition) de la croissance microbienne qui apparaît autour d'un disque imprégné d'une substance active.

b) Test d'activité antimicrobienne

Le test comprend quatre étapes :

Première étape : Afin de s'assurer de leur pureté, les souches conservées dans les conditions du laboratoire sont repiquées en boîte de Petri sur le milieu gélosé adéquat, à savoir le milieu de MUELLER HINTON pour Escherichia coli, Salmonella typhi et Staphylococcus aureus, et le milieu MARINE AGAR pour Vibrio harveyi et Vibrio fischeri.

Deuxième étape : La pureté des souches étant vérifiée par l'obtention de colonies homogènes, une ansée de colonie est mise en suspension dans 10 ml d'eau physiologique stérile. Une dilution appropriée est effectuée jusqu'à l'obtention d'une densité optique (DO) égale à 0,125, équivalent à 10⁶ germes/ml.

Selon la technique d'inondation, la suspension bactérienne est ensemencée dans des boîtes de Petri contenant le milieu approprié pour chaque germe (voir plus haut). Les boîtes ensemencées sont laissées quelques minutes sur la paillasse pour que les bactéries se fixent à la surface du milieu de culture, puis l'excès de suspension est aspiré à l'aide d'une pipette stérile.

Troisième étape : Les disques de papier filtre stériles sont déposés sur les milieux ensemencés à l'aide d'une pince fine stérile. L'extrait à étudier de concentration bien déterminée et préalablement filtré sur un filtre MILLIPORE est déposé sur les disques d'antibiogramme.

Les boîtes de Petri sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 h pour Escherichia coli, Salmonella typhi et Staphylococcus aureus et à 25°C pendant 48 h pour Vibrio harveyi et Vibrio fischeri.

Quatrième étape : Les diamètres des halos d'inhibition sont mesurés et les résultats sont lus selon les normes préconisées par l'IPM. Ces normes sont présentées dans le tableau 5 ci-dessous.

Tableau 5 : Normes utilisées pour l'expression des résultats des tests d'activité antimicrobienne

Diamètre du halo (x)	Degré de sensibilité des germes	Expression des résultats
6mm < x < 7mm	Insensible	-
7mm = x = 8mm	Assez sensible	+
8mm < x = 9mm	Sensible	++
x > 9mm	Très sensible	+++

x : diamètre du halo d'inhibition

2.2.4.4. Détermination de la CMI

La CMI (concentration minimale inhibitrice) est la plus faible concentration d'extrait à étudier qui inhibe la croissance bactérienne.

Elle est déterminée en milieu solide selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.4.3. (p. 36) en utilisant plusieurs concentrations de l'extrait à tester. Ces dernières sont préparées par dilution en cascade après filtration sur filtre MILLIPORE.

La CMI correspond à la plus faible concentration de cet extrait, pour laquelle on observe un halo d'inhibition de diamètre supérieur ou égal à 7 mm.

3. RESULTATS

L'extrait brut (EB) disponible en grande quantité est utilisé pour toutes les expériences tandis que l'extrait E3 a été testé uniquement sur les hématies et la croissance des bourgeons axillaires.

3.1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX

3.1.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD

3.1.1.1. Effets sur les souris

Une dose de 186 mg/kg de l'extrait brut injecté par voie ip provoque chez la souris quelques symptômes conduisant rapidement à leur mort. Ainsi, juste après l'injection, une contorsion abdominale est observée, puis 2 min après, une convulsion clonique très sévère apparaît et la mort survient 3 min après l'injection.

L'administration de la dose sub-létale de 96 mg/kg provoque également une contorsion abdominale juste après l'injection, mais 10 min après, les souris redeviennent progressivement normales.

3.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)

La valeur de la DL50 (24 h) est déterminée selon la méthode de REED et MUENCH décrite au paragraphe 2.2.1.1.2 (p. 31). Six doses en progression géométrique de raison r égale à 1,14, allant de la DL0 = 96 mg/kg à la DL100 = 186 mg/kg sont employées.

Les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 6 (p. 39).

Tableau 6 : Résultats de la détermination de la DL50

Dose (mg/kg)	Nombre de décès après						Nombre de souris		Taux de mortalité (%)
	3 h	6 h	12 h	18 h	21 h	24 h	mortes	vivantes
96	0	0	0	0	0	0	0	5	0
110	0	0	1	0	0	0	1	4	20
125	3	0	0	0	0	0	3	2	60
142	3	0	0	0	0	0	3	2	60
163	4	0	0	0	0	0	4	1	80
186	5	0	0	0	0	0	5	0	100

En appliquant la formule de REED et MUENCH, on a :

log DL50 = log 110 +	0,5 - 0,2	log 1,14
	0,6-0,2

La DL50 (24 h) de l'EB administré par voie ip sur souris est ainsi évaluée à 120,78mg/kg.

Les résultats utilisés pour déterminer de la DL50 (24 h) par la méthode graphique sont présentés dans le tableau 7 ci-dessous.

Tableau 7 : Valeurs utilisées pour la détermination de la DL50 (24 h) par la méthode graphique

Doses (mg/kg)	Nombres de souris testées	Nombre de survivantes	Nombre de mortes	Totaux cumulatifs des survivantes	Totaux cumulatifs des mortes
96	5	5	0	14	0
110	5	4	1	9	1
125	5	2	3	5	4
142	5	2	3	3	7
163	5	1	4	1	11
186	5	0	5	0	16

Figure 4 : Détermination graphique de la DL50 24 h

Avec TCS : totaux cumulatifs des survivantes

TCM : totaux cumulatifs des mortes

Par cette méthode graphique, la valeur de la DL50 (24 h) de EB est estimée à 128,5mg/kg.

3.1.1.3. Effets sur les hématies de mouton

Les effets de l'EB et de E3 ont été testés sur des suspensions d'hématies à 2% selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.1.2 (p. 31).

Les résultats sont présentés sur la figure 5 et dans le tableau 8 ci-dessous.

1

0,5

0,25

0,125

0,062

0,031

0,015

0, 007

0,003

0,001

T+

T-

H+

H-

H P

EB

E3

Concentration d'extrait en mg/ml

Figure 5 : Test hémolytique de l'extrait brut et de E3 sur les hématies de mouton

Avec : EB = Extrait brut		T+= témoin positif
E3 = Extrait E3		T-= témoin négatif
H^+= Hémolyse totale	HP= Hémolyse partielle	H-=Aucune hémolyse

Tableau 8 : Effets de l'extrait brut et de E3 à différentes concentrations sur les hématies de mouton

Concentration (mg/ml)	1	0,5	0,25	0,125	0,062	0,031	0,015	0,007	0,003	0,001
EB	++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
E3	++	++	+	+	-	-	-	-	-	-

++ : Hémolyse totale + : Hémolyse partielle - : Absence d'hémolyse

Ces résultats indiquent que l'activité hémolytique des extraits EB et E3 varie en fonction de leur concentration. Ainsi :

- une hémolyse totale des hématies est observée à partir des concentrations supérieures ou égales à 0,5 mg/ml pour l'EB et E3 ;

- une hémolyse partielle a lieu à des concentrations allant de 0,25 à 0,125 mg/ml, aussi bien pour l'EB que E3 ;

- enfin, à des concentrations inférieures ou égales à 0,062 mg/ml, ni l'EB ni E3 ne possèdent d'activité hémolytique.

3.1.2. EFFETS DE L'EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID

La méthode utilisée pour estimer les effets de l'EB sur les animaux à sang froid (têtards de grenouille, alevins de poisson, et larves de moustique) est celle décrite au paragraphe 2.2.2 (p. 32).

3.1.2.1. Effets sur les têtards de grenouille

Six concentrations de l'EB en progression géométrique allant de 0,68 mg/ml à 1,2mg/ml de raison r égale à 1,12 sont testées sur 6 lots de 5 têtards de grenouille. Les résultats sont présentés dans le tableau 9 (p. 42).

Tableau 9 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les têtards de grenouille

Concentration C de l'EB (mg/ml)	log C	Nombre de têtards testés	Nombre de têtards		Taux de mortalité (%)
			morts	survivants
0,68	-0,167	5	0	5	0
0,75	-0,124	5	1	4	20
0,85	-0,070	5	3	2	60
0,95	-0,022	5	3	2	60
1,07	0,029	5	4	1	80
1,2	0,079	5	5	0	100

Ces résultats indiquent que l'EB est toxique sur les têtards de grenouille et cette toxicité est proportionnelle à la concentration de l'extrait testé.

L'équation de la droite de régression linéaire est de la forme : Y = 71,27+391,53 X avec un coefficient de corrélation r égale à 0,76.

D'après cette équation la CL50 (24 h) est estimée à 0,88 mg/ml.

3.1.2.2. Effets sur les alevins de poisson

Six lots de 5 alevins de carpe (Cyprius carpio) sont testés avec 6 concentrations différentes de l'EB en progression géométrique de raison r égale 1,14, allant de 0,30 mg/ml à 0,6 mg/ml. Les résultats sont présentés dans le tableau 10 (p. 43).

Tableau 10 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les alevins de poisson

Concentration C de l'EB (mg/ml)	log C	Nombre d'alevins testés	Nombre d'alevins		Taux de mortalité (%)
			morts	survivants
0,30	-0,522	5	0	5	0
0,35	-0,455	5	1	4	20
0,40	-0,397	5	2	3	40
0,45	-0,346	5	4	1	80
0,52	-0,283	5	4	1	80
0,60	-0,221	5	5	0	100

Ces résultats indiquent que l'EB est aussi toxique sur les alevins de poisson. La toxicité est proportionnelle avec la concentration utilisée, d'où on parle d'effet-dose.

L'équation de la droite de régression linéaire est de la forme : Y= 181,39+345,48 X avec un coefficient de corrélation de 0,97.

D'où la CL50 (24 h) est estimée à 0,41 mg/ml.

3.1.2.3. Effets sur les larves de moustique

Six concentrations de EB en progression géométrique de raison 1,14, allant de 0,25 à 0,5 mg/ml sont employées sur sept lots de cinq larves de moustique. Les résultats du test sont résumés sur le tableau 11 (p. 44).

Tableau 11 : Effets de l'extrait brut à différentes concentrations sur les larves de moustique

Concentration C de l'EB (mg/ml)	log C	Nombre de larves testées	Nombre de larves		Taux de mortalité (%)
			mortes	survivantes
0,25	-0,602	5	0	5	0
0,29	-0,537	5	1	4	20
0,33	-0,481	5	3	2	60
0, 38	-0,420	5	3	2	60
0,43	-0,366	5	4	1	80
0,5	-0,301	5	5	0	100

Ces résultats indiquent que l'EB est toxique sur les larves de moustique. En outre, on observe un effet-dose.

L'équation de la droite de régression linéaire est : Y= 200,79+326,84 X avec un coefficient de corrélation de 0,97.

D'après cette équation la valeur de la CL 50 (24 h) est évaluée 0,34 mg/ml.

3.2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX

Les effets des extraits sur les végétaux sont étudiés sur le pouvoir germinatif des graines, la croissance des jeunes plantules et le développement des bourgeons axillaires, utilisant l'EB et E3.

3.2.1. EFFETS DE L'EXTRAIT BRUT SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES

Une dose unique de 1 mg/ml de l'EB est testée sur des graines de différentes espèces végétales qui ont été préalablement trempées dans de l'eau de robinet et transférées sur du coton.

L'expérience est réalisée selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.3.1. (p. 33)

Les résultats sont consignés dans le tableau 12 (p. 45).

Tableau 12 : Effets de l'extrait brut à 1mg/ml sur le pouvoir germinatif des différentes graines

Classe	Famille	Nom usuel	Nom scientifique	Taux de germination	Taux d'inhibition
DICOTYLEDONES	ASTERACEAE	Laitue	Lactuca sativa	80	20
	BRASSICACEAE	Tissam	Brassica sp	60	40
	CUCURBITACEAE	Concombre	Cucumis sp	80	20
		Courgette	Cucurbita pepo	100	0
	SOLANACEAE	Tomate	Lycopersicum esculentum	60	40
	APIACEAE	Carotte	Daucus carotta	20	80
	FABACEAE	Haricot	Pisum sativum	100	0
		Petit pois	Phaseolus vulgaris	100	0
MONOCOTY- LEDONES	POACEAE	Maïs	Zea maÿs	30	70
		Riz	Oryza sativa	50	50

Ces résultats indiquent qu'à la concentration de 1 mg/ml, l'EB affecte différemment la germination des diverses graines. En effet, celles de haricot, de courgette, et de petit pois s'avèrent insensibles à l'EB car elles présentent un taux de germination de 100 %. Par contre, les autres graines présentent un taux d'inhibition variable, allant de 20 % pour la laitue et le concombre, à 80 % pour la carotte.

3.2.1.1. Effets de l'extrait brut sur la croissance des jeunes plantules

Nous avons utilisé un représentant des Dicotylédones (petit pois) et un représentant des Monocotylédones (riz) pour évaluer les effets de l'EB à différentes concentrations sur la croissance des jeunes plantules. Selon les résultats des tests sur le pouvoir germinatif des graines, le petit pois et le riz sont respectivement insensible et peu sensible à l'EB à la concentration de 1 mg/ml. Les effets de l'EB à des doses plus élevées ont été étudiés sur la croissance de jeunes plantules de ces deux espèces, selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.3.2 (p. 34).

Neuf lots de 10 graines de chaque espèce sont utilisés. Deux lots sont trempés dans l'EB de concentration 12,5 mg/ml et les 7 autres sont trempés dans de l'eau de robinet. Parmi ces derniers, 6 sont mis à germer en présence de l'EB à différentes concentrations, allant de 0,39 mg/ml à 12,5 mg/ml. Le septième lot qui va servir de témoin est mis en présence d'eau de robinet.

L'expérience est récapitulée sur la figure 6 ci-dessous.

Figure 6 : Schéma résumant les différentes étapes de l'expérience sur la croissance des jeunes plantules

3.2.1.1.1. Croissance de l'épicotyle et de l'hypocotyle en fonction des conditions de trempage

Les figures 7 (p. 47) et 8 (p. 48) illustrent la croissance respective de l'épicotyle et de l'hypocotyle des jeunes plantules de riz en fonction des conditions de trempage, et les figures 9 (p. 48) et 10 (p. 49) illustrent celle des plantules de petit pois.

Pour le riz, par rapport au témoin (lot trempé dans l'eau et arrosé avec de l'eau ou E-E), les autres lots présentent une inhibition de la croissance de l'épicotyle et celle de l'hypocotyle avec un effet très marqué pour ceux arrosés avec l'EB de concentration 12,5mg/ml (EB-EB et E-EB).

Pour le petit pois, comparé au lot témoin, le trempage dans l'EB à 12,5 mg/ml suivi de l'arrosage avec de l'eau stimule la croissance de l'épicotyle et de l'hypocotyle. Par contre, l'arrosage avec l'EB des lots trempés dans l'eau et dans l'EB inhibe fortement cette croissance.

Figure 7 : Croissance de l'épicotyle de riz en fonction des conditions de trempage

E-E : Lot trempé dans de l'eau de robinet puis arrosé avec de l'eau

EB-E : Lot trempé dans de l'extrait brut à 12,5 mg/ml puis arrosé avec de l'eau

EB-EB : Lot trempé dans de l'extrait brut à 12,5 mg/ml puis arrosé avec le même extrait

E-EB : Lot trempé dans de l'eau de robinet puis arrosé avec l'extrait brut à 12,5 mg/ml

Figure 8 : Croissance de l'hypocotyle de riz en fonction des conditions de trempage