Memoire Online - Induction de la réaction de défense chez les plantes pour lutter contre les maladies

La plante, comme tout organisme vivant, est influencée durant toute sa vie par les conditions climatiques et édaphiques du milieu. Ces conditions, vont lui assurer soit un environnement favorable à la croissance et au développement, soit la soumettre à des facteurs de stress abiotiques ou biotiques qui vont perturber son métabolisme et provoquer des anomalies.

Les stress de type biotiques sont dus à l'interaction de la plante avec d'autres organismes comme les champignons, les nématodes, les bactéries, les virus et les viroïdes. Ces pathogènes en infectant les végétaux et particulièrement les cultures maraîchères vont affecter la croissance et le rendement et peuvent être à l'origine de leur mort.

Les méthodes de lutte culturales et chimiques classiques contre ces pathogènes présentent des limites. En fait, l'utilisation massive de pesticides s'avère toxique non seulement pour les pathogènes, les plantes mais aussi les consommateurs. De plus, le contrôle de certains pathogènes comme les virus est impossible chimiquement car ils sont incurables. C'est pourquoi des nouvelles stratégies de lutte essentiellement contre les phytovirus visent actuellement soit à créer des nouvelles plantes génétiquement résistantes, soit à induire les mécanismes de défenses chez les plantes et ceci en utilisant des produits qui sont responsables de l'induction de la réaction de défense. Ces derniers ont été utilisés avec succès pour le contrôle des maladies fongiques.

Dans le présent travail, une caractérisation de l'action de certains produits à base biologiques supposé avoir une action inductrice de la réaction de défense, a été effectuée afin de voir leur effet sur les maladies virales de la pomme de terre et particulièrement le virus Y. Cette caractérisation a été réalisée grâce à un ensemble de tests de fongitoxicité et de pathogénicité sur des champignons phytopathogènes à savoir Botrytis cinerea, Fusarium oxysprum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium oxysprum f.sp melonis, Fusarium solani et Verticillium albo

Chapitre 1 :

Les phytovirus sont des virus qui s'attaquent aux organismes végétaux. Il s'agit de macromolécules infectieuses porteuses d'information génétique, parasites obligatoires des cellules vivantes d'une plante hôte. Ces molécules pathogènes sont multipliées par les cellules végétales contaminées en provoquant généralement des perturbations métaboliques

conduisant à l'expression de symptômes qui sont dans certains cas masqués (Kummert et Semal, 1996).

Ces virus sont en fait des structures très simple, formés d'un acide nucléique qui peut être soit un ARN soit un ADN, simple brin ou double brin protégé par une carapace constituée de protéines de capside (Astier et al., 2001).

Chez quelques phytovirus, cette capside peut contenir en outre des molécules d'une enzyme capable d'assurer la transcription de l'acide ribonucléique viral (ARN polymérase virale), tandis que dans de rares cas, elle est entourée d'une enveloppe lipidique (figure 1) (Kummert et Semal, 1996).

Les phytovirus, comme tous les êtres vivants, possèdent la capacité de répliquer leur propre patrimoine génétique, mais cette réplication dépend de la nature de leur génome (Casselyn, 2002).

Généralement, le virus infectant pénètre dans la cellule par effraction. La nucléoprotéine virale appelé virion est désassemblé et libère son ARN génomique (ARNg). L'ARN polymérase virale est directement traduite à partir de l'ARNg. En fait, cette enzyme transcrit des ARN messagers (ARNm), dont celui de la protéine de capside, et synthétise de nouveaux ARNg. Ces derniers seront ensuite encapsidés, et les virions ainsi formés vont infecter d'autres cellules par passage trans-cellulaire et transport à longue distance, et éventuellement d'autres plantes (figure 2) (Kahn, 1996).

Les virus des plantes disposent de deux principaux moyens de dissémination dans la nature, une transmission dite verticale et une transmission dite horizontale.

La transmission verticale correspond à la transmission du virus à la descendance d'une plante infectée. Elle est très fréquente chez les plantes à multiplication végétative. Tous les organes de propagation tel que les boutures, les greffons, les bulbes et les tubercules prélevés sur une plante mère virosée seront infectés (Casselyn, 2002).

Dans la majorité des cas, les virus ne sont pas transmis par les graines. Mais, dans des rares cas, certains virus de plantes pérennes sont transmis par le pollen disséminé soit par le vent soit par les insectes pollinisateurs (Kummert et Semal, 1996).

De plus, l'intensification des échanges commerciaux au niveau mondial fait que la transmission des phytovirus à la descendance constitue un risque majeur de dissémination des virus d'un pays ou d'un continent à un autre.

Ce mode de transmission fait le plus souvent intervenir un intermédiaire qui est le vecteur. Ce dernier prélève le virus d'une plante malade et l'inocule dans une plante saine. Il contribue efficacement à la survie et à la dissémination spatiale du virus (Costa, 2003). Certaines zoospores de champignons affectant les racines de plantes peuvent servir de transporteurs de virus, mais les principaux vecteurs sont les insectes tel que les pucerons (figure 3), les aleurodes et les cochenilles. De même, ces vecteurs peuvent correspondre aux nématodes, qui acquièrent et transportent les virus, en se nourrissant, et les retransmettent à de nouvelles plantes (Casselyn, 2002).

De plus, la transmission horizontale peut être causé par des blessures du feuillage ou des germes occasionnées par les bris de poils, les outils contaminés et les pratiques culturales (Kummert et Semal, 1996).

Figure 3 : Transmission horizontale des virus par les pucerons (Pasche et al., 1994)

L'infection des plantes par des phytovi rus provoque des effets pathogènes profonds dans l'hôte. Il s'agit en fait de symptômes qui sont visuellement détecté et de dégâts concernant surtout la croissance et le développement de la plante hôte.

La multiplication des particules virales généralisée à l'ensemble de la plante provoque des perturbations métaboliques conduisant à l'expression de symptômes variés (Kummert et Semal, 1996). Ces symptômes peuvent varier selon le virus, la variété ou l'espèce atteinte, l'environnement et l'état physiologique dans le quel se trouve les plantes.

En effet, sur les feuilles, les symptômes apparaissent généralement au site d'inoculation, sous
formes de foyers localisés. Chez certains couples plantes-virus, la multiplication et l'extension

du virus sont limitées, avec formation de lésions nécrotiques suite à une réaction d'hypersensibilité, tandis que dans d'autres cas, le virus envahit l'ensemble des tissus de la plante hôte en induisant des infections systémiques (Kummert et Semal, 1996).

Ces phytovirus provoquent en fait des symptômes de mosaïque sur les feuilles, c'est-à-dire une alternance de zones de coloration vert foncé et vert pâle due à la répartition anormale des pigments chlorophylliens dans les feuilles. Si les taches sont diffuses, on parle de marbrures. Dans le cas d'une coloration plus intense au niveau des nervures, on parle de mosaïque de nervure et si la coloration est plus claire on parle d'un éclaircissement des nervures (Costa, 2003).

De plus, les virus sont responsables de jaunissement des feuilles. Selon Costa (2003), ce dernier, caractérise les virus localisés au niveau vasculaire et s'accompagne d'un épaississement et souvent un enroulement des feuilles.

En plus des symptômes de mosaïque (figure 4) et de jaunissement des feuilles (figure 5), les virus peuvent être la cause de plusieurs anomalies de croissance. En fait, le virus utilise le métabolisme de la plante pour se multiplier, ce qui entraîne un ralentissement de la croissance révélée par des feuilles plus petites et des malformations sur feuilles et sur fruits comme un rabougrissement, des boursouflures, des cloques, des crispations, des excroissances, et un filiformisme des feuilles (Astier et al., 2001).

provoqués par les phytovirus et d'enroulement provoqués par les phytovirus

D'une manière générale, les maladies virales réduisent la croissance et donc le potentiel
global de production d'une plante. Dans le cas des fruits et des légumes, ces virus peuvent

altérer leur aspect et donc la qualité commerciale de la récolte (Astier et al., 2001) et peuvent même parfois conduire à la mort de la plante infectée.

Les pertes économiques induites par les virus, difficiles à évaluer précisément, sont considérables. Pour le cas de la maladie des feuilles jaunes en cuillère de la tomate (Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV), les pertes de rendement quantitatives et qualitative dans la récolte de tomate atteignent souvent 100 % (Picó et al., 1996), alors que dans le cas de la vigne, le virus du court noué (Grapevine Fan Leaf Virus, GFLV), présent dans la plupart des vignobles du monde, y compris en France où il infecte 60 % de la surface du vignoble national, soit environ 550 000 hectares, et induit des pertes évaluées à environ un milliard d'euros par an (Fuchs, 2008a).

Alors, afin de réduire les pertes de récoltes qu'ils occasionnent les virus phytopathogènes pour pallier l'insécurité alimentaire et pour maintenir la compétitivité de certaines filières professionnelles il faut bien étudier les virus aux quels on s'intéresse, les diagnostiquer et lutter contre eux.

La pomme de terre (Solanum tuberosum L.) est fréquemment infectée par plusieurs virus durant la saison de croissance provoquant ainsi des réductions de rendements et de la qualité des tubercules (Agi ndotan et al., 2007).

Aujourd'hui, au moins 38 virus infectent la pomme de terre. Parmi les quels on trouve essentiellement le virus de l'enroulement de la pomme de terre (PLRV), le virus Y de la pomme de terre (PVY) et le virus X de la pomme de terre (PVX) (Kerlan, 2008).

Le virus Y de la pomme de terre est, sur le plan économique, l'un des virus les plus importants. Décrit pour la première fois sur pomme de terre en 1930, le PVY est maintenant présent dans tous les pays producteurs de la pomme de terre (Jacquot et al., 2005).

Ce virus, membre type du genre Potyvirus de la famille des Potyviridae et de la superfamille des Picornaviridae (Pépin, 2004), est un virus à ARN simple brin, de polarité positive et d'environ 10 kb. Sa particule virale est filamenteuse flexueuse de 730 nm de longueur et de 20 nm de diamètre (Glais et al., 2001).

Ce phytovirus se transmet selon le mode non persistent de manière mécanique, par microblessure ou par l'alimentation des pucerons surtout le puceron vert du pêcher (Myzus persicae) et infecte principalement les Solanacées tel que la pomme de terre, la tomate et le tabac (Pépin, 2004).

L'importante variabilité biologique, sérologique et moléculaire du PVY supporte la classification complexe des isolats en groupes (PVY^O, PVY^C, PVY^N pour le cas de la pomme de terre) et ceci sur la base des symptômes induits sur plantes indicatrices ou sur la capacité de contournement de certaines sources de résistance et en variants (PVY^NTN, PVY^NW, PVY^N:O pour le cas de la pomme de terre) en associant les isolats présentant des propriétés originales (Kerlan et Moury, 2008).

Sur la culture de pomme de terre, les symptômes déterminés dépendent essentiellement du type de souches virales, de la variété cultivée, du caractère primaire, et dans ce cas de la précocité de l'attaque, ou secondaire de l'infection ainsi que les conditions d'environnement aux quelles se trouvent la plante (Rousselle et al, 1996).

Généralement, les principaux symptômes observés sur les parties aériennes sont des nécroses noirâtres au niveau des nervures et sur la face inférieure des feuilles ressemblant à des tâches d'encre et des mosaïques foliaires qui peuvent être dans certains cas faibles et discrets mais dans d'autres cas très sévères et ceci dépend du type de souches virales. Cette mosaïque est souvent accompagnée de frisolées ou de bigarrure (figure 6) (Pépin, 2004).

Figure 6 : Symptômes du PVY sur les feuilles de pomme de terre (Spire, 2001)

Le virus de l'enroulement de la pomme de terre (PLRV) est considéré parmi l'un des plus préjudiciables virus affectant la pomme de terre qui se transmet par les pucerons. Les pertes de rendements peuvent atteindre jusqu'à 80 à 90 % (Vazquez Rovere et al., 2001).

Concernant les symptômes caractéristiques de l'infection secondaire, il s'agit d'un enroulement des feuilles de la base en cuillère, un port dressé et un nanisme de la plante (figure 7) (Rousselle et al, 1996).

Figure 7 : Symptômes du PLRV sur les feuilles de pomme de terre (Spire, 2001)

Le virus X de la pomme de terre, autrefois le virus le plus commun sur cette culture, a fortement diminué d'importance. Il se transmet essentiellement par contact entre les plantes au champ ou des tubercules pendant la période de conservation de ces derniers (Rousselle et al, 1996).

Les symptômes identifiés sur la culture de la pomme de terre sont des mosaïques à large plages claires alternant des zones vertes avec ou sans déformation foliaire (figure 8) (Ryua et Honga, 2008).

Figure 8 : Symptômes du PVX sur la partie aérienne de la plante (Te et al., 2005)

Les techniques de diagnostic sont indispensables pour l'identification et la classification des phytovirus car la lutte contre ces derniers nécessite tout d'abord un diagnostic correct. Les techniques de diagnostic les plus importants sont basées sur les propriétés morphologiques, sérologiques, moléculaires et pathogènes des phytovirus et très souvent sur une combinaison entre eux (Koenig et al., 2008).

On distingue quatre méthodes de diagnostic des virus qui sont biologiques, microscopiques, sérologiques et moléculaires. Concernant les deux premières méthodes, elles ne sont pas très efficientes. En fait, l'indexage biologique ne permet pas toujours la détection du virus car différentes souches peuvent souvent provoquer des symptômes analogues ou même un virus peut produire des symptômes variables. Alors que concernant le diagnostic par microscopie électronique, il permet de détecter les virus à particules allongées. Bien que ceux qui sont de forme parasphériques, ils peuvent être confondus avec les composants de la cellule hôte.

Le contrôle des maladies virales des plantes nécessite une détection spécifique et précoce de l'agent responsable de l'infection. Les techniques immunologiques de diagnostic, basées sur la reconnaissance d'épitopes (sites antigéniques spécifiques de chaque agent pathogène) par des anticorps, ont apportés, par rapport aux deux autres méthodes biologiques et microscopiques de diagnostic, une amélioration importante au niveau de la sensibilité, de la reproductibilité et de la rapidité de l'exécution (Lemattre et al., 1991).

Plusieurs techniques sérologiques, mettant en oeuvre l'interaction spécifique entre les anticorps et les antigènes, sont aujourd'hui appliquées pour la détection des phytovirus. Parmi ces techniques, on cite la technique de précipitation, la double immunodiffusion, l'immunoélectromicroscopie (IEM), les techniques immunoenzymatique correspondant au test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) et ses variante DAS ( Double Antibody Sandwich) et TAS (Triple Antibody Sandwich), l'ACP (Antigen Coated plate) et les Flashkits.

Le test ELISA, outil le plus fréquemment utilisé pour la détection sérologique d'entités
virales, a été décrite par Clark et Adams en 1977 (Boonham et al., 2002). En fait, cette
technique permet de s'affranchir des incertitudes liées à l'étude des symptômes et d'affirmer

qu'une plante est effectivement infectée par un virus. Elle est simple, très sensible et permet de détecter entre 1 à 10 ng de virus par ml de broyat (de feuilles ou de fruits), selon le virus considéré (Costa, 2003).

Le test ELISA, utilisé pour la détection et le dosage d'antigène ou d'anticorps, présente différentes variantes faisant appel à un procédé direct qui englobe le test ELISA simple et le test ELISA double sandwich (DAS) et un autre indirect (Lepoivre et Kummert, 1996). Le principe du test DAS ELISA consiste à une adsorption d'anticorps, suivie d'une fixation d'antigènes et puis d'une autre fixation d'anticorps couplés à une enzyme sur le couple anticorps-antigène (figure 9).

Cette méthode ELISA, bien qu'elle est simple et rapide, elle demande beaucoup de temps, elle ne peut être pratiqué qu'au laboratoire et permet la détection d'un seul virus par chaque test. De plus, pour le cas de la pomme de terre, ce test ne peut être réalisé que sur des tubercules qui ne sont pas en dormance (Bergervoet, 2008).

La réussite du diagnostic des plantes par la méthode sérologique ELISA nécessite des conditions optimales d'application du protocole. L'utilisation des Flashkits est une méthode plus simple pouvant même être utilisé au champ pour détecter les virus.

Les Flashkits, constitués d'une bandelette de détection et d'un sachet de broyage rempli d'une solution tampon d'extraction (figure 10), permettent un diagnostic rapide sur plantes présentant ou non les symptômes de la maladie provoquée par des virus ou des bactéries. Ils sont aussi utilisés pour la détection des événements transgéniques (Organismes Génétiquement Modifiés, OGM).

Le diagnostic des virus par les flashkits est simple et peut être effectué en cinq étapes. Il s'agit tout d'abord de prendre un échantillon de feuilles d'une même plante et le placer entre les parois tissées du sac de broyage. Ensuite, il faut écraser le sac de broyage avec un stylo ou un autre outil pour éclater complètement l'échantillon. Après, il consiste à insérer l'extrémité de la bandelette de détection dans l'extrait, à côté des parois tissées. Enfin, il suffit d'attendre un minimum de 5 minutes et un maximum de 30 minutes avant de lire et interpréter le résultat. En fait, si la ligne de contrôle n'apparaît pas, le test est nul et doit être refait avec une bandelette neuve (Anonyme 2).

Les méthodes de diagnostic biologique, microscopique et sérologique permettent le diagnostic des maladies virales mais elles ne sont pas toujours fiables. Les méthodes de diagnostic moléculaire tel que les techniques d'hybridation moléculaire, la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), la RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), la PCR en temps réel (Q-PCR, Real-Time Polymerase Chain), les micropuces d'ADN (Microarray) et plusieurs autres méthodes ont permis une amélioration au niveau de la détection des phytovi rus.

Concernant la RT-PCR, cette technique est simple, très spécifique et sensible garantissant le diagnostic des virus à ARN seulement. De plus, elle permet le diagnostic de plusieurs virus en un seul test (Hogue et al., 2006).

Pour la PCR en temps réel, cette technique permet une détection plus fiable et plus rapide des phytovi rus (Agindotan et al., 2007).

Alors que concernant les micropuces d'ADN (Microarray), cette méthode représente une des
avancées de la technologie moléculaire les plus récentes. Combinées avec la bioinformatique,
elles possèdent des capacités de détection simultanée de milliers de gènes ou de séquences

d'ADN cible et constituent des outils ayant un potentiel énorme pour la détection simultanée d'un grand nombre de phytovirus (Kostrzynska et Bachand, 2006).

Les maladies virales sont actuellement incurables au champ. Une plante infectée par un virus le restera durant la totalité de son cycle de développement. De ce fait, les seuls moyens de lutte possibles sont préventifs visant à éviter les contaminations (Astier et al., 2001). Parmi ces approches préventives on trouve l'utilisation de semences certifiées, la thermothérapie, l'épuration et la destruction des sources de virus ainsi que la lutte contre les vecteurs des virus notamment les pucerons. Tous ces moyens de lutte permettent de réduire les risques d'infection virale mais non pas de les éviter d'une façon absolue.

L'utilisation de plantes résistantes est la stratégie la plus précieuse et efficace pour contrôler les maladies virales et atténuer leur impact (Fuchs, 2008a). Cette résistance, pouvant être horizontale (polygénique) c'est-à-dire efficace contre toutes souches d'un même virus ou verticale (monogénique) c'est-à-dire efficace contre certaines souches d'un virus (Costa, 2003). Son origine peut être soit naturel, soit résultant de l'amélioration génétique par des méthodes classiques de croisement ou grâce aux voies biotechnologiques.

La connaissance des ressources génétiques, qu'il s'agisse des espèces sauvages ou des espèces cultivées nous permet de déterminer une variabilité génétique large concernant les gènes de résistance aux virus et notamment à leurs vecteurs qui vont permettre à la plante de reconnaître le virus et d'établir une barrière active empêchant l'infection (Byoung-Cheorl et al., 2005).

Plusieurs gènes de résistances aux phytovirus ont été identifiés, grâce à la sélection assistée par marqueurs, à partir de divers plantes tel que les gènes dominants Rx1 et Rx2 pour le virus X de la pomme de terre et le gène Y-1 pour le virus Y de la pomme de terre. D'autres gènes de résistances récessifs ont été aussi identifiés comme pot-1, pvr1 et pvr21 pour le virus Y de la pomme de terre (Maule et al., 2007).

Les variétés à résistance plutôt horizontale sont préférés afin d'éviter les contournements de résistance ou les pressions de sélection, alors que l'utilisation des variétés tolérantes peut servir de réservoir de germes et de sources de contamination des cultures adjacentes sensibles (Rousselle et al., 1996).

Selon Gallais (2000), l'amélioration génétique des plantes vise la création de matériel végétal nouveau présentant les meilleures caractéristiques agronomiques et phytosanitaires.

La sélection pour la résistance ou la tolérance génétiques vis-à-vis les phytovirus constitue la méthode de lutte la moins astreignante pour l'agriculteur et la moins polluante. Elle requiert cependant la mise en oeuvre par le sélectionneur d'un travail particulièrement long et délicat puisque elle nécessite des recherches en laboratoire ainsi qu'en plein champ (Seilleur, 1996).

Cette amélioration de la résistance des variétés cultivées fait appel à des méthodes classiques de sélection notamment les croisements et des méthodes de type biotechnologique qui ont été mises en oeuvre depuis près d'un demi-siècle.

Les voies d'amélioration classique, pour lesquelles des plantes résistantes sont obtenues par croisements et rétrocroisements entre espèces compatibles, ont permis de sélectionner des variétés avec une résistance accrue vis-à-vis de nombreux virus (Lecoq et al., 2004).

Il s'agit en fait d'incorporer des gènes de résistance par croisement entre deux géniteurs appartenant à la même espèce, et dans ce cas on parle de croisements intraspéciphiques, ou

n'appartenant pas à la même espèce, qui est le cas des croisements interspéciphiques (Sei lleur, 1996). Pour ces géniteurs, l'un est donneur résistant mais avec de piètres qualités et l'autre est un receveur potentiel présentant des caractères agronomiques intéressants (Costa, 2003).

Cette méthode classique de croisement est la plus simple à mettre en oeuvre par l'améliorateur (Lecoq et al., 2004). Toutefois, elle est d'une utilité limitée lorsque aucune source de résistance n'est identifiée dans les collections de variétés cultivées ou sauvages d'une espèce donnée et lorsque les difficultés d'hybridation, voire les incompatibilités entre espèces, compliquent la tâche des améliorateurs (Fuchs, 2008).

De plus, d'après Astier et al. (2001), la création de variétés résistantes aux virus par la génétique classique est un processus très long. Il s'écoule souvent plus de 10 ans entre le moment où l'on découvre une résistance et le moment où cette résistance sera intégrée dans une variété commerciale.

Le plus souvent la résistance est spécifique à un virus donné. Il faudra donc créer des variétés possédant des résistances à plusieurs virus à la fois pour obtenir une protection optimale des cultures (Lecoq et al., 2004).

L'amélioration des plantes pour la création des variétés résistantes a connu au cours de ces dernières années une évolution rapide. Elle bénéficie désormais des outils biotechnologiques d'exploration des ressources génétiques et de création de variétés, qui viennent enrichir les méthodes classiques de sélection (Charrier et al., 1997). Ces méthodes biotechnologiques sont diverses, on trouve la création des hybrides somatique par fusion de protoplastes, la mutagenèse, la polyploïdisation, la transgenèse etc....

La fusion de protoplastes, permettant la réalisation d'hybridations dites somatiques entre deux parents génétiquement différents ou pouvant même être interspécifique, est une approche très puissante pour l'amélioration génétique (Pinheiro Dillona, et al., 2008). Elle permet d'accroître la diversité des pools géniques des espèces cultivées, non seulement en contournant les incompatibilités ou contraintes sexuelles, mais également en combinant les génomes nucléaires, chloroplastiques et mitochondriaux suivant de nouvelles règles (Ollitrault et al., 2000).

Un protoplaste désigne en fait une cellule végétale totipotente, débarrassée de sa paroi, qui apparaît sous forme d'une cellule sphérique et limitée par sa membrane plasmique (Cardi et al., 1990).

Concernant la technique de l'hybridation somatique, elle consiste tout d'abord à isoler des protoplastes. Transférés sur un milieu de régénération, les cals se développent en embryons somatiques et donnent des plantules (Davey et al., 2005).

Le génie génétique et le concept de la résistance dérivée du pathogène ont ouvert la voie à des stratégies innovantes de création de variétés résistantes vis-à-vis des virus phytopathogènes. Cette nouvelle stratégie de lutte contre les virus a fait son entrée depuis une douzaine d'années dans la pratique agricole aux Etats-Unis d'Amérique (Fuchs, 2008 a). Elle a été tout d'abord démontré en 1986 pour le virus de mosaïque du tabac (TMV) chez Nicotiana tabacum en introduisant le gène de la protéine de capside du TMV et les plantes transgéniques ainsi obtenues étaient résistantes à ce phytovirus (Fuchs, 2008b).Ultérieurement, de nombreuses plantes transgéniques contenant le gène de la capside virale ou d'autres séquences d'origine virale tel que les gènes de la réplicase, de la protéase, de la protéine de mouvement, des séquences non codantes, des ARN satellite et des ARN défectifs interférents (Fuchs et Gonsalves, 2007) ont été testés mais peu qui ont été commercialisés et bien adoptés par les agriculteurs (Fuchs, 2008 b) à cause des interrogations légitimes sur leur innocuité pour la santé humaine et l'environnement (Tepfer, 2002).

Le concept de la transgenèse consiste, dans le cas des virus phytopathogènes, à transférer une séquence d'origine virale, codant ou non une protéine, soit sous forme d'ADN complémentaire dans le cas de virus à génome ARN, soit sous forme d'ADN dans le cas de virus à génome ADN (Fuchs, 2008a), dans le génome d'une plante afin de perturber le cycle

de multiplication du virus et de conférer un phénotype de résistance (Sanford et Johnston, 1985).

Plusieurs espèces végétales transgéniques tolérantes aux herbicides, résistantes aux insectes et aux virus, ont été commercialisées. Parmi les quelles on peut citer le coton, le soja, le maïs, le papayer etc.... (Fuchs, 2008a).

Les méthodes de lutte qui ciblent directement les virus, autre que l'utilisation des variétés résistantes, reposent sur la protection croisée appelé aussi prémunition permettant d'induire la résistance chez les plantes.

En fait, la prémunition consiste à protéger une plante d'une infection par une souche virale agressive en l'inoculant au préalable par une souche virale atténuée (Fuchs et al., 1997) isolé ou obtenue par mutagénèse ne provoquant pas d'effet sur le rendement mais avec peu de symptômes (Astier et al., 2001). Elle a été utilisée avec succès pour protéger plusieurs cultures tel que les agrumes qui ont été protégés du virus de la tristeza des agrumes (citrus tristeza virus, CTV) (Fuchs et al., 1997). La prémunition est mise en oeuvre sans pour autant que ses mécanismes soient bien cernés, même si l'extinction de l'expression génique et d'autres phénomènes semblent impliqués (Roosinck, 2005).

5.2.4. L'utilisation de produits qui induisent des réactions de défense chez la

La lutte contre les virus phytopathogènes, possible par l'introduction de gènes de résistance à partir des plantes cultivées naturellement résistantes par des méthodes classiques de sélection ou par des méthodes biotechnologiques, est également possible selon Walters et al., (2005) par induction de la réaction de défense. Cette dernière, se traduit par une augmentation de la capacité de la plante à se défendre contre un large spectre d'agents pathogènes et ceci par des inducteurs de type biotiques qui incluent les éliciteurs et de type abiotiques correspondant à des traitements par des produits analogues aux éliciteurs naturels.

Ces produits ont été utilisés avec succès pour le cas des maladies fongiques causées par les champignons aériens et du sol.

La pourriture grise est une maladie provoquée par le champignon saprophyte Botrytis cinerea. Pers. Ce dernier représente la forme conidienne imparfaite de Botryotinia fuckeliniana qui fait partie des Deutéromycètes, classe des Hyphomycètes, ordre des Moniliales et à la famille des Moniliacées (Bouchet et al., 1999).

Ce champignon est capable d'infecter un grand nombre de plantes cultivées (tomates, raisins, haricots, fraises, etc.) en les affaiblissant ou les tuant à n'importe quel stade de leur développement ou même en période de stockage causant ainsi des pourritures caractéristiques de coloration grise noire et aux contours imprécis au niveau des feuilles, du pédoncule, des fleurs, des sépales, des tiges et des fruits Les pertes provoquées par ce champignon sont estimées à 20% des récoltes mondiales (Hmouni et al., 2003).

Le contrôle de cette maladie est basé surtout sur l'usage répété de fongicides principalement des benzimidazoles et des dicarboximides. Cependant, cette chimiothérapie est généralement inefficace vu l'apparition de souches résistantes (Hmouni et al., 2003). De plus, la lutte contre le Botrytis est possible par l'utilisation de biofongicides qui renferment une quantité efficace de souches bactériennes et de levure et qui présentent également l'avantage d'exercer un effet d'éliciteur qui se traduit par une activation des défenses naturelles de la plante (Bouchet et al., 1999). Egalement, le contrôle de la maladie de la pourriture grise est possible par les méthodes de lutte biologiques. En fait, cette dernière consiste à augmenter la population d'un autre microbe qui va parasiter le champignon (hyperparasite) ou qui va prendre sa place (antagoniste) sans affecter la culture à protéger (Guetsky et al., 2001).

Les champignons du sol qui peuvent infecter les cultures maraîchères sont diverses parmi les quel on trouve la fusariose et la verticilliose. Ces pathogènes sont capables de se maintenir dans le sol, soit en menant une vie saprophytique sur des débris végétaux, soit sous forme d'organes de conservation comme les zygotes ou les sclérotes (Boisson et Renard, 1987). Concernant la fusariose, cette maladie est causée par certains champignons du genre Fusarium. Les champignons de ce genre sont considéré comme étant les champignons telluriques les plus agressifs. Ils sont largement distribués dans le sol représentant 40% de la mycoflore au niveau de la rhizosphère (Mhiri, 2003).

Les Fusarium appartiennent à la classe des Adélomycètes, à l'ordre des hyphales et à la famille des Tuberculariées (Lidell, 1991). Ils représentent un grand nombre d'espèces comme le Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici qui attaque la culture de tomate, le Fusarium oxysporum f. sp. Melonis qui attaque la culture de melon ainsi que le Fusarium solani qui attaque les solanacées. Ces champignons, représentant des formes conidiennes d'Ascomycètes Hypocréacées, sont responsables de symptômes de jaunissement et de perte prématurée des cotylédons et des feuilles basales. Egalement, il y a pourriture du système racinaire avec des chancres brun légèrement déprimés qui se développent sur un seul côté du collet et de la tige en forme de flammes (Miller et al., 2000).

En ce qui concerne la verticilliose, cette maladie est causée par un champignon tellurique du genre Verticillium attaquant plusieurs cultures tel que la tomate, le melon, l'aubergine et le coton. Ce champignon comporte deux espèces Verticillium dahliae et Verticillium albo-atrum qui sont très répondues dans le sol (Blancard, 1988). Ces pathogènes appartiennent à la classe des Sordariomycetes, ordre des incertae sedis et à la famille des Plectosphaerellaceae.

En conditions favorables ces pathogènes peuvent causer des pertes de rendement de 30 à 69%. Alors que concernant les symptômes, il s'agit d'un dessèchement des feuilles sous forme de «V» accompagné d'un jaunissement internervaire suivie d'un dessèchement des feuilles de la base avec une coloration gris clair à brun des vaisseaux (Cherif, 2004).

Les caractères biologiques de ces champignons (Fusarium et Verticillium) montrent qu'il est difficile de les éliminer du sol. Les dégâts sont souvent importants. A l'apparition des premiers symptômes, il est déjà trop tard pour intervenir et contrôler l'extension du parasite. Seules les méthodes préventives sont alors efficaces pour limiter les pertes causées par ces maladies (Boisson et Renard, 1987). La lutte préventive contre les champignons du sol peut être chimique grâce aux fongicides appliqués sur les semences, les plants ou même le sol (Monnet, 2001). Cependant, leur efficacité reste aléatoire à cause de la formation de nouvelles

souches résistantes à ces produits. De plus, l'utilisation de portes greffes résistants à ces maladies du sol est possible. En fait, des hybridations interspécifiques entre tomate Lycopersicum hirsutum et Lycopersicum esculentum ont données des plantes génétiquement résistantes à la verticilliose et à la fusariose (Trottin-Caudal et al., 1995).

Bien que ces deux méthodes de lutte préventives permettent de diminuer les risques d'infection, ils ne permettent pas une suppression totale de ces champignons. C'est pourquoi, les stratégies de lutte biologiques par des biofongicides qui induisent la réaction de défense chez les plantes et qui diminuent l'impact de la maladie sont aujourd'hui conseillées (Hibar et al., 2006).

Lors de l'agression d'une plante par un pathogène, plusieurs cas de figure peuvent se présenter. L'interaction entre la plante et le microorganisme peut être compatible si la plante ne réagit pas assez rapidement ou si les voies de défense sont « désactivées », et par conséquence il va y avoir une prolifération du pathogène (Abramovitch et Martin, 2004).

Cependant, il peut y avoir une interaction incompatible correspondant à une incapacité du pathogène à infecter la plante (Nurnberger et Lipka, 2005). Ceci est dû à la présence de barrières physiques naturelles tel que la paroi cellulaire et la déposition de callose, et/ou chimiques par sécrétion de substances toxiques tel que les tanins ou la lignine ou encore grâce à des composés de défense connus sous le nom d'éliciteurs (Pépin, 2004). La perception de ces éliciteurs déclenche une cascade de signalisation aboutissant à l'activation d'une réaction d'hypersensibilité (HR) (Racapé et al., 2002). Cette réaction, considéré comme étant la réponse des plantes aux virus la plus connue, est exprimée dans la plante par le développement de lésions nécrotiques qui se produisent au site de l'infection et restreint le développement du microorganisme en le privant de l'eau et des nutriments nécessaires à sa croissance (Keen, 1990).

Les éliciteurs, composés responsables des réactions de défense chez la plante hôte, peuvent être d'une part des éliciteurs naturels produits par les microorganismes phytopathogènes comme les virus ou de synthèses.

Les éliciteurs de phytopathogènes tel que les virus ou les champignons, de nature chimique variée (oligomères de chitine, de pectine, des glucanes, des (glyco) protéines et des lipides), sont constitués des PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), non spécifiques, qui sont reconnus par plusieurs plantes et des composés plus spécifiques, les protéines d'avirulence, qui sont reconnues par des cultivars particuliers (Montesano et al., 2003).

Les PAMPs interviennent dans l'immunité PTI (PAMP-Triggered Immunity) et appartiennent à une large classe de molécules incluant des composés lipidiques, des glycolipides, des polymères de sucres, ou des (glyco-) peptides et protéines. Toutefois, les structures des différentes classes de PAMPs sont hautement conservées d'un microorganisme à l'autre. Ces éliciteurs, isolés de virus sont produits de manière constitutive par le pathogène car ils sont généralement essentiels à son bon fonctionnement (Nurnberger et Lipka, 2005 ; Chisholm et al., 2006).

D'autre part, bien qu'elles ne soient pas considérées comme des PAMPs, les protéines d'avirulence sont tout de même reprises comme molécules élicitrices de défense, puisqu'elles sont en mesure de déclencher une réponse hypersensible chez les plantes possédant les gènes de résistance. Chez les plantes sensibles, elles facilitent la pathogénicité, entre autre, en retardant le renforcement de la paroi (formation de callose), en modifiant l'activité de protéines dans la cellule-hôte ou en interférant avec la transcription des gènes de défense (Montesano et al., 2003 ; Chisholm et al., 2006).

L'induction de la réaction de défense des plantes, pour une meilleure résistance contre les phytovirus, est aujourd'hui devenue possible par la synthèse de substances chimiques jouant le rôle d'éliciteurs.

En fait, l'étude des voies de signalisation, grâce à l'utilisation des outils biochimiques, pharmacologiques et génétiques, des événements biochimiques observés dans les premières minutes de l'élicitation ainsi que la compréhension des enchaînements et des régulations croisées entre ces événements et l'identification des réponses physiologiques qu'ils contrôlent, constituent aujourd'hui un défi majeur (Dangl et Jones, 2001). Ces études ont mené à l'identification de l'efficacité de certaines substances chimiques tel que le monoxyde d'azote et des oligosaccharides extraits d'algues marines :

Récemment, diverses équipes de recherche se sont intéressées au rôle potentiel du monoxyde d'azote (NO) dans la résistance des plantes aux micro-organismes pathogènes (Wendehenne et al., 2004). Selon Morot-Gaudry et al., (2005) Ces études ont montré que les cellules végétales produisent le NO lorsqu'elles sont confrontées à l'attaque de micro-organismes potentiellement pathogènes ou par des éliciteurs de réactions de défense. Il a été démontré alors que le NO est un acteur essentiel de la résistance des plantes aux micro-organismes pathogènes. En effet, suivant les modèles d'études, le NO est nécessaire au développement de la réponse hypersensible permettant ainsi de confiner le pathogène à son site de pénétration. De plus, ce NO est indispensable à l'expression de gènes de défense variés codant pour des protéines PR, des protéines impliquées dans la synthèse de phytoalexines ou encore dans la protection contre des stress oxydatifs. Finalement, le NO est nécessaire à la synthèse d'acide salicylique et, en conséquence, à la mise en place de la réponse systémique.

Selon Klarzynski (2001), afin d'améliorer par des moyens naturels la protection des plantes contre les agents pathogènes, une stratégie consiste à utiliser des éliciteurs capables de stimuler les mécanismes de reconnaissance impliqués dans la mise en place des réponses de défense des plantes. Ces éliciteurs sont des oligosaccharides extraits d'algues marines.

Les résultats obtenus sur une plante modèle de tabac montrent que des oligomères caractéristiques d'alginates, de carraghenenes, de fucanes et de laminarine sont perçus efficacement par les plantes.

Ces éliciteurs provoquent des effets différentiels. Les structures les plus actives dans les tests réalisés sont la laminarine et les oligofucanes. Ces molécules induisent tout un spectre de réponses de défense dont l'accumulation de peroxyde d'hydrogène, l'induction d'enzymes clés des voies métaboliques des phenylpropanoïdes et des oxylipines., l'accumulation de l'acide salicyclique (AS), de plusieurs familles de protéines PR et de phytoalexine (la scopoletine). L'application de la laminarine des oligofucanes stimule fortement la résistance du tabac contre le virus de la mosaïque dans les zones traitées et également dans les zones non traitées de la plante.

L'acide salicylique, naturellement synthétisé par certains végétaux, est un acide carboxylique incolore et cristallin qu'on l'extrayait principalement du saule, salix en latin dont il tire son nom.

Chez les plantes, l'acide salicylique joue un rôle essentiel dans les mécanismes de défense contre les infections et les agressions extérieures. En fait, cette molécule agit comme un signal chimique permettant à la plante de résister aux bactéries, virus ou champignons microscopiques qui l'attaquent en déclenchant la production de protéines de défense qui sont capables de détruire les agresseurs. Il s'agirait d'une sorte de réaction de défense immunitaire

végétale. Il est appliqué par pulvérisation foliaire à une concentration qui est égale à 5mM à partir du produit chimique (Acros, poids moléculaire=160g/mol).

Le Flashkit, constitué d'une bandelette de détection et d'un sachet de broyage rempli d'une solution tampon d'extraction permet un diagnostic rapide sur plantes présentant ou non les symptômes de la maladie provoquée par le virus.

Le diagnostic des virus par les flashkits est simple et peut être effectué en quatre étapes (figure 14). Il s'agit tout d'abord de prendre un échantillon de feuilles d'une même plante et le placer entre les parois tissées du sac de broyage. Ensuite, il faut écraser le sac de broyage avec un outil solide pour broyer complètement l'échantillon. Après, il s'agit d'insérer l'extrémité de la bandelette de détection dans l'extrait, à côté des parois tissées. Enfin, il suffit d'attendre un minimum de 5 minutes et un maximum de 30 minutes avant de lire et interpréter le résultat. Deux cas peuvent avoir lieu : soit qu'il y a apparition de la ligne de contrôle seulement qui assure le bon fonctionnement du test, donc la plante est saine ; soit qu'il y a apparition de la ligne de contrôle et de la ligne test ce qui preuve que la plante est virosée. Le test est supposé nul et doit être refait avec une bandelette neuve, si la ligne de contrôle n'apparaît pas.

Figure 14 : Différentes étapes suivies lors d'un test Flashkit (a : Prélèvement d'un échantillon,
b : Broyage de l'échantillon, c : Insertion de la bandelette de détection)

Le test ELISA, outil le plus fréquemment utilisé pour la détection sérologique d'entités virales, a été réalisé au laboratoire de Mornag du service de la protection et contrôle de qualité des produits agricoles du ministère de l'agriculture.

Ce test ELISA comporte en fait quatre étapes séparées par une période d'incubation et un lavage. La première étape consiste à une adsorption des anticorps sur les parois et le fond des puits de la plaque de microtitration « coating ». Ensuite, les particules antigéniques présentes dans l'échantillon se lient spécifiquement aux anticorps adsorbés Après, les anticorps couplés à une enzyme (la phosphatase alcaline) se fixent aux particules antigéniques déjà liées aux anticorps de «coating». Enfin, l'addition d'un substrat spécifique à cette enzyme donne par hydrolyse une couleur jaune caractéristique (Clauzel et Lefebvre, 1991).

Les résultats du test ont été scorés suite à lecture photométrique de l'intensité de la coloration.

Le test de fongitoxicité ayant pour but d'étudier la résistance des champignons vis-à-vis des produits phytosanitaires, a été effectué dans cette étude afin de chercher la dose optimale à utiliser pour quelques produits phytosanitaires et ceci en calculant la dose qui inhibe 50% de la croissance mycélienne de. En fait, cette dose de matière active doit être la plus faible et la plus efficace afin de répondre au rapport qualité / prix recherché par les agriculteurs. Dans cette étude, les produits utilisés sont de deux types : des produits à action indirecte qui induisent la réaction de défense chez la plante et des fongicides de référence à action directe fongitoxique sur le pathogène.

Le choix des doses des produits utilisés a été tributaire de la détermination de la CI50 qui représente la dose inhibitrice de 50 % de la croissance mycélienne. C'est pourquoi, une gamme de dilutions ainsi que des multiples de la dose recommandée par le fournisseur, pour être appliquée au champ, a été effectuée. Le tableau 2 représente les différentes doses appliquées lors du test de fongitoxicité calculées par rapport aux doses recommandées.

Tableau 2 : Gamme de dilutions des produits utilisés par rapport aux doses recommandées

Produits	Doses recommandées en ppm		Les doses appliquées en ppm
Alga Bactéricide	2000	8000	; 4000 ;	2000 ; 1000 ; 700 ; 600 ; 500 ;	400 ;
				250 ; 200 ; 20
Dalgin Active	2500		50000 ;	10000 ; 5000 ; 2500 ; 250 ; 25
2% Ningnan Mycin	Non recommandée		16000	; 8000 ; 4000 ; 2000 ; 200 ; 20
Zytroseed	2000	8000 ;	4000 ;	3000 ; 2000 ; 1000 ; 500 ; 250 ;	240 ;
				220 ; 200 ; 100 ; 20
Tachigaren	10000	10000	; 5000 ;	2500 ; 1250 ; 1000 ; 750 ; 500	; 250	;
				100
Mythos	1000			1000 ; 500 ; 250

Pour tous les champignons utilisés, chaque dose de produit a été additionnée à un volume de 20 ml de milieu de culture PDA (Potato Dextrose Agar) qui est à base de pomme de terre, saccharose et agar solidifiant. Après homogénéisation du milieu, ce dernier a été coulé sous hôte dans des boites de pétri stériles de 8,5 mm de diamètre. Egalement, pour chaque test, un témoin correspondant à une boite de pétri contenant seulement un volume de 20 ml de milieu PDA sans aucun produit a été utilisé. Ensuite, à chaque boite de pétri (contenant le milieu PDA sans ou avec produit), une portion d'agar de 5 mm de diamètre a été prélevé à partir du front de croissance mycélienne des champignons pures et fraîches et ceci à l'aide d'une pipette pasteur et d'un scalpel désinfectés. L'incubation de ces tests de fongitoxicité a été réalisée dans un incubateur à une température de 20° C pour tous les champignons.

Les produits phytosanitaires et leurs doses appliquées pour chaque champignon dans cette étude sont résumés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Les tests de fongitoxicités appliqués aux différents champignons

Champignons	Produits	Doses
BCF1.09	Dalgin Active	50000 ; 10000 ; 5000 ; 2500 ; 250 ; 25
	Alga Bactéricide	2000 ; 1000 ; 700 ; 600 ; 500 ; 400 ; 250 ; 200 ; 20
	Ningnan Mycin	16000 ; 8000 ; 4000 ; 2000 ; 200 ; 20
	Zytroseed	2000 ; 1000 ; 500 ; 250 ; 240 ; 220 ; 200 ; 20
	Tachigaren	10000 ; 1000 ; 100
	Mythos	1000 ; 500 ; 250
Fs	Dalgin Active	10000 ; 5000 ; 2500 ; 250 ; 25
	Alga Bactéricide	8000 ; 4000 ; 2000 ; 200 ; 20
	Ningnan Mycin	2000 ; 200 ; 20
	Zytroseed	4000 ; 2000 ; 1000 ; 500 ; 250 ; 200 ; 20
	Tachigaren	10000 ; 5000 ; 2500 ; 1250 ; 1000 ; 100
Forl	Dalgin Active	2500 ; 250 ; 25
	Alga Bactéricide	2000 ; 200 ; 20
	Ningnan Mycin	2000 ; 200 ; 20
	Zytroseed	4000 ; 3000 ; 2000 ; 1000 ; 500 ; 250 ; 200 ; 20
	Tachigaren	10000 ; 1000 ; 750 ; 500 ; 250 ; 100
Fom	Zytroseed	1000 ; 500 ; 250
Fom	Tachigaren	10000 ; 1000 ; 100
Vaa	Zytroseed	1000 ; 500 ; 250 ; 200 ; 100
	Tachigaren	10000 ; 1000 ; 100

Afin d'évaluer l'efficacité des produits utilisés pour le test de fongitoxicité avec les différents champignons aérien et du sol, des mesures des deux diamètres perpendiculaires de la croissance mycélienne ont été prises chaque jour pour le cas du B. cinerea pendant cinq jours (la période qui correspond au maximum de développement du champignon dans un milieu sans produit) et tout les deux jours pour le cas des champignons du sol et ceci durant presque

15 jours (la période qui correspond au maximum de développement du champignon dans un milieu sans produit).

Le pourcentage de la croissance mycélienne des différents champignons repiqués dans les milieux contenants les différentes doses de produits, a été estimé par rapport aux témoins qui sont repiqués dans un milieu PDA seulement et ceci en calculant la vitesse de croissance mycélienne définie selon la formule suivante :

Vitesse croissance mycélienne = (diamètre _j+1 - diamètre j) / nombre de jours Avec : j = jour

Le pourcentage de la croissance mycélienne est déterminé en calculant le rapport de la vitesse

de la croissance mycélienne journalière du champignon dans un milieu contenant le produit

sur la vitesse de la croissance mycélienne journalière du champignon dans un milieu sans

Les résultats ainsi obtenus ont été portés sur une courbe logarithmique où le pourcentage de
croissance a été exprimé en fonction de la dose appliquée et la concentration qui inhibe 50%

de la croissance mycélienne a été ensuite déterminée à partir de la droite obtenue.

Les tests d'inoculation sur des feuilles détachées ont pour but d'estimer l'effet de quelques produits sur l'induction de la réaction de défense chez la plante contre l'agression du champignon aérien B. cinerea. C'est pourquoi des traitements par différents produits ont été appliqués sur des plantules de la famille des Solanacées et des Cucurbitacées qui ont été semées dans des plaques alvéolées contenant de la tourbe, ainsi que sur des boutures de vigne placées dans des bac contenant un mélange de sable et de tourbe. Les produits utilisés sont l'Alga Bactéricide, la Dalgin Active, le Ningan Mycin, l'acide salicylique et le Codaphos Cuivre (figure 16). Ces derniers ont été appliqués par pulvérisation foliaire à l'aide d'un pulvérisateur manuel. Concernant les plantules témoin, elles ont été pulvérisées avec de l'eau distillée.

Pour évaluer l'efficacité de ces produits sur l'activation du système de défense des végétaux contre B. cinerea, des inoculations artificielles ont été effectuées selon deux méthodes (inoculation par implant mycélien ou par suspension sporale) après 24 heures, 48 heures et 72 heures des traitements et ceci pour déterminer la durée requise pour une meilleure action du produit.

Concernant la première méthode d'inoculation foliaire par implant mycélien, elle consiste à prélever des feuilles à partir des plantules traitées et les placer dans une chambre humide (boite de pétri en verre contenant du papier filtre imbibé). Ensuite, une portion d'agar de 5 mm de diamètre, prélevée à l'aide d'une pipette pasteur stérile à partir du front de croissance mycélienne fraîche du B. cinerea, a été mise en contact avec la face inférieure de chaque feuille (figure 17).

En ce qui concerne la deuxième méthode d'inoculation par suspension sporale,il s'agit en fait de mettre sur chaque feuille une goutte de 10 ul d'une suspension sporale préalablement préparée.

Cette suspension sporale a été préparée à partir d'une culture de B.cinerea sur milieu PDA qui a été maintenue dans un incubateur à 20°C pendant deux semaines. Les spores ont été prélevées par raclage de la surface de la culture à l'aide d'un scalpel préalablement désinfecté en présence de quelques millilitres d'eau distillée stérile. La concentration a été déterminée par observation sous microscope optique à l'aide d'une cellule de malassez. La suspension a été ensuite ajustée par des dilutions à la concentration 10⁷ spores/ml.

Pour les deux méthodes d'inoculation artificielle, les boites de pétries contenant les feuilles inoculées ont été placés dans un incubateur à 20°C.

Figure 16: Un plateau de tomate traité Figure 17 : Des feuilles de tomate inoculées

Les symptômes causés par B. cinerea ont été évalués en mesurant le diamètre du point d'infection sur la face inférieure de la feuille. Le suivi des nécroses a été effectué durant trois jours après inoculation dans le cas de l'implant mycélien et une semaine dans le cas de la solution sporale.

Afin de tester l'effet préventif et curatif des produits utilisés pour l'induction de la réaction de défense chez les plantes contre B. cinerea, trois types de traitements par pulvérisation foliaire ont été effectués par différents produits (le Switch comme un témoin positif, le Zytroseed, la Dalgin Active et l'acide salicylique) :

- Un traitement préventif d'un premier bloc trois jours avant l'inoculation - Un traitement d'un deuxième bloc le même jour de l'inoculation

L'inoculation par la suspension sporale de B. cinerea de concentration ajustée à 10⁷ spores/ml a été appliquée par pulvérisation foliaire le même jour pour les trois blocs.

Figure 18 : Schéma expérimental du test d'inoculation foliaire par suspension sporale

Une fois inoculées, les plantules ont été placées dans une chambre de culture sous des cages plastiques humidifiés tous les jours afin de créer un microclimat convenable au développement du pathogène. L'efficacité des produits appliqués a été évaluée suite à la mesure de la taille moyenne des plantules inoculées au niveau de chaque bloc de traitement et de chaque produit utilisé.

Des suspensions sporales ont été préparées à partir des cultures de champignons (FOM, Forl, Fs et Vaa), diluées dans 50 ml de milieu PDB (Potato Dextrose Broth), et ainsi inocubées pendant quelques jours en agitation continue pour favoriser la multiplication des spores. Ensuite, la concentration a été déterminée par observation sous microscope à l'aide d'une cellule de malassez et ajustée par des dilutions à la concentration 10⁷ spores/ml.

Plusieurs tests d'inoculation racinaire ont été effectués sur plusieurs espèces végétales afin d'observer les symptômes caractéristiques causés par les quatres pathogènes testés. Pour cela deux méthodes d'inoculation ont été appliquées :

Les plantules prélevées à partir des plaques alvéolées ont été débarrassées de leur tourbe et trempées jusqu'à l'axe hypocotyle dans la suspension sporale pendant 15 min. Concernant les

plantules témoins, elles ont été trempées dans de l'eau distillée. Une fois inoculées, les plantules ont été repiquées dans des pots contenant de la tourbe.

Cette méthode d'inoculation consiste à irriguer les plantules semées dans les plaques alvéolées par une suspension sporale préalablement préparée de sorte que chaque plantule reçoit un millilitre de la suspension sporale. Les plantules témoins ont été irriguées par de l'eau distillée.

Afin de tester l'efficacité de certains produits sur l'induction de la réaction de défense des plantes en présences des champignons telluriques, cette dernière méthode d'inoculation a été adoptée.

Les produits qui ont été utilisées par irrigation lors de ce test sont le Codaphos cuivre, le Zytroseed et le Tachigaren. Ces derniers ont été appliqués selon trois types de traitement :

- Un traitement préventif d'un premier bloc une semaine avant l'inoculation - Un traitement d'un deuxième bloc le même jour de l'inoculation

L'inoculation par la suspension sporale de Fom, Forl et Vaa de concentration égale à 10⁷ spores/ml a été appliquée le même jour pour les trois blocs de plantules.

L'évaluation de l'efficacité des produits appliqués consiste à déterminer le nombre de plantes infestées ainsi que leur niveau d'infestation pour chaque produit et traitement selon l'échelle de notation de Trapero-Casas A et Jiminez-Diaz R.M (1985) qui se base sur des observations visuelles. En fait, selon cette échelle, cinq classes ont été adoptées en se basant sur le pourcentage des feuilles attaquées. Cette échelle est présentée dans le tableau 4.

Tableau 4: Classes de l'échelle de notation de de Trapero-Casas A et Jiminez-Diaz R.M (1985)

Après évaluation, pour chaque traitement et produit utilisé, un indice d'attaque ou MDI (Mass Disease Index) a été calculé selon la formule suivante :

N = nombre de plantules totale pour chaque type de traitement et de produit 0 à 4 = niveau d'attaque selon l'échelle de notation adoptée

L'essai en plein champ a été réalisé dans une parcelle à Korba, qui appartient au gouvernorat de Nabeul, au niveau de la station expérimentale du GIL (Groupement interprofessionnel des légumes). Cette station, couvrant une superficie de 4 ha, s'occupe essentiellement de la réalisation des essais sur les nouvelles variétés des cultures maraîchères pour l'inscription variétale, la multiplication des semences de pomme de terre de la classe « A » à partir des semences importés de la classe « E » ainsi que la production de fraise, tomate, aubergine, pomme de terre de consommation et d'autres plantes ornementales comme l'oiseau de paradis. La région de la station expérimentale appartient à une zone bioclimatique subhumide avec un climat typiquement méditerranéen. Concernant le sol, il est caractérisé par une texture sableux-limoneuse convenant aux cultures maraîchères.

La parcelle couvre une superficie totale de 72 m² dont 24 m² ont été plantés par des tubercules de la variété Spunta alors que les autres variétés Atlas, Bellini et Océana occupent chacune 14 m² de la totalité de la parcelle. La plantation de toute la parcelle a été réalisée le 19 Mars avec une densité de plantation de trois plants dans un mètre linéaire.

Pour chaque variété de pomme de terre, trois lignes mesurant 12 m de longueur pour le cas de variété Spunta et 7 m de longueur pour les autres variétés ont été traité chacune par un produit différent. La première correspond à la ligne témoin non traité (Te), la deuxième étant traitée par le produit Alga Bactéricide (AB) alors que la troisième est traitée par le produit Dalgin Active (DA) (figure 20).

Le traitement des différents produits est appliqué par pulvérisation foliaire à l'aide d'un pulvérisateur à dos.

Egalement, dans le cadre de la lutte contre le mildiou, des traitements ont été effectués par le fongicide Anthéor C3 qui est à base de cuivre, de folpel et de cymoxamil dans le cadre de l'entretien de la parcelle.

Le tableau 5 résume les dates d'application des diffrents traitements effectués pour induire les réactions de défense de la pomme de terre par les produits Alga Bactéricide et Dalgin Active ainsi que contre le mildiou par l'Anthéor C3.

Afin d'évaluer l'efficience des produits utilisés pour induire la réaction de défense des plantes contre le virus PVY de la pomme de terre, un marquage des plantes douteuses a été effectué en se basant aux symptômes causés par ce virus (figure 21). Egalement, la notation des symptômes a été facilitée par le test Flashkit qui permet une détection immédiate du PVY.

Après le dernier marquage des plantes douteuses, un test ELISA a été effectué pour chaque traitement des quatre variétés. Pour cela, pour chaque traitement des différentes variétés, 8 feuilles ont été prélevées à partir de plantes douteuses, non douteuses, testées par le flashkit avec un résultat négatif et virosées après confirmation par le test flashkit.

Cet essai conduit en pots à l'INAT réside dans deux lots. Le premier est formé de 8 plants de la variété Spunta plantées le 11 mars 2009 dans des pots contenant un mélange de sable et de tourbe. Après 20 jours (émergence complète des plants), des traitements par trois produits inducteurs de la réaction de défense chez les plantes ont été appliqués. Ces produits sont l'Alga Bactéricide, le Dalgin Active et le Ningnan Mycin. Les six traitements effectués par ces produits ont été appliqués par pulvérisation foliaire à raison d'un traitement chaque semaine et ceci de façon à ce que chaque produit soit appliqué à deux plants avec deux témoins non traités. Ce lot a été placé à proximité d'un plant de pomme de terre virosée par le PVY afin de favoriser la transmission du virus aux plantes saines par l'intermédiaire des pucerons vu qu'il s'agit d'un phytovirus qui se transmet selon le mode non persistent de manière mécanique, par microblessure ou par l'alimentation des pucerons surtout le puceron vert du pêcher.

Le deuxième lot est composé de 12 plants des variétés Spunta, Bellini et Océana plantées le 8 avril 2009. Lorsque les plants ont atteints le stade d'émergence complète, des traitements par deux produits, l'Alga Bactéricide avec deux différentes doses (la dose homologuée à l'hectare et la double dose) et la Dalgin active, ont été appliquées. Ces traitements par pulvérisation foliaire, ayant pour but l'induction du système de défense des plantes contre le virus Y de la pomme de terre, ont été réalisés 4 fois à raison d'un traitement par semaine et de sorte à avoir pour chaque variété cultivé un plant témoin, un traité par le Dalgin active, un traité par l'Alga

Bactéricide avec une concentration qui correspond à la dose homologuée à l'hectare et un autre plant traité par l'Alga Bactéricide à la double dose. Pour ce deuxième lot, après le premier traitement, une inoculation artificielle par le PVY a été effectuée. La préparation de l'inoculum PVY consiste à broyer dans un mortier des feuilles virosées par le PVY avec un tampon d'inoculation dilué ainsi qu'une certaine quantité de charbon actif ayant un rôle antioxydant. Le mélange ainsi obtenu sera déposé sur une feuille de chaque plante après avoir mis une certaine quantité de carborundum servant pour l'ouverture de pores au niveau de la feuille sans l'endommager et ceci afin de permettre la pénétration de l'inoculum PVY dans la sève de la plante.

Dans le cadre de l'appréciation de l'efficacité des traitements effectués sur les deux lots, un marquage des plants douteux a été réalisé et ceci en se fondant sur les symptômes caractéristiques causés par ce virus Y de la pomme de terre. Cette évaluation a été aussi guidée par le test flash kit qui permet la détection du virus même sur un plant qui ne présente pas les symptômes de la maladie.

Egalement, l'évaluation de l'action de ces produits a concernée non seulement l'induction de la réaction de défense vis à vis du PVY mais aussi le rendement des plants. C'est pourquoi, des pesées de la végétation ainsi que des tubercules de chaque traitement des quatre variétés a été effectué lors de la récolte.

Les concentrations qui inhibent 50 % de la croissance mycélienne (CI50) ont été calculées après avoir déterminé les équations de régressions. Ces concentrations pourraient nous renseigner sur la dose optimale à appliquer pour chaque produit in vivo ainsi que sur leur mode d'action direct ou indirect sur le champignon. C'est pourquoi l'ensemble des produits testés a été comparé avec des produits de références ayant une action fongitoxique contre les champignons cibles. Il s'agit en fait du Mythos pour le cas du B. cinerea et du Tachigaren pour les champignons du sol notamment Verticillium (Vaa) et Fusarium (Fs, Forl et Fom).

Afin de préciser son action directe ou indirecte sur certains champignons, l'Alga Bactéricide, a été utilisé dans des tests de fongitoxicité. Ceci a été tributaire de la détermination de la valeur de la CI50.

Le tableau 6 représente les CI50 calculées pour le AB ainsi que les produits de référence pour chaque champignon.

Tableau 6 : Différentes valeurs de la CI50 calculées pour les tests de fongitoxicité par AB et par les produits de référence

Selon le tableau 6, la CI50 est très variable d'un champignon à l'autre. Elle est faible pour le cas du champignon aérien B. cinerea en comparaison avec celle du produit de référence, mais très élevée pour le cas du champignon du sol Fusarium solani (Fs).

En effet, dans le cas du B. cinerea, le taux de réduction de la croissance mycélienne s'accroît avec l'augmentation de la concentration du produit AB jusqu'à l'inhibition totale à la dose 987 ppm. Par conséquent, nous pouvons dire que le produit AB présenterait une activité fongitoxique vis-à-vis de B. cinerea mais qui est faible étant donnée que les doses à appliquer in vivo doivent être encore plus élevées que celle in vitro (presque 10 fois la dose obtenue in vitro).

Pour le cas du F. solani, même en augmentant la dose du produit, jusqu'à 8000 ppm, il n'y a pas inhibition de la croissance mycélienne. C'est pourquoi, nous pouvons dire que l'Alga Bactéricide ne présente pas une action directe sur les champignons du sol mais pourrait éventuellement avoir une action indirecte en déclenchant une réaction de défense chez la plante.

En conclusion, l'Alga Bactéricide, à base de bio-iode, pourrait être un produit à action principalement indirecte avec une faible activité fongitoxique. Il permettrait de stimuler les réactions de défense et d'augmenter la résistance de la plante vis-à-vis de B. cinerea et certaines espèces de Fusarium.

La Dalgin Active supposée avoir une action inductrice des réactions de défense chez les plantes agressées par des pathogènes, a été testée in vitro par des tests de fongitoxicité avec certains champignons. Ceci a pour but de voir son action directe ou indirecte en se basant sur la valeur de la CI50.

Le tableau 7 représente les CI50 calculées pour la DA et les autres produits de référence pour chaque champignon.

Tableau 7: Différentes valeurs de la CI50 calculées pour les tests de fongitoxicité par DA et par les produits de référence

différentes entre eux. En effet, pour les deux champignons, l'augmentation de la dose appliquée du produit ne permet pas de réduire le taux de croissance mycélienne. A titre d'exemple, l'addition d'une dose de 50000 ppm au milieu de culture PDA n'a pas permis d'inhiber le développement du champignon aérien B.cinerea (figure 22).

Figure 22 : Test de fongitoxicité de B. cinerea traité par DA (50000 ppm)

Ces résultats ainsi obtenus pourraient confirmer que la Dalgin Active, à base d'algues marines (Ascophyllum nodosum), est un produit à action indirecte. Il permettrait de protéger les cultures contre les agents pathogènes en augmentant le potentiel de défense et de résistance des plantes.

Le Ningnan Mycin, supposée avoir une action indirecte contre les pathogènes, a été testée dans des tests de fongitoxicité avec B. cinerea afin de s'assurer de son mode d'action et ceci en se basant sur la valeur de la CI50.

Les CI50 calculées pour ce produit ainsi que pour celle qui correspond au produit de référence Mythos sont représentées dans le tableau 8.

Tableau 8 : Différentes valeurs de la CI50 calculées pour les tests de fongitoxicité par NM et par le produit de référence Mythos

Pour B. cinerea, en comparaison avec le produit de référence, la valeur de la CI50 calculée pour le NM est très élevée. En effet, l'augmentation de la dose du produit additionnée au milieu de culture PDA n'a aucun effet inhibiteur sur la croissance mycélienne. Ceci est confirmé par la présence d'une courbe de régression linéaire constante à un pourcentage de 90% de la croissance mycélienne par rapport au témoin (annexe1).

C'est pourquoi, nous pouvons dire que le Ningnan Mycin, à base de maïs et de soja, pourrait être un produit ayant une action indirecte sur les pathogènes en induisant une réaction de défense et stimulant les mécanismes de défense naturels de la plante.

Dans le but de caractériser son activité fongitoxique, le Zytroseed a été testé dans des tests de fongitoxicité servant pour la détermination de la valeur de la CI50. Les valeurs calculées pour ce produit ainsi que pour les produits de référence correspondant à chaque champignon sont présentés dans le tableau 9.

Tableau 9 : Différentes valeurs de la CI50 calculées pour les tests de fongitoxicité par Zy et par les produits de référence

Produit Champignon	CI 50 de Zy (mg/l)	CI 50 de My (mg/l)	CI 50 de Tach (mg/l)
BCF1.09	253	1	-
Fss	397	-	1,43
Forl (IT)	575	-	1,84
Fom (C)	243		1,27
Vaa (IF)	-	-	1,64

Selon le tableau 9, les valeurs de la CI50 enregistrées changent d'une espèce fongique à une autre mais elles sont tous faibles en comparaison avec les valeurs obtenues pour les produits de référence. Concernant Verticillium albo atrum, la valeur de la CI50 pourrait être comprise entre 10 et 50 ppm vu que même une dilution de 20 fois la dose recommandée a permis une réduction de la croissance mycélienne.

Figure 23 : Test de fongitoxicité par le produit Zytroseed avec le Verticillum

Selon les courbes de régression de tous ces champignons (annexe1), l'augmentation de la dose du produit utilisée conduit à une réduction appréciable du pourcentage de la croissance mycélienne jusqu'à une inhibition totale à une certaine dose qui varie d'un champignon à l'autre. A titre d'exemple, l'inhibition totale du champignon aérien B. cinerea in vitro a été enregistrée à la dose recommandée (2000 ppm) (figure 24).

Figure 24: Inhibition totale de la croissance mycélienne de B.cinerea à la dose recommandée à
l'hectare (2000 ppm)

Nous concluons alors que le Zytrossed, qui est extrait de pépins de fruits et qui contient des substances naturelles telles que l'acide ascorbique et l'acide citrique, présenterait une activité fongitoxique directe sur les champignons en inhibant leur croissance.

Après avoir caractériser l'activité fongitoxique in vitro des différents produits biologiques, un premier test d'évaluation de leur effet in vivo sur l'induction de la réaction de défense a été effectué. Ce test consiste à des inoculations artificielles par le champignon B. cinerea réalisés sur des feuilles de tomate, de melon et de vigne. 35

L'inoculation des feuilles détachées de tomate par B.cinerea a été effectué 24h, 48h et 72h
après un traitement préventif du feuillage sur les plantules par les produits Alga Bactéricide,
Dalgin Active et l'acide salicylique qui est utilisé comme un témoin positif puisqu'il est

connu par son action inductrice des réactions de défense chez la plante. Le suivi des nécroses causées par ce pathogène durant les trois jours post inoculation consiste à des mesures du 2 diamètre des nécroses au niveau des feuilles.

Les résultats ainsi obtenus pour les trois inoculations effectuées nous a permis de construire
les courbes qui illustrent l'action de chaque produit, en comparaison avec le témoin non traité,

sur l'évolution au cours du temps des diamètres de nécroses. 1.2.1.1. Action des produits après 24h du traitement

La figure 25 montre l'évolution au cours du temps des diamètres de nécroses causés par le
champignon aérien B. cinerea sur des feuilles de tomate prélevées à partir de plantules traités
par différents produits avant 24h de l'inoculation. Nous remarquons que les nécroses causées

sur les feuilles témoins ainsi que celles causées au niveau des feuilles traitées suivent une
évolution pareille. Au cours du premier jour qui suit l'inoculation, nous ne marquons aucune
nécrose au niveau de toutes les feuilles inoculées. Alors qu'à partir du deuxième jour post

inoculation, il y a un élargissement progressif des surfaces des nécroses pour toutes les
feuilles. Ces nécroses sont en fait plus importantes au niveau des feuilles témoins. Alors que

le diamètre de nécroses le plus petit a été enregistré au niveau des feuilles traitées par la Dalgin Active.

Figure 26 : Evolution des nécroses causées par B.cinerea sur des feuilles de tomate après

Les courbes correspondantes aux diamètres de nécroses au niveau des feuilles témoins et celles préalablement traitées par les différents produits suivent une même trajectoire. En fait, l'apparition des nécroses a été enregistrée à partir du deuxième jour post inoculation et une évolution du diamètre des nécroses pour toutes les feuilles inoculées et surtout celles non traitées a été notée.

Le traitement des plantules par l'Alga Bactéricide et la Dalgin Active a permis une faible
réduction des nécroses en comparaison avec le témoin positif correspondant au traitement des

feuilles par l'acide salicylique. Ce dernier a permis une réduction considérable des nécroses grâce à son effet inducteur de la réaction de défense.

Les mesures des diamètres de nécroses causés par B. cinerea sur des feuilles de tomate qui ont

été traitées 72 h avant l'inoculation sont représentées par les courbes illustrées dans la figure 30.

Figure 27 : Evolution des nécroses causées par B.cinerea sur des feuilles de tomate après 72 h
d'un traitement préventif

Selon la figure 27, nous constatons que l'évolution au cours du temps des diamètres de nécroses des feuilles traitées et non traitées est similaire. En effet, l'élargissement des surfaces nécrosées au niveau des feuilles commence à partir de la deuxième journée qui suit l'inoculation artificielle. De plus, nous notons que les feuilles traitées par les différents produits présentent des diamètres de nécroses qui sont très proches de ceux enregistrés au niveau des feuilles prélevées à partir des plantules témoins.

En conclusion, la sévérité des nécroses enregistrée au niveau des feuilles de tomate traitées par les produits Alga Bactéricide et Dalgin Active au niveau des trois dates d'inoculation est similaire à celle des feuilles témoins. C'est pourquoi, nous pouvons affirmer l'absence d'une différence entre les nécroses dues au B. cinerea sur les feuilles de tomate pour les différents traitements et les dates d'inoculation. Ceci pourrait être dû aux faibles doses appliquées lors du traitement foliaire ainsi que les conditions expérimentales. Egalement, il faut noter que

l'acide salicylique nécessiterait une période de 48h après son application pour induire une réaction de défense chez la plante. Ainsi, une augmentation des doses appliquées pourrait améliorer l'action de ces produits en induisant une réaction de défense et rendant la plante plus résistante au pathogène.

Pour les deux variétés de vigne utilisées dans cette étude, des traitements préventifs ont été effectués par le Dalgin Active (à la double dose qui est appliquée à l'hectare), l'Alga Bactéricide, le Codaphos cuivre et l'acide salicylique. Afin d'évaluer leur efficacité in vivo dans l'induction de la réaction de défense, des inoculations foliaires ont été effectuées d'une part par un implant mycélien et d'autre part par une suspension sporale de B. cinerea de concentration égale à 1 0⁷spores/ml.

1.2.2.1. Action des produits suite à l'inoculation par un implant mycélien de B.cinerea L'inoculation artificielle, par implant mycélien, des feuilles détachées de vigne a été réalisée après 48 h et 72 h du traitement pour les deux variétés.

Le suivi du test consiste à mesurer les diamètres de nécroses causées par ce champignon au niveau de chaque feuille. Ainsi, les résultats obtenus sont illustrés dans le tableau 10.

Tableau 10 : Diamètres de nécroses mesurés après trois jours de l'inoculation

		Te	AB	DA 2D	COCU	AS
48 h post traitement	Red Globe	1,43	1,43	1, 1	-	-
48 h post traitement	Muscat d'Italie	1,86	-	1,16	0,96	2
72 h post traitement	Red Globe	1,16	0,91	0,8	-	-
	Muscat d'Italie	1,2	-	0,86	0,7	1,4

Le tableau 10 représente les diamètres de nécroses mesurés après trois jours de l'inoculation des feuilles de deux variétés de vigne, par implant mycélien de Botrytis, et ceci après 48h et 72h du traitement.

Concernant l'inoculation réalisée après 48h du traitement, nous remarquons qu'il y a une
différence entre les diamètres de nécroses mesurées au niveau des feuilles témoins non
traitées et celles traitées par les différents produits excepté l'acide salicylique et l'Alga

Baxtéricide pour la variété Muscat d'Italie. En effet, pour le cas de la variété Red Globe, l'utilisation de la double dose de Dalgin Active a permis de réduire les surfaces de pourriture. Cependant, les traitements avec l'acide salicylique et l'Alga Bactéricide n'ont pas pu empêcher la pourriture des feuilles.

Alors que pour le cas de la variété Muscat d'Italie, les traitements avec la Dalgin Active à la double dose et surtout avec le Codaphos cuivre ont permis une réduction considérable des diamètres de nécrose en comparaison avec le témoin (figure 28).

Figure 28 : Test d'inoculation foliaire par implant mycélien des feuilles de vigne de la variété
Muscat d'Italie

En ce qui concerne l'inoculation réalisée après 72h du traitement, tous les produits appliqués ont pu inhibé le développement des nécroses au niveau des feuilles des deux variétés en comparaison avec le témoin non traité excepté l'acide salicylique. De plus, nous constatons que le Codaphos cuivre ainsi que lA Dalgin Active à la double dose ont permis une réduction encore plus importante après 72h de leur application qu'après 48h.

Donc, l'augmentation de la dose du Dalgin Active permettrait d'induire une réaction de défense chez la plante et par conséquent d'augmenter la résistance de la plante vis-à-vis du champignon.

De plus, pour la vigne, le Dalgin Active à la double dose, l'Alga Bactéricide et le Codaphos cuivre nécessiteraient une période de 72h pour une meilleure action contre B. cinerea.

Alors que concernant l'acide salicylique, l'absence de son action inductrice de la réaction de
défense pourrait être due à plusieurs facteurs. En effet, la dose appliquée (5mM) pourrait être

insuffisante pour permettre à la plante de réagir face aux pathogènes en déclenchant une
réaction de défense. Egalement, la période nécessaire pour que l'acide salicylique ait une
meilleure action contre les stress de type biotique pourrait être plus longue que 72h de la date

du traitement. Finalement, l'état physiologique des plantes lors du traitement pourrait
également influencer l'efficacité de l'action inductrice de la réaction de défense engendrée par

1.2.2.2. Action des produits suite à l'inoculation par une suspension sporale de B. cinerea

Une inoculation artificielle des feuilles détachées de vigne, de la variété Muscat d'Italie, par une suspension sporale de B. cinerea, a été réalisée après 72 h du traitement.

Le suivi du test consiste à mesurer les diamètres de nécroses causées par ce champignon au

niveau de chaque feuille. Ainsi, les résultats obtenus ont été portés sur la courbe suivante (figure 29).

Figure 29 : Evolution des nécroses causées après inoculation par suspension sporale de B.
cinerea sur des feuilles de vigne après 72 h d'un traitement préventif

Selon la figure 32, nous remarquons qu'il y a une différence entre les nécroses causées au niveau des feuilles traitées et ceux non traitées ainsi qu'entre les deux traitements effectués. En fait, l'application du Dalgin Active à la double dose a permis une réduction considérable des diamètres de nécroses. Alors que pour le Codaphos cuivre, ce dernier a inhibé totalement le développement des pourritures.

Ceci confirme alors les résultats enregistrés pour le cas de l'inoculation par implant mycélien. Par conséquent, pour la vigne une augmentation de la dose recommandée de la Dalgin Active pourrait stimuler le système de défense de la plante après une période de 72h de son application et la rendre plus résistante vis-à-vis des agressions des pathogènes. De plus, l'inhibition de développement des nécroses noté pour le COCU pourrait être expliqué par sa double action systémique et par contact.

Afin d'évaluer l'efficacité des produits utilisés sur des plantules, différents tests d'inoculation foliaire et racinaire ont été effectués.

Le test d'inoculation par une suspension sporale de B. cinerea sur des plantules de tomate et de melon a été réalisé sur trois types de traitements différents. Il s'agit en fait, d'un traitement préventif, un traitement au même jour de l'inoculation foliaire et un autre curatif trois jours après l'inoculation. Les traitements ont été effectués par pulvérisation foliaire par les produits Switch, comme un fongicide témoin, le Zytroseed, la Dalgin Active et l'acide salicylique comme un témoin positif pour l'induction de la réaction de défense.

Après une semaine de l'inoculation artificielle par B. cinerea, nous avons remarqué que la taille des plantules varie sur la même plaque alvéolée. En fait, les plantules témoins ont gardées la même taille et le même nombre de feuilles. Alors que les autres plantules traitées surtout par le switch, le Zytroseed et la Dalgin Active ont continué à croître d'une façon normale pour les trois types de traitement (figure 30).

Figure 30: Effet des différents traitements sur la taille des plantules après inoculation par B.
cinerea

Egalement, nous avons constaté que les plantules traitées en curatif par l'acide salicylique sont toutes mortes avec développement d'une pourriture grise caractéristique du B. cinerea (figure 31). Ceci pourrait être expliqué par le fait que l'acide salicylique agit dans l'induction de la réaction de défense seulement s'il est appliqué en préventif.

Figure 31 : Evolution des symptômes de la pourriture grise après un traitement curatif par
l'acide salicylique

La mesure de la taille de toutes les plantules inoculées au niveau des différents types de traitements, nous a permis de tracer l'histogramme suivant.

Figure 32 : Taille moyenne des plantules pour chaque type de traitement et de produit

La différence entre la taille des plantules témoins inoculées et celles inoculés et traitées par les différents produits pourrait être expliquée par le fait que le champignon a inhibé le bourgeon de la croissance végétative, ce qui a provoqué un blocage des plantules à leur stade actuel de développement végétatif le jour de l'inoculation. Egalement, le bon état végétatif des plantules traitées par le Zytroseed et la Dalgin Active par rapport aux plantules traitées par l'acide salicylique peut être expliqué par l'action stimulatrice des produits sur la croissance végétative.

Concernant l'inoculation des plantules de melon, les résultats n'étaient pas interprétables vu que les symptômes n'ont pas apparus au niveau des plantules témoins non traitées et inoculées. Ces résultats pourraient être dus à plusieurs facteurs. En fait, le changement des conditions climatiques au cours du suivi du test, en déplaçant les plantules inoculées dans une chambre de culture où la lumière et la température sont différentes de celles dans la serre vitrée, pourrait perturber le métabolisme de la plante et par conséquent un mauvais état physiologique des plantules aurait influencer le développement des symptômes.

Afin de voir les symptômes caractéristiques de certains champignons telluriques sur la tomate
et le melon, plusieurs tests préliminaires d'inoculation racinaire par trempage et par irrigation

ont été effectués. Ces tests nous ont permis de noter des symptômes de chlorose et de flétrissement sévère ainsi que des pourritures au niveau du collet pour le cas du Fusarium après un minimum de 15 jours après l'inoculation (figure 33 et 34).

Figure 33 : Symptômes causés par le Forl Figure 34 : Symptômes causés par le Fom

Concernant l'évaluation de l'action préventive et curative des produits utilisés dans cette étude, des tests d'inoculation artificielle par irrigation d'une suspension sporale de Fusarium (Forl et Fom) et de Verticillium (Vaa) sur des plantules de tomate et de melon ont été effectués. Ces inoculations ont été réalisées sur trois types de traitements différents : un traitement préventif une semaine avant l'inoculation, un traitement le jour même de l'inoculation racinaire et un autre curatif une semaine après l'inoculation. Ces traitements ont été effectués par irrigation des produits Codaphos cuivre et Zytroseed.

Après trois semaines de l'inoculation par Fusarium oxysprum f.sp. radicis-lycopersici (Forl), l'évaluation selon une échelle de notation du degré d'attaque du champignon sur chaque type de traitement et de produit nous a permis de calculer l'indice d'attaque correspondant. Le tableau 11 récapitule les résultats ainsi obtenus.

Produit	Traitement	Indice d'attaque (%)
Témoin	-	33
Codaphos cuivre	Préventif	6,66
	Le jour de l'inoculation	12
	Curatif	20
Zytroseed	Préventif	28
	Le jour de l'inoculation	30
	Curatif	23,33

Selon le tableau 11, nous remarquons qu'il y a une différence entre l'indice d'attaque de la maladie correspondant aux plantules témoins non traitées et celui des plantules qui ont été irriguées par les deux produits Codaphos cuivre et Zytroseed.

En effet, pour le Codaphos cuivre, nous avons constaté qu'en appliquant les traitements une semaine avant l'inoculation par le Forl, l'indice de la maladie est très faible en comparaison avec le traitement qui a été effectué le même jour de l'inoculation et surtout le curatif dont l'indice de la maladie est de 20 %. Par conséquent, ce produit doit être appliqué en préventif pour une meilleure action sur le pathogène. Alors que pour le Zytroseed, une meilleure action a été enregistrée avec le traitement curatif avec un indice d'attaque de 23,3 %. Ceci s'explique par l'action fongitoxique directe sur le pathogène.

Concernant les tests d'inoculation sur melon, les résultats obtenus n'étaient pas interprétables vu que les symptômes caractéristiques de chaque champignon notamment Fusarium et Verticillium n'ont pas apparus sur les plantules témoins. Ces résultats pourraient être dus aux conditions expérimentales.

Dans le but d'évaluer l'effet des produits biologiques testés sur l'induction de la réaction de défense des plants de la pomme de terre contre les virus, des essais en pot ont été menés à l'INAT et des essais en plein champ ont été menés à la station expérimentale du GIL à Korba.

Pour le premier lot, des évaluations visuelles quotidiennes des symptômes causées par le virus Y de la pomme de terre ont été effectuées. Ces évaluations ont été facilitées par les tests flashkit qui permettent une détection immédiate de la presence du virus. Les résultats de ces évaluations sont récapitulés dans le tableau 12.

Tableau 12 : Résultats des évaluations visuelles et avec flashkit du lot n°1

	Te1	Te2	AB1	AB2	DA1	DA2	NM1	NM2
1ère évaluation	-	-	- Test flashkit	-	- Test flashkit	-	-	-
2ème évaluation + 1er Traitement	-	-	-	-	-	-	-	-
3ème évaluation + 2ème Traitement	+ Test flashkit	-	- Test flashkit	-	- Test flashkit	-	- Test flashkit	-
4ème évaluation + 3ème Traitement	+	-	-	-	-	-	-	-
5ème évaluation + 4ème Traitement	+	-	-	-	-	-	-	-
6ème évaluation+ 5ème Traitement	+	-	-	- Test flashkit	-	- Test flashkit	-	- Test flashkit
7ème évaluation+ 6ème Traitement	+	- Test flashkit	-	-	- Test flashki	-	-	-

D'après le tableau 12, après le premier traitement des plants de pomme de terre, un plant témoin non traité a été marqué comme douteux. La confirmation de l'attaque virale a été facilitée par un test flashkit qui nous a renseigné sur la présence du virus PVY (figure 35).

Pour les autres plants, durant la période de traitement, nous n'avons pas révélé la présence de symptômes du virus. De plus, les tests flashkit effectués ont donné des résultas négatifs.

Ces résultats ainsi obtenus pourraient être expliqués soit par l'action protectrice des produits utilisés en induisant la réaction de défense et empêchant la transmission du virus de la plante virosée à la plante saine par l'intermédiaire des pucerons, soit à l'absence de contamination.

Concernant le deuxième lot, une inoculation artificielle par le PVY a été effectuée sur tous les plants après le premier traitement. Toutefois, aucun symptôme d'infection virale n'a été marqué pour toutes les variétés. De plus, des tests flashkit qui ont été opérés sur tous les plants de la variété Spunta ont donnés des résultats négatifs. Ceci pourrait être dû à des contraintes expérimentales lors de l'infection artificielle.

En ce qui concerne le suivi de l'effet des traitements effectués en plein champ sur l'induction de la réaction de défense des plants de pomme de terre vis-à-vis des virus et surtout le PVY, un marquage des plants douteux a été effectué en se basant sur l'évaluation visuelle des symptômes caractéristiques de PVY ainsi que sur des tests flashkit. Les résultats des trois évaluations réalisées sont résumés dans le tableau 13.

Tableau 13: Evaluations visuelles et avec flashkit des plants douteux en plein champ

Variété	Traitement	Pourcentage des plants douteux (%)
Variété	Traitement	1ère évaluation (après 3 traitements)	2^ère évaluation (après 4 traitements)	3^ère évaluation (après 5 traitements)
Spunta	Te	8,33	30,55	36,11
	AB	8,33	22,22	25
	DA	2,77	11,11	13,88
	Traitements confondus	6,47	21,29	24,99
Atlas	Te	0	0	0
	AB	0	0	0
	DA	0	0	0
	Traitements confondus	0	0	0
Bellini	Te	0	0	0
	AB	4,76	4,76	9,52
	DA	0	0	0
	Traitements confondus	1,58	1,58	3,17
Océana	Te	9,52	9,52	19,04
	AB	19,04	19,04	19,04
	DA	0	0	0
	Traitements confondus	9,52	9,52	12,69

En comparant les deux traitements effectués avec le témoin au niveau de chaque variété de pomme de terre, nous remarquons qu'il n'y a pas de différence notable. En fait, pour la variété Bellini, aucun plant témoin douteux n'a été marqué alors que 9,52 % des plants traités par l'Alga Bactéricide sont douteux. Cependant, la comparaison des pourcentages d'attaque par le PVY au niveau de chaque variété, montre qu'il y a une différence importante (figure 36).

Figure 36 : Pourcentages d'attaque par le PVY des quatre variétés selon l'évaluation visuelle

D'après la figure 39, nous constatons que selon l'évaluation visuelle, la majorité des plants marqués comme douteux est de la variété Spunta qui est la plus cultivée en Tunisie avec un pourcentage de 72,97%. Concernant les autres variétés, un nombre moyennement faible de plants douteux ont été marqués. En fait, 21,62 % des plants présentant les symptômes du PVY sont de la variété Océana alors que seulement 5,4 % sont de la variété Bellini. Cependant aucun plant de la variété Atlas n'a été révélé comme douteux.

Après le dernier traitement, un prélèvement aléatoire d'échantillons de feuilles à partir de 8 plants de chaque traitement pour les quatre variétés a été effectué et ceci afin de préciser les pourcentages d'attaque par les viroses avec un test plus fiable qui est le test ELISA. Les résultas ainsi obtenus sont récapitulés au niveau du tableau 14.

Tableau 14 : Résultats du test ELISA sur les quatre variétés avec les différents traitements

Variété	Traitement	Pourcentage des plants virosés par le PVY	Pourcentage des plants virosés par le PVX	Pourcentage des plants virosés par le PLRV
Spunta	Te	50	0	12,5
	AB	25	0	0
	DA	87,5	0	12,5
	Traitements confondus	54,16	0	8,33
Atlas	Te	0	12,5	0
	AB	0	12,5	0
	DA	25	12,5	12,5
	Traitements confondus	8,33	12,5	4,16
Bellini	Te	12,5	0	0
	AB	25	0	0
	DA	0	0	0
	Traitements confondus	12,5	0	0
Océana	Te	50	0	0
	AB	37,5	0	0
	DA	0	0	0
	Traitements confondus	29,16	0	0

D'après les résultats du test sérologique ELISA, nous remarquons qu'il n'y a pas une différence entre les plants traités par l'Alga Bactéricide et le Dalgin Active avec ceux non traité pour toutes les variétés confondues. Cependant, en comparant les pourcentages d'attaque des quatre variétés testées, nous constatons qu'il y a une différence au niveau de la sensibilité de chaque variété au PVY (figure 37).

Figure 37 : Pourcentages d'attaque par le PVY des quatre variétés selon le test ELISA

En fait, sur l'ensemble des plants virosés qui ont été détectés par le test ELISA, 52 % appartiennent à la variété Spunta. Ceci peut confirmer que cette variété est la plus sensible au virus Y de la pomme de terre comparé aux autres variétés. De plus, nous constatons que la variété Océana est moyennement sensible au PVY vu que 28 % des plants virosés appartiennent à cette variété. Pour les deux autres variétés Bellini et Atlas, ils peuvent être classées comme étant résistantes au PVY surtout la variété Atlas vu que seulement deux échantillons sont virosés.

Concernant la sensibilité des différentes variétés aux autres virus notamment le PVX et le PLRV, nous avons remarqué que la variété Atlas est la seule qui a été attaqué par le PVX avec un pourcentage de 12,5% sur l'ensemble de plants analysés par le test ELISA. Alors que pour le PL RV, ce virus a été détecté chez les deux variétés Spunta et Atlas avec des pourcentages faibles qui sont respectivement 8,33 et 4,16%.

Par conséquent, il est à signalé que la sensibilité de la variété Spunta au virus PVY qui est le virus le plus préjudiciable pourrait être expliqué par le fait que cette variété la plus communément cultivée dans les régions de culture de la pomme de terre devienne de plus en plus sensible au virus en question.

Dans le but de caractériser l'effet des traitements effectués sur l'état végétatif des plants de pomme de terre des quatre variétés testées, des pesées de la végétation des plants de chaque traitement a été réalisé à la récolte. Les résultats ainsi obtenus par ligne ont été estimés par rapport à l'hectare en tenant compte d'une densité de 30000 plants/ha (figure 38).

Figure 38 : Poids végétatif total des plants des quatre variétés de pomme de terre en fonction des
traitements appliqués

D'après la figure 41, nous remarquons que pour toutes les variétés testées, le poids végétatif des plants témoins est supérieur à ceux traités. Ceci pourrait être expliqué par le fait que les produits ayant un effet inducteur de la réaction de défense pourraient avoir une action freinante de la croissance végétative des plants dans les conditions de l'expérimentation.

En comparant les plants témoins des quatre variétés, nous remarquons que les trois variétés Atlas, Bellini et Océana ont des poids végétatifs plus importants que la variété Spunta. Cette différence serait due à la précocité de cette dernière par rapport aux autres variétés et de l'effet des attaques du mildiou qui ont endommagés la végétation des plants de la variété Spunta.

Afin d'apprécier l'effet des produits utilisés sur le rendement, des pesées du poids des tubercules de chaque traitement des quatre variétés a été effectué lors de la récolte. Les résultats obtenus par ligne ont été estimés par rapport à l'hectare en tenant compte d'une densité de 30000 plants/ha (figure 39).

Figure 39 : Poids total des tubercules des quatre variétés de pomme de terre en fonction des
traitements appliqués

Nous constatons à partir de la figure 39 que pour toutes les variétés sauf Spunta, le poids total des tubercules des plants témoins est supérieur à ceux qui ont été traités par les deux produits AB et DA. Ce résultat pourrait être expliqué par le faite que le faible poids végétatif, qui pourrait être la conséquence de l'action freinante des produits inducteurs de la réaction de défense, aurait un impact sur le rendement des plantes.

En comparant entre les quatre variétés, la variété Spunta a le rendement le plus faible. Ceci pourrait être dû à l'impact des attaques virales sur le rendement de cette variété qui a été la plus sensible. En fait, l'attaque par le PVY aurait engendré des pertes de rendement vu que la plante affaiblie devienne incapable de produire des tubercules de gros calibre.

Induction de la réaction de défense chez les plantes pour lutter contre les maladies

Introduction générale

Chapitre 1 :