Alternative à la résistance aux pyréthrinoà¯des au Burkina Faso: évaluation des activités insecticides et répulsives-irritantes d'huiles essentielles de plantes locales seules et en combinaison sur les populations de anopheles gambiae et de aedes aegypti (diptera: culicidae)

PARTIE 2 : METHODOLOGIE GENERALE

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Cette partie présente la description des sites de collectes larvaires, des sites de récolte des différentes plantes, ainsi que le matériel biologique (animal et végétal) et le matériel expérimental. Il décrit aussi les différentes méthodes d'extraction des HE et les tests statistiques qui ont été réalisés sur les données obtenues lors de cette étude. Les travaux de cette thèse se sont déroulés sur trois années consécutives (2019, 2020 et 2021).

2- 1. Cadre d'étude

Cette étude a été menée au Burkina Faso, pays situé au coeur de l'Afrique de l'Ouest. Le Burkina Faso s'étend sur une superficie de 274 200 km² (INSD 2020). Son réseau hydrographique assez important est constitué de trois bassins principaux : les bassins de la Volta, de la Comoé et du Niger. Le bassin de la Volta s'étend au Centre et à l'Ouest du pays sur une superficie de 178 000 km² (INSD 2020). Il est constitué par trois sous-bassins majeurs : le Mouhoun, le Nakambé et le Nazinon. Le bassin de la Comoé draine l'extrémité Sud-Ouest du pays sur un bassin versant de 18 000 km² comprenant de nombreux affluents (INSD 2020). Le bassin du Niger draine le Nord-Est et l'Est du pays avec un bassin versant de 72 000 km². Les cours d'eau du Burkina Faso, à l'exception du Mouhoun et de ceux du Sud-Ouest (bassin de la Comoé), sont temporaires et ne coulent que de juillet à octobre (INSD 2020).

Le Burkina Faso a un climat tropical sec où s'alternent deux saisons : une longue saison sèche (d'octobre à avril) et une courte saison pluvieuse (de mai à septembre). Le climat tropical sec est subdivisé en trois zones climatiques qui sont :

· la zone sahélienne au Nord avec moins de 600 mm de pluviométrie par an et des amplitudes thermiques élevées (15 à 45°C) ;

· la zone soudano-sahélienne au centre avec une pluviométrie qui varie entre 600 et 900 mm par an et des températures moyennes variant entre 28 et 30°C ;

· la zone soudano-guinéenne à l'Ouest où les précipitations varient de 900 à 1200 mm par an avec des températures moyennes inférieures à 28°C.

Pays en voie de développement, le Burkina Faso est un pays où l'agriculture représente 32% du produit intérieur brut (PIB) et occupe 80% de la population active (INSD 2020). Les pratiques agricoles regroupent principalement les cultures de rente (coton, arachide, sésame, canne à sucre, anacarde, etc.), les cultures céréalières (sorgho, mil, maïs et riz) et les cultures maraîchères de contre-saison (INSD, 2020). En plus de l'agriculture, d'autres activités sont

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pratiquées par les populations notamment la pisciculture, l'élevage et la sylviculture (INSD, 2020).

La province du Houet, située dans la zone soudano-guinéenne, est un carrefour et l'une des grandes zones industrielles du pays. Bobo-Dioulasso est le chef-lieu de la province et Bama (Vallée du Kou), l'un de ses départements où l'agriculture est l'activité principale de la population cause à des aménagements hydro-agricoles.

Les travaux de cette thèse ont été réalisés dans la région des Hauts-Bassins du Burkina Faso (Figure 10).

Les prospections larvaires pour An. gambiae ont été effectuées dans la Vallée du Kou (Bama) et dans divers quartiers de Bobo Dioulasso pour Ae. aegypti.

La Vallée du Kou (VK) (11°24'N et 4°24'O) est située à une trentaine de kilomètres au Nord de Bobo-Dioulasso (Figure 10). La température moyenne annuelle y est de 27,7°C et les précipitations sont en moyenne de 900,8 mm par an (INSD, 2020). C'est une zone rizicole aménagée depuis 1972, composée de sept (7) quartiers rizicoles avec une population estimée à environ 85.798 habitants sur une superficie de 1.500 ha (INSD, 2020).

En raison du système d'irrigation et de la disponibilité en eau, les casiers rizicoles dans la Vallée du Kou créent en permanence des gîtes très productifs aux culicidés. D'autres gîtes temporaires favorables aux Anophèles, composés de dépressions et de retenues d'eau, s'y ajoutent pendant la saison des pluies. Plusieurs études menées dans la commune de Bama ont confirmé la résistance des vecteurs du paludisme aux pyréthrinoïdes et au DDT avec des fréquences de la mutation kdr-L1014F quasiment fixées (Dabiré et al., 2008; M. Namountougou et al., 2019).

Bobo-Dioulasso (11°11'N et 4°17'O), situé à environ 360 kilomètres de Ouagadougou, est la capitale économique du Burkina Faso et la deuxième grande ville en population après Ouagadougou. C'est la capitale de la région des Hauts-Bassins et le chef-lieu de la province du Houet. A cause de l'essor démographique, les gîtes de Ae. aegypti se sont développés dans la ville de Bobo-Dioulasso aussi bien dans les domiciles que dans les services. D'après une enquête menée en 2015 par Fournet F. et al., les Indices de Breteau (nombre de maisons avec gîtes positifs pour 100 maisons) sont plus élevés à Bobo-Dioulasso avec des gîtes positifs plus fréquents dans l'ensemble des quartiers visités. Des études ont montré la résistance des vecteurs de la dengue aux insecticides chimiques dans cette localité (Ouattara et al., 2019; Namountougou et al., 2020).

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Le choix de ces sites se justifie en grande partie par la situation de résistance des moustiques aux insecticides chimiques.

Figure 10: Présentation des sites d'études

2- 2. Matériel

2- 2.1. Matériel végétal

Le matériel végétal est constitué des feuilles de plantes de Eucaluptus camaldulensis, de Cymbopogon nardus, de Cymbopogon citratus, de Lippia multiflora et de Ocimum americanum (Figure 11). Les cinq plantes ont été choisies tout d'abord en raison des informations provenant de personnes interrogées dans les régions étudiées ainsi qu'à partir de la littérature.

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Les spécimens ont été identifiés et conservés à l'Herbier de l'Université Joseph KI-ZERBO. Lesdites feuilles ont été récoltées dans le mois de juillet 2019 dans le jardin de l'Institut de Recherche en Sciences Appliqués et Technologies (IRSAT) (Tableau I).

Tableau I: Les espèces végétales dont les feuilles ont été collectées dans le jardin de l'IRSAT pour l'extraction des huiles essentielles

Espèces végétales	Familles botaniques
Eucalyptus camaldulensis	Myrtaceae
Cymbopogon nardus	Poaceae
Cymbopogon citratus	Poaceae
Lippia multiflora	Verbenaceae
Ocimum americanum	Lamiaceae

Cymbopogon nardus

Cymbopogon citratus

Eucalyptus camaldulensis

Lippia multiflora Ocimum americanum

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Figure 11: Les plantes dont les huiles essentielles ont été extraites (Cliché Balboné, 2019)

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2- 2.2. Matériel animal : les souches de moustiques

Quatre souches de moustiques ont été testées :

o les souches sensibles : Kisumu qui est la souche de référence de An. gambiae originaire du Kenya et Bora Bora qui est la souche de référence de Ae. aegypti. Ces deux souches ont été élevées à partir des oeufs à l'insectarium de l'Institut de Recherches en Sciences de la Santé / Direction Régionale de l'Ouest (IRSS/DRO) en collaboration avec le Centre MURAZ de Bobo-Dioulasso ;

o les souches de terrain de An. gambiae et de Ae. aegypti, populations naturelles résistantes aux pyréthrinoïdes collectées respectivement à la Vallée du Kou et à Bobo-Dioulasso.

2- 2.3. Matériel physique

2- 2.3.1. Matériels d'extraction des huiles végétales

Les huiles essentielles ont été extraites à partir des feuilles par hydrodistillation avec un appareil de type Clevenger (Schott DURAN, Allemagne) (Figure 12) au laboratoire des substances naturelles de l'IRSAT. Une balance a été utilisée pour le pesage des différentes feuilles avant l'extraction. En effet, deux cents (200) grammes de matériel végétal frais découpé en petits morceaux ont été mis dans le ballon contenant 1200 ml d'eau (Akrout, 2004). Puis, le mélange contenu dans le ballon a été porté en ébullition pendant trois heures (3h).

Après une montée de la vapeur dans le tube jusqu'au réfrigérant, le condensat a été recueilli dans la burette. L'opération a été répétée trois fois. Les huiles essentielles ont été ensuite collectées par décantation et séchées sur du sulfate de sodium Anhydre. Des bouteilles ont servi à la conservation des différentes HE. Le rendement en huile essentielle (R%) est défini comme étant le rapport de la masse de l'huile essentielle obtenue sur la masse de la matière végétale fraiche (Kpatinvoh et al., 2017). Le rendement est exprimé en pourcentage (%) est calculé par la formule suivante :

R% = (Mh / Ms) x 100 où Mh est la masse d'huile essentielle obtenue et Ms, la masse de matière végétale utilisée.

réfrigérant tube tube de retour ballon burette à robinet en verre

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Figure 12: Clevenger pour extraction d'huiles essentielles (Cliché Balboné, 2019)

2- 2.3.2. Matériels pour l'élevage des larves et adultes de An. gambiae et de Ae. aegypti

Il s'agit :

o des farines de croquettes de chat (TetraMinBaby®) et du jus sucré : ils ont servi respectivement à nourrir les larves et les adultes des moustiques d'études ;

o des gobelets en plastiques transparents pour contenir les nymphes dans les cages ;

o du ruban adhésif pour l'étiquetage des bacs ;

o des bacs voilés de moustiquaire contenant l'eau pour l'élevage des larves d'études ;

o des cages couvertes de moustiquaire pour l'élevage des adultes.

2- 2.3.3. Matériels pour les tests bio-essais.

Il s'agit :

o de l'alcool 70% pour le nettoyage de la paillasse et des tubes OMS

o des tubes OMS ;

o de l'acétone pour la dilution des HE ;

o du papier whatman ;

o des pipettes et micropipettes pour la dilution des HE ;

o du papier aluminium pour la conservation des papiers imprégnés.

2- 3. Méthodes

2- 3.1. Collecte larvaire et élevage des moustiques

Les larves ont été collectées entre août et octobre des années 2019 et 2020 dans les rizières et les retenues d'eaux entre les maisons dans la vallée du Kou pour An. gambiae (Figure 13A) et dans des pneus et des récipients abandonnés dans différents milieux urbains de Bobo-Dioulasso pour Ae. aegypti (Figure 13B), à l'aide d'une louche par la méthode standard de « dipping ». Les larves collectées ont été traitées et mises dans des bidons de 1,5L pour être transportées à l'insectarium de l'IRSS/Centre Muraz.

A l'insectarium, en fonction des sites de collectes, les larves ont été mises dans des bacs d'élevage contenant 1 litre d'eau de source pour environ 200 larves (Figure 13C) et nourries avec du TetraMinBaby® dans les conditions standards de l'insectarium (température 27 #177; 2 °C ; humidité relative : 70#177;5% ; 12h : 12h en alternance jour/nuit). Après le stade nymphal, les moustiques adultes, maintenus dans des cages, ont été nourris en plaçant sur chaque cage un tampon de coton hydrophile imbibé de glucose 5% (Figure 13C). En fonction des besoins, certaines larves de stades 3 et 4 ont été triées pour les tests larvaires. Les autres seront conservées jusqu'à l'émergence en adultes à l'insectarium pour les tests adulticides.

Les femelles adultes de An. gambiae s.l. ont été séparées des autres culicidés grâce à la clef de détermination morphologique de Gillies et Coetzee (1987).

Les larves des souches sensibles de Ae. aegypti et de An. gambiae (respectivement Bora Bora et Kisumu) ont été obtenues à l'insectarium de l'IRSS/DRO à partir des pontes des adultes de ces souches sensibles qui sont des souches de références OMS.

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A

B

C

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Figure 13: Collecte larvaire et élevage de moustiques

A : Collecte de larves de Aedes aegypti ; B : Collecte de larves de Anopheles gambiae ; C : Élevage des moustiques à l'insectarium (Cliché Balboné, 2019)

2- 3.2. Techniques d'extraction

Les huiles essentielles utilisées dans cette étude ont été extraites à l'IRSAT par hydrodistillation avec un dispositif de type clevenger (Clevenger 1928) (Figure 13). Cette méthode a consisté en une distillation classique dans laquelle le matériel végétal et l'eau sont introduits dans la partie appelée « bac pour eau + matière ». Ce mélange a été ensuite chauffé à l'aide du gaz butane jusqu'à ébullition environ quarante-cinq (45) minutes après le début du chauffage. La vapeur qui en est sortie a suivi le tube à dégagement jusqu'à un condensateur où le condensat est retombé dans une petite burette. Dans cette burette, l'huile flottant sur l'eau, le volume d'huile recueilli peut être mesuré directement. Ce processus peut durer deux heures. Les huiles essentielles avec quelques gouttelettes d'eau ont été ensuite mises dans des petites bouteilles qui ont été placées dans un congélateur dans lequel l'eau se congèle et libère l'HE. Puis, les HE ont été vidées dans des bocaux vides et propres.

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2- 3.3. Caractérisation des huiles essentielles

La caractérisation des huiles essentielles a été réalisée à l'IRSAT selon le protocole décrit de la façon suivante : Les huiles essentielles ont été analysées par chromatographie en phase gazeuse (CPG) et chromatographie en phase gazeuse couplée avec la spectrométrie de masse (CPG/SM).

2- 3.3.1. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG)

L'analyse en CPG a été effectuée à l'aide d'un chromatographe de type Agilent 6890 série N équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (FID) et d'une colonne du type DB-5 (longueur : 10 m X 0,1 mm Diamètre ; l'épaisseur de film était de 0,17 ìm, Agilent Palo Alto, CA). Le gaz vecteur était l'hélium (vitesse moyenne 42 cm/sec) et la température de programmation du four était comprise entre 60 et 165 °C avec un gradient de 8°C/mn ; de 165°C à 280°C avec un gradient de 20°C/mn. L'appareil a été piloté par un système informatique de type « HP ChemStation », gérant le fonctionnement de l'appareil et a permis de suivre l'évolution des analyses chromatographiques.

2- 3.3.2. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée avec la spectrométrie de masse (CPG/SM)

Cette analyse a été réalisée sur un chromatographe en phase gazeuse (Figure 14) de type Hewlett-Packard (série HP 6890 GC) couplé avec un spectromètre de masse, série HP 5972 MSD (Hewlett Packard, Palo Alto, CA). La fragmentation a été effectuée par impact électronique sous un champ de 70 eV. La colonne utilisée était une colonne capillaire HP- 5MS Zebron (30 m X 0,25 mm), l'épaisseur du film était de 0,25 ìm. La température du four a été maintenue à 45 ° C pendant 2 min et augmentée de 45 ° C à 165 ° C à 4 ° C / min, et à partir de 165 ° C à 280 ° C à 15 ° C / min. Le gaz vecteur a été l'hélium dont le débit est fixé à 1,5 ml/min. Le mode d'injection a été split (rapport de fuite : 1/50).

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Figure 14: Chromatographe en phase gazeuse couplé avec spectromètre de masse

( http://crapcexpertise.dz/wp-content/uploads/2018/10/5973inert-640x425.jpg)

2- 3.3.3. Identification des composants des huiles

L'identification des composants de l'huile essentielle a été réalisée par comparaison de leurs indices de rétention avec ceux des homologues série de n-alcanes (C8-C32) déterminés dans les mêmes conditions du mode opératoire, et par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux des données de la littérature (Adams 2007). Les pourcentages relatifs des composants ont été calculés sans utiliser les facteurs de correction.

2- 3.4. Méthode de dilution des huiles essentielles et des combinaisons d'huiles essentielles

Les différentes dilutions ont été faites sur la base de la conservation de quantité de matière dans le solvant : Ci. Vi = Cf. Vf. Ce qui a permis de déterminer le volume de l'HE pure (Vi) dans la solution diluée. Des dilutions successives ont été faites dans l'acétone pour les tests larvaires et les tests des adultes en tubes OMS. Trois concentrations ont été préparées à l'aide de dilutions en série (v/v).

o Vi = Volume d'HE pure ou de la combinaison à prélever en millilitre ;

o Ci = Concentration de l'HE pure ou de la combinaison en pourcentage ; on a supposé par convention que quand l'HE est pure, sa concentration est égale à 100 % ;

o Cf = Concentration de l'HE diluée ou de la combinaison diluée exprimée en pourcentage,

o Vf = Volume final de la solution diluée en millilitre ; nous avons supposé qu'il fût égal à 100 ml pour toutes les dilutions.

Les différentes combinaisons ont été faites de la façon suivante : X ml de l'HE (A) + Y ml de l'HE B avec X + Y correspondant à 100 %.

Pour obtenir 2 ml de la solution finale à la concentration de 1 % qui a servi à l'imprégnation d'un papier Whattman n°1, 20 ul d'HE pure ou de la combinaison d'HE pure ont été dilués dans 1980 ul d'acétone.

2- 3.5. Imprégnation des papiers

L'imprégnation des papiers Whattman n°1 a été faite selon le protocole adopté par N'Guessan et al., (2007) et Corbel et al., (2017). Quatre papiers (4) découpés en rectangle de dimensions 12cm x 15cm ont été imprégnés chacun de 2ml de la solution obtenue par la dilution de l'HE dans de l'acétone. Les HE ont été diluées en 3 concentrations et chaque concentration a été imprégnée en 4 répliques. Les trois concentrations 0,1, 0,5 et 1 % ont été retenues après des tests préliminaires sur les souches de référence de Ae. aegypti (Bora Bora) et de An. gambiae (Kisumu) et à partir de la littérature.

Les papiers ont été déposés individuellement sur une planche à clous, puis imprégné avec 2 ml de l'HE diluée à l'aide d'une pipette (Figure 15B). Les papiers imprégnés ont été séchés au laboratoire pendant 10 minutes (Figure 15C) avant d'être conservés dans du papier aluminium et gardés au réfrigérateur (4°C) jusqu'à l'utilisation pour le test.

B

C

A

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Figure 15: Les huiles essentielles et l'imprégnation des papiers whatman (Cliché Balboné, 2020)
A : Les 5 huiles essentielles ; B : Imprégnation d'un papier whatman ; C : séchage des papiers imprégnés.

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2- 4. Analyse des données

Les analyses ont été réalisées à l'aide du logiciel statistique XLSTAT version 2015.1.01. Les valeurs de CL50, CL90 pour les larves mortes et les temps de paralysie des moustiques adultes ou temps de knock-down (KDT50 et KDT95), les concentrations létales à la moitié et à 99% (CL50 et CL99) ainsi que leurs intervalles de confiance à 95% (IC95%) ont été calculés par analyse probit en utilisant le même logiciel statistique afin de comparer la sensibilité des larves de moustiques testées aux HE des 5 cinq plantes et du pyriproxyfène et, de comparer la toxicité des mêmes HE et des combinaisons d'HE contre les moustiques adultes testés. Les valeurs CL50 et CL90 pour les larves et, les valeurs KDT50, KDT95, CL50, CL99 et les mortalités pour les adultes ont été considérées comme significativement différentes entre les HE si p < 0,05. Dans tous les tests, aucune mortalité de contrôle n'a été détectée après l'exposition de 24 heures ; par conséquent, aucune correction n'a été requise selon la formule d'Abbot (Abbott, 1925).

Les interactions entre les combinaisons réalisées ont été déterminées à l'aide des indices de concentration fractionnelle inhibitrice ou indices FIC. Ces indices ont été calculés de la manière suivante : Indice FIC = FICA+ FICB et FICA = MICAB / MICA et

FICB = MICAB / MICB où FICA et FICB sont les concentrations inhibitrices ou létales minimales qui tuent les moustiques adultes pour les huiles essentielles A et B respectivement. Ainsi, nous avons i) FICA : Concentration fractionnaire létale de A ; ii) FICB : Concentration fractionnaire létale de B ; iii) MICAB : Concentration létale de A dans la combinaison ; iv) MICA : Concentration létale de A ; v) MICAB : Concentration minimale inhibitrice de B dans la combinaison.

Les résultats ont été interprétés comme suit : i) Synergie : FIC < 0,5 ; ii) addition : 0,5 = FIC = 1 ; iii) indifférence : 1 = FIC = 4 ; ou iv) antagonisme : FIC > 4 (Schelz, Molnar, et Hohmann 2006 ; Bassolé et Juliani 2012).

Le rapport de résistance (RR) entre les souches VK et Kisumu a été calculé en divisant la CL50 de la souche VK par la CL50 de la souche Kisumu. Selon l'OMS (2017), RR < 5 indique une faible résistance, RR 5-10 dénote une résistance modérée, et RR > 10 indique une résistance significative.