2.6.2. Analyse biochimique (lipides et acides gras)
A l'émergence en rivière, 20 larves ont
été prélevées par radier. Elles ont
été euthanasiées et pesées pour analyse de la
teneur en lipides totaux et d'acides gras sur la larve entière. Ces
analyses ont été faites également sur les larves issues
des autres conditions d'incubation en milieu contrôlé au
conservatoire de saumon de Meuse (Erezée). Les échantillons
à analyser ont été homogénéisés, puis
on a extrait les lipides et les acides gras par la méthode de Bligh et
Dyer (1959).
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Extraction des lipides et des acides
gras
Un échantillon de 10 mg de tissus a été
prélevé et ajouté dans 800 tl d'eau milli-Q. Cette
solution a été ensuite homogénéisée dans le
MagNA lyser durant 2 cycles de 30 sec à vitesse 6000. Tout
l'homogénat a été transféré dans un tube GC
(tube pour chromatographie sous phase gazeuse).On a mis les tubes au vortex
individuel pendant 10 sec. Ensuite on a ajouté 1ml de standard interne
(acides gras libres (C13)-phospholipides (C15)- triglycérides (C17))
préalablement préparé et 2 fois 1 ml de chloroforme dans
les tubes avant de les mettre au vortex pendant 30sec. Un ml d'eau mili-Q a
été ensuite ajouté aux tubes puis, ils ont
été mis à nouveau au vortex pendant 30 secondes. Ensuite
on a ajouté 3 gouttes d'éthanol absolu avant de centrifuger 10
minutes à 3000 rpm. Enfin on a éliminé la phase
supérieure de l'échantillon et récupéré 1,7
ml du contenu de la phase inférieure dans un autre tube GC qu'on a
placé au congélateur à -20°C.
? Extraction de la phase solide
On a sorti les échantillons du congélateur puis
on les a fait évaporer sous flux d'azote. Ensuite on a ajouté 200
ml de chloroforme plus 3 ml d'hexane, qu'on a récupéré par
la suite dans un tube GC. L'échantillon a été ensuite
placé en tête d'une colonne. Dès lors, de façon
chronologique on a :
· ajouté sur la colonne 1,8 tl de chloroforme
/2-propanol et on a fait couler à sec ensuite pour
récupérer dans des tubes GC la fraction des lipides neutres.
· ajouté sur la colonne 2,4 ml de
diéthyléther /acide acétique et de la même
façon que précédemment on a récupéré
la fraction des acides gras.
· ajouté sur la colonne 1,8 ml de méthanol
et toujours comme avant, récupéré la fraction des
phospholipides.
? Méthylation
Les acides gras pour être analysés par
chromatographie en phase gazeuse, doivent subir une methylation. Cette
opération consiste à transformer chimiquement les acides gras en
des esters methyliques d'acides gras qui sont des composées volatiles.
Pour cela, on a sorti le standard interne du congélateur et on l'a
laissé refroidir à la température ambiante. Ensuite on l'a
méthylé au bain-marie à 70°C avant de
l'évaporer sou flux d'azote. A la fin de cette étape, on a
ajouté 20 tl de standard méthylé sur 780 tl
d'échantillon à analyser. Ensuite de ce mélange, on a
prélevé 250 tl de contenu qu'on a ajouté à 250 tl
d'hexane. Les acides gras ont été ensuite identifiés par
chromatographie sous phase gazeuse. Les lipides totaux par contrainte
temporelle n'ont pas été analysés. Ils ont
été estimés comme suit: Total acides gras / 0,7 en
considérant que le total des acides gras est égal à 70%
des lipides totaux chez les poissons.
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