I-3. Milieux et conditions de culture des
micro-organismes
I-3-1. Culture d'Escherichia coli
La purification et l'identification de la souche
bactérienne a été vérifiées avant toute
utilisation. La bactérie a été cultivée sur milieu
riche (Gélose nutritive) à 37°C pendant 24H. La composition
du milieu est motionnée en annexe2.
I-3-2. Culture des légionelles
Après le contrôle de purification, la souche de
Legionella pneumophila sérogroupe 1 a été
cultivée dans des erlenmeyers de 250 ml contenant 100 ml de milieu BYE
liquide. Le milieu inoculé a été ensuite incubé
sous agitation permanente de 150rpm à 37 °C dans un incubateur
agitateur. Le milieu BYE liquide a été préparé
selon la procédure mentionnée en (annexe 1). Il a
été stérilisé par filtration sur membrane de
porosité de 0,22 um puis complémenté par de la
L-cystéine (0,4 g/l final) et du pyrophosphate de fer (0,25g/l final)
préalablement stérilisés par filtration. La souche a
été également cultivée sur milieu
gélosé BCYE supplémenté en « glycine,
Vancomycine, Polymyxine B et. Cycloheximide ». Afin de confirmer la
pureté de la souche utilisée, la souche a été
ensemencée sur milieu sélectif avec cystéine et sur milieu
sélectif sans cystéine.
I-3-3. Culture d'amibes
+ Milieu non axénique
La culture des amibes sur milieu solide a été
réalisée sur la gélose non nutritive « NN-Agar »
composé seulement de 15 g/L d'agar puis recouvert d'un tapis
d'Escherichia coli (d'environ 2.109 à
3.109 bactéries/gélose). L'incubation a
été réalisée à une température de 28
°C pendent 10 jours.
+ Milieu axénique
Le passage en milieu liquide non axénique des souches
environnementales a été réalisé en déposant
un carré de gélose découpé au niveau d'un front de
migration d'une gélose NNA-coli dans une erlenmeyer contenant le milieu
SCGYEM( Chang et al,2007) ou PYG additionné d'un mélange
d'antibiotiques « ampicilline, Cycloheximide, l'acide nalidixique »
(annexes 2 et 3), le milieu est renouvelé chaque 5 jours. Après
croissance, les trophozoïtes ont été
transférés dans un nouveau milieu.
Etude de la relation entre des bactéries Legionella et
des amibes 10
Chapitre 2: Matériel et méthodes
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