II.3.2 Détermination des
Concentrations minimales inhibitrices (CMI) et fongicides (CMF)
Les CMI et CMF ont été déterminées
par la méthode de microdilution en milieu liquide, dans des plaques de
microtitration de 96 puits (Santos et Hamdan, 2005).
a) Préparation de la suspension de
spores
Les suspensions de spores ont été
préparées à partir de cultures âgées de 10
jours, incubées à 30°C sur milieu SDA. Les colonies
fongiques ont été immergées avec 5ml d'eau physiologique
stérile et la surface de culture a été grattée
doucement à l'aide d'une anse stérile. La suspension obtenue a
ensuite été filtrée à l'aide d'un papier filtre
qui retient les fragments de mycélium et laisse passer les spores. Des
dilutions successives ont permis d'ajuster le nombre de spores à environ
104 UFC/ml.
b) Préparation des solutions mère
d'extraits et fractions
L'extrait/ fraction (16,4 mg) a été dissout dans
400ul de diméthylsulfoxide, puis le volume de la solution a
été complété à 2 ml pour une concentration
finale d'extrait/fraction de 8192 ug/ ml.
c) Procédure
Des dilutions en série de deux des solutions d'extraits
et fractions ont été effectuées dans chaque puit. Pour
se faire, 100 ul de bouillon de Sabouraud dextrose (SDB)
supplémenté à un extrait/fraction (8192ug/ml) ont
été introduits dans un puit. 100 ul de SDB
supplémenté à l'inoculum y ont été
ajoutés pour donner une concentration de 4096 ug/ml. 100 ul de cette
dernière solution a été prélevée et
additionnée à 100 ul de SDB contenant l'inoculum pour donner une
concentration de 2048 ug/ml et ainsi de suite jusqu'à la plus petite
concentration (32 ug/ml). Trois essais ont été
réalisés pour chaque concentration, et trois contrôles ont
été effectués : le contrôle stérile
(SDB), le contrôle négatif (SDB et inoculum) et le contrôle
positif (SDB, inoculum et griséofulvine). La griséofulvine,
antifongique de référence a été testée selon
la même procédure. Les plaques ont ensuite été
recouvertes de parafilm dans des conditions aseptiques, puis incubées
à 30 °C pendant 7 jours. Au terme de cette période,
l'inhibition de la croissance des dermatophytes a été
vérifiée par ajout de 25 ul de para- iodonitrotétrazolium
(INT) 0,3M dans chaque puit (Eloff, 1998), suivi d'une incubation à
30°C pendant 2 heures. La CMI a été définie comme la
plus petite concentration d'extrait/ fraction pour laquelle il n'ya pas eu
apparition d'une coloration rose après ajout d'INT.
La nature fongistatique ou fongicide a été
confirmée par repiquage sur SDA (en stries d'environ 5 cm de long) de
10 ul du contenu des puits ne présentant aucune croissance visible.
Après 7 jours d'incubation à 30°C, l'absence d'une reprise
de croissance a été considérée comme indicatrice
d'une action fongicide, alors qu'une reprise de croissance a indiqué
une action fongistatique (Escaliente et al., 2002).
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