CHAPITRE III.CONSIDERATIONS PRATIQUES
3.1. METHODOLOGIE
Nous avons mené une étude prospective
transversale qui s'est étendue sur une période de 3 mois. Notre
délimitation est donc celle-ci :
1. temps : JUILLET au Début OCTOBRE 2004
2. Espace : Clinique du Centre Hospitalier Universitaire
de Kigali, CHUK en ambulatoire et patients hospitalisées.
3. Domaine : Bactéries responsables des infections
urinaires et leur diagnostic
Notre effectif est valable car, sur 325 échantillons
recueillis, 320 ont été analyses systématiquement et leur
résultats sont présentes dans les différents tableaux et
graphiques (soit un effectif valable de 98,46%).
L'urine a été analyses par :
.L'examen macroscopique
.La bandelette urinaire réactive
.L'examen a frais entre lame et lamelle
.La coloration de Gram
.La culture et l'antibiogramme
3.2. PRESENTATION DU LIEU D'ETUDE
L'étude s'est déroulée au laboratoire du
CHUK, Précisément dans le service de microbiologie, durant nos
stages préparatoires et pendant des heures libres.
Le CHUK est situe dans la Mairie de la ville de Kigali,
District de Nyarugenge, Secteur Gitega.
La population est composée des malades qui viennent en
consultation clinique du CHUK et ceux qui sont en hospitalisation quelque soit
l'âge, le sexe, la Provenance.
La méthode du questionnaire est adoptée dans
cette étude.
3.3. METHODE
A. Réception des échantillons :
Les échantillons sont
enregistrés : Nom, prenom, sexe du malade, service, médecin
prescripteur, date de réception, numéro d'enregistrement et la
provenance.
B .Examen macroscopique
Nous notons principalement l'aspect, la quantité, la
couleur, le contenant et l'odeur.
C. Examen a la Bandelette réactive
La tige réactive est prolongée dans l'urine, la
lecture se fait après une minute en comparant les couleurs obtenues avec
celles du fabricant. On s'intéressé aux leucocytes,
protéines, hématies, ph, densité, et les nitrites
NB : La lecture après 2 minutes et plus n'est pas
prise en considération ; la lecture après trente secondes
est possible pour les nitrites.
D. Examen microscopique
D.1. Examen entre lame et Lamelle
Apres l'obtention du culot de centrifugation, a l'aide d'une
pipette pasteur stérile, une goutte est déposée sur une
lame couverte d'une lamelle ; on examine a l'objectif 10X, puis 40X et on
recherche : Hématie, Leucocytes, Bactéries, Levures,
Cylindres, Parasites et Cristaux.
D.2.Examen après Coloration de Gram
L'examen est réalisé sur le culot de
centrifugation après confection d'un étalement fixe par la
chaleur de la flamme du bec Bunsen. La coloration se fait par :
-Violet de gentiane
-Lugol
-Alcool a 95% et Fuchsine
-Fuchsine
L'observation se fait au microscope avec l'objectif a
immersion ( 100X)
Les bactéries Gram Positifs sont VIOLEETS
Les bactéries Gram Négatifs sont ROSES
Seule la coloration de Gram peut orienter le choix du milieu
de culture et d'identification
E) Mise en Culture
Les milieux de culture permettent d'étudier les
caractères biochimiques, enzymatiques, antigéniques et permettent
l'identification des souches responsables.
3.3.1. MILIEUX DE CULTURE UTILISEES
A.GELOSE AU SANG (GS) : Milieu
d'isolement des bactéries exigeantes, aérobies et anaerobies.Il
permet de mettre en évidence le pouvoir hémolytique des germes
B.MAC CONKEY(MC): Cette gélose lactose
est utilisée pour rechercher, isoler, et dénombrer les
enterobacteries.Elle permet de distinguer parmi eux les fermenteurs de lactose
et les non fermenteurs
C.MANNITOL SALT AGAR( MSA): Milieu
sélectif pour les staphylocoques
D.SABOURAUD: Milieu sélectif pour les
levures
E.KLIGLER: Milieu d'identification des
entérobactéries permettent de mettre en évidence le
pouvoir fermenteur ou non du glucose , du lactose ainsi que la production de
H2S.
F.CITRATE : Milieu
d'identification permettant de distinguer les
entérobactéries
G.MIU : Milieu d'identification
permettant de distinguer les entérobactéries par la
mobilité, la fermentation du citrate ou non.
3.3.2. REACTIFS UTILISES
1. Bleu de
méthylène --------------coloration
2. Réactif de KOVACS------------
Réaction couleur
3. Réactifs de
GRAM---------------Coloration
4. Sérum de lapin-------------------Coagulase
détection
5. Sérum humaine------------------Coagulase
détection
6. Eau physiologique-------------Examen a
frais
7. Eau
oxygénée-------------------- > Catalase
détection
3.3.3. TESTS FAITS POUR L'IDENTIFICATION
1. CATALASE
Ce test est fait pour différencier les bactéries
productrices d'une enzyme, la catalase, comme les staphylocoques et les non
producteurs de cette enzyme, comme les streptocoques
MODE : 3 ML H2O2+ COLONIE, PUIS OBSERVER LA REACTION
2.COAGULASE
Test effectue pour différencier S.Aureus des autres
staphylocoques qui ne produisent pas cette enzyme.
3. TEST A LA DNASE
Test effectue aussi pour différencier S.Aureus qui
produit cette enzyme de ceux qui ne la produisent pas.
4. TEST A L'OXYDASE
Test utilise pour identifier les bactéries comme
Pseudomonas, Neisseria, Vibrio, Pasteurella des autres bacteries dont ce test
est négatif.
MODE : Disque d'oxydase+ une colonie, puis observation du
changement de couleur.
5.TEST DE L'UREASE
Test utilisé pour différencier les
enterobacteries.Les colonies de proteus sont fortement productrices d'urease.
Les germes comme Salmonella et Shigella ne produisent pas d'urease.
6. TEST DE L'INDOLE
Test très important pour l'identification des
entérobactéries. Plusieurs types d'E.Coli, P.Vulgaris,
P.Rettigeri, M.Morgani et Providence sont très spécifiques pour
cette enzyme. En disposant de la réaction de Kovacs, avec les
résultats du Citrate et du MIU, on identifie aisément E. Coli.
3.4. CONDITIONS D'ETUDE ET CONTRÔLE DE
QUALITE
Les échantillons inclus sont :
-Ceux provenant de la clinique du CHUK accompagnes d'un bon
comportant le renseignement clinique
Les échantillons exclus sont :
-Ceux des malades sous antibiothérapies datant d'une
semaine, ou sans renseignements.
Les examens inclus sont :
-Examen macroscopique :
-Examen microscopique
-Examen cytologique
-Examen chimique
-Culture
-Antibiogramme
Non seulement les échantillons sont analyses au
Laboratoire de Microbiologie du CHUK, mais également quelques
échantillons - 30%- ont été contrôles dans d'autres
laboratoires par d'autres techniciens capables d'effectuer les analyses
citées.. 2% ont été transférées dans
d'autres pays et les résultats qui nous sont parvenus par internet ne
montraient pas de grandes différences ; ce qui fait que nos
méthodes sont valables et nos recommandations doivent être
considères.
Un post test de quelques jours concernant quelques
échantillons a été effectue en Octobre et Novembre. Aucune
particularité importante n'a été
révélée a part l'isolement de P.Aeroginosa
3.5.DIFFICULTES RENCONTREES
L'objectif global de notre étude qui est de
Rationaliser les bactéries responsables des infections urinaires et leur
diagnostic a eu quelque difficulté
-Certains techniciens avaient l'impression que l'enquête
était un test pour évaluer leur compétence et
révéler leurs déficits du fait que nous étions des
camarades dans le passe. Il en était le même pour quelque
infirmières.
De ce fait les réponses faisant l'Object de notre
étude ont parfois pris un peu de retard. Pour pallier a ce
problème, il nous a fallu associer plusieurs méthodes et
plusieurs moyens a propos du temps de collecte, questionnaire, d'examen, de la
notation des résultats, pour atteindre notre objectif et fournir une
information précise et scientifique.
-Les moyens de rédaction et de documentation n'ont pas
été toujours facilement accessibles, comme la
bibliothèque électronique. Mais la volonté et la
détermination en avance nous ont aidé, nous avons pu recueillir
le maximum des renseignements pour donner ce travail une valeur scientifique
pour des recherches ultérieures.
CHAPITER 4 : PRESENTATION ET ANALYSE DES RESULTATS
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