Memoire Online - Comparaison de trois tests de détection rapide des β-lactamases à spectre elargi dans les échantillons d’hémocultures et d’urines

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR, DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ET DE L'INNOVATION

Comparaison de trois tests de détection rapide des â-lactamases à Spectre Elargi dans les échantillons d'hémocultures et d'urines

Présenté le 24 Juillet 2019 pour l'obtention du Diplôme d'Etude Spécialisée deBiologie Clinique

LISTE DES RESPONSABLES ADMINISTRATIFS ET DES ENSEIGNANTS DE L'UFR/SDS ANNEE 2018-2019

DEDICACES

Vous avez été un grand apport dans la réalisation de ce travail, vous avez fait preuve de patience durant mon absence pour le stage. Retrouvez ici, l'expression de mes sentiments les plus sincères. Que Dieu nous garde toujours unis à jamais.

Ø A mes amis et camarades internes de l'hôpital Saint Louis de Paris, en particulier Morgane PETIT, Clément JANOT, Nicolas SALOUM.

Je ne peux trouver les mots justes et sincères pour vous exprimer mon affection et mes pensées, vous êtes pour moi tous des amis.

Ce travail est le couronnement du chemin que nous avons tous emprunté en 2014, je vous remercie très sincèrement pour votre parfaite collaboration. Vous êtes pour moi tous des amis.

REMERCIEMENTS

Merci pour vos enseignements, vos encouragements et votre engagement pour la biologie clinique.

Ø A notre maître de stage et co-directrice du mémoire, Pr Béatrice BERÇOT :

Chère maître, votre simplicité, votre disponibilité, votre rigueur scientifique et vos soutiens multiples ont permis la réalisation de ce travail. Merci pour tout et que Dieu vous bénisse et vous donne une longue vie pleine de succès.

Votre simplicité, votre disponibilité et la confiance dont vous avez placée en nous, ont facilité l'élaboration de ce document. Je vous remercie très sincèrement.

Ø A tout le personnel du laboratoire de bactériologie de l'hôpital Saint Louis :

En particulier monsieur François CAMELENA, merci pour les soutiens multiformes et pour la bonne collaboration.

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

CA-SFM : comité d'antibiogramme de la société française de microbiologie

INTRODUCTION/ ENONCE DU PROBLEME

Les bacilles à Gram négatif (BGN) en particulier les entérobactéries sont de loin les germes responsables d'infections du tractus urinaire (ITU) (Sarkiset al.,2017). Dans les bactériémies à BGN les entérobactéries occupent une place prépondérante(Melzeret al.,2007 ; Peraltaet al 2012). Cependant, ces bactéries deviennent de plus en plus une menace mondiale du fait de leur multirésistance aux antibiotiques, essentiellement due à l'acquisition de â-lactamases à spectre élargi (BLSE). L'émergence et la dissémination des BLSE de type CTX-M à l'échelle mondiale en sont la principale cause (Cantónet al.,2016 ;Boutalet al.,2017). Ces enzymes confèrent aux entérobactéries unerésistance à l'ensemble des â-lactamines à l'exceptiondes céphamycines et des carbapénèmes (Netgenet al.,2009).

Longtemps considérée comme un phénomène hospitalier, la résistance par production de BLSE est actuellement en plein essor en milieu communautaire. En effet, le portage communautaire de BLSE est estimé à 70 %, 35 % et 15 % respectivement en Asie, dans l'Est du Bassin Méditerranéen et en Afrique (Woertheret al.,2013). Au Burkina Faso, la prévalence du portage de BLSE était estimée à 22% parmi des volontaires sains et 42% parmi les hospitalisés (Ouedraogoet al., 2017)Les facteurs de risques associés au portage de BLSE sont principalement les conditions d'hygiène précaires et une consommation non négligeable d'antibiotiques de qualité suboptimale (Woertheret al., 2013). Une méta-analyse récente estimait que la prévalence mondiale de BLSE se situait autour de 14 % et augmenterait en moyenne de 5,38 % par an (Karanikaet al.,2016)--.

Les bactériémiesà BLSE sont très souvent associées à un mauvais pronostic comparativement aux mêmes germes sensibles. Ce risque étant essentiellement dû à l'instauration d'antibiothérapie probabiliste inadéquate (Melzeret al.,2007 ; Schwaberet al., 2007).En pratique, les méthodes traditionnelles de diagnostic bactériologique mettent 48 à 72 heures pour l'obtention d'un antibiogramme et 20 à 30% des patients reçoivent une antibiothérapie initiale inadéquate avec une augmentation du taux de mortalité estimé à 7,6% pour chaque heure d'antibiothérapie efficace retardée (Kumar A et al.,2006).

La résistance des entérobactéries aux céphalosporines de troisièmegénération (C3G)qui sont les molécules les plus couramment prescrites, pose unproblème de choix des antibiotiques au coursdes traitements probabilistesdes infections invasives. L'élaboration de techniques de diagnostic rapide s'avère donc indispensable pour guider au mieux le choix des antibiothérapies probabilistes.Plusieurs outils existent actuellement surle marché mais très peu permettent à partir des produits pathologiques d'identifier à la fois le pathogène et les gènes de résistances. L'appareil ePlex® de GenMark propose un panel d'identification de bacilles à Gram négatif qui sont les plus souvent responsables d'ITU et de bactériémies. Il permet en outre, l'identification des gènes les plus couramment impliqués dans les multirésistances (CTX-M, IMP, KPC, OXA, VIM, NDM).

L'objectif de ce travail était d'évaluer les performances diagnostiques d'un test chromogénique, d'un test immunochromatographique et d'un test de biologie moléculaire pour la mise en évidence de la résistance bactérienne.

Chapitre 1 : Résistance bactérienne aux antibiotiques

1. Mécanismes de résistance bactérienne aux antibiotiques

Les principaux mécanismes de résistance bactérienne aux antibiotiques sont : l'imperméabilité, la résistance par efflux, la modification de la cible et la modification des antibiotiques(figure 1).

Figure 1: Représentation schématique des mécanismes de résistance aux antibiotiques (Boutaletal.,2017)

1.1 Imperméabilité aux antibiotiques

Bon nombre d'antibiotiques ont des cibles intracellulaires, ce qui implique nécessairement la pénétration à travers la membrane externe et/ou la membrane cytoplasmique pour avoir un effet antimicrobien. La capacité des bactéries à développer des mécanismes pour bloquer la diffusion des antibiotiques à travers leurs membranes est l'imperméabilité. C'est un phénomène très répandu chez les bactéries à Gram négatif pour lesquelles cette diffusion est médiée par des porines notamment pour des antibiotiques comme les tétracyclines, les fluoroquinolones ou les â-lactamines (Pagèset al.,2008). La résistance médiée par les porines peut résulter de plusieurs phénomènes comme le changement de type, de spécificité ou de niveau d'expression de la porine.

1.2 Résistance par efflux

Les pompes à efflux ont pour rôle principall'expulsion des déchets issus du métabolisme bactérien. Elles peuvent également être impliquées dans les phénomènes de résistance aux antibiotiques en limitant l'accumulation de la molécule au contact de sa cible. Une surexpression de ces pompes a un effet délétère sur l'efficacité des antibiotiques (Yasufukuet al.,2011). Ces pompes peuvent être spécifiques d'une ou plusieurs familles d'antibiotiques (Poole K et al., 2005).

1.3 Modification de la cible

Plusieurs phénomènes peuvent être à l'origine de la modification des cibles d'action des antibiotiques avec pour conséquence une perte ou une baisse de l'affinité des antibiotiques pour celles-ci.

o Une modification de la cible suite à une mutation dans le gène correspondant : c'est le cas de la mutation pour les gènes de la gyrase ou de la topoisomérase IV qui confère la résistance aux fluoroquinolones(Hooperet al., 2002) ;

o Une modification enzymatique de la cible: méthylation du ribosome générant une résistance aux macrolides(Leclercq et al., 2002) ;

o Une modification par le remplacement de la cible : acquisition par S. aureus d'une PLP exogène (PLP2a) portée par le gène mecA à l'origine de la résistance à la méticilline. Cette PLP a une faible affinité pour les â-lactamines rendant tous les membres de cette famille inefficace contre Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) (Hiramatsuet al.,2013);

o Une protection de la cible : l'exemple type est la résistance à la tétracyclineau cours de laquelle la bactérie résistante produit des protéines (TetO et TetM) homologues aux facteurs d'élongation impliqués dans la synthèse protéique. Ces protéines se fixent au ribosome et délogent la tétracycline tout en modifiant la conformation du ribosome empêchant l'antibiotique de se refixer (Donhoferet al.,2012). Une autre protéine qnrconfère également la résistance aux quinolones en agissant comme un homologue de l'ADN qui se fixe sur les sites de liaison à l'ADN de la gyrase et de la topoisomérase IV. Le nombre de complexes ADN/gyrase est ainsi limité ce qui diminue le nombre de complexes gyrase/ADN clivé/quinolone délétère pour la bactérie (Strahilevitzet al.,2009).

1.4 Modification des antibiotiques

C'est un mécanisme enzymatique au cours duquel, l'antibiotique est soit dégradé par hydrolyse (c'est le cas des â-lactamases qui hydrolysent les â-lactamines), soit par modification structurale des antibiotiques par méthylation, phosphorylation ou adénylation.

2.â-lactamases des entérobactéries

Le mécanisme de résistance le plus partagé et le plus fréquent dans la famille des entérobactéries est la production de â-lactamases (Netgenet al., 2009). En effet, la production de â-lactamases chez les entérobactéries a été décrite bien longtemps. Toutefois la pression de sélection induite par l'utilisation massive des antibiotiques a favorisé l'émergence de souches multirésistantes (Drawzet al.,2010).

On distingue principalement deux types de classification des â-lactamases, celle de Bush-Jacoby-Medeiros basée sur leurs substrats et leurs inhibiteurs, et celle d'Ambler basée sur leur homologie de séquence en acides aminés (Drawzet al., 2010).La classification de Ambler sera utilisée dans la suite de ce travail.

2.1 â-lactamases à sérine

Ces enzymes appartiennent à la classe A de Ambler. Toutes les â-lactamases à sérine ont un mode d'action dépendant de l'acylation des â-lactamines, aboutissant à l'hydrolyse du cycle â-lactame et àla perte d'activité de l'antibiotique. L'enzyme est ensuite régénérée et de nouveau active sur d'autres molécules d'antibiotiques (Drawzet al., 2010).

2.1.1 Pénicillinases

Ce sont des enzymesde type plasmidique ou chromosomique, généralement sensibles aux inhibiteurs (acide clavulanique, tazobactam), leur spectre d'hydrolyse concerne les pénicillines et les céphalosporines de première génération (C1G). Les enzymes de type TEM et SHV sont courantes et souvent rencontrées en clinique chez des souches de E. coli etdeK. pneumoniaeresponsables d'ITU (Drawzet al., 2010).

2.1.2 â-lactamases à spectre élargi

Les BLSE sont une grande famille hétérogène d'enzymes bactériennes découvertes dans les années 80 en France. Elles sont induites soit par des plasmides, soit par des mutations du génome naturel. Les deux mécanismes confèrent aux bactéries qui les possèdent, la capacité d'hydrolyser une grande variété de pénicillines et de céphalosporines. Avant l'expansion des CTX-M, la majorité des BLSE était le résultat de mutations génétiques de â-lactamases naturelles, en particulier de TEM-1, TEM-2 et SHV-1(Netgenet al., 2009).

Les â-lactamases naturelles sont très actives contre les pénicillines et moyennement actives contre les C1G. Les mutations génétiques à l'origine des BLSE élargissent le spectre de ces enzymes et touchent également les céphalosporines de troisième génération et les monobactames. Les bactéries produisant une BLSE n'hydrolysent pas les céphamycines ni les carbapénèmes et elles sont inhibées par les inhibiteurs classiques de â-lactamases (acide clavulanique, tazobactam et sulbactam)(Netgenetal.,2009). La présence de BLSE est fréquemment associée à la résistance aux fluoroquinolones.

2.1.3BLSE de types TEM et SHV

La première â-lactamase plasmidique (SHV2) hydrolysant les C3G fut isolée d'une souche de Klebsiella ozaenae en Allemagne en 1983. Cette â-lactamase à spectre élargi était dérivée de la â-lactamaseà spectre étroit SHV1 par simple mutation qui lui conférait un spectre d'hydrolyse assez large (Kliebeet al.,1985). En 1984 en France, une autre â-lactamase plasmidique dérivée de la â-lactamase à spectre étroit TEM-1 hydrolysant le céfotaxime fut isolée de Klebsiellapneumoniae(Sirotet al.,1987).Ces BLSE, dérivées des â-lactamases à spectre étroit conservaient la propriété d'être inhibées par les inhibiteurs de â-lactamase comme l'acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam.

2.1.4BLSE de type CTX-M

Les CTX-M dérivent des â-lactamases chromosomiques d'espèces du genre Kluyvera (entérobactéries non pathogènes). Ces â-lactamases tiennent leur nom de par leur hydrolyse préférentielle du céfotaxime par rapport à la ceftazidime « CTX » et « M » pour leur lieu d'isolement (Munich). Elles ont été isolées en Allemagne par Bauernfeind et al. (1990) à partir d'une souche de E. coli résistante au céfotaxime.

Les CTX-M constituent actuellement la majorité des BLSE isolées dans le monde. En effet, elles ont été retrouvées sur tous les continents à des fréquences variables en fonction du temps du pays et du type de patients recrutés. Elles sont également retrouvées en milieu communautaire qu'à l'hôpital (Ruppéetal.,2010). Comme la majorité des BLSE de classe A, les CTX-M confèrent une résistance à toutes les â-lactamines hormis les céphamycines et les carbapénèmes. La plupart des CTX-M confère un haut niveau de résistance au céfotaxime et à la ceftriaxone. Le niveau de résistance vis-à-vis des céphalosporines de quatrième génération est variable(Ruppéetal., 2010).

De nos jours, il existe plus de 90 CTX-M répartis dans 5 groupes(Ruppéetal., 2010) que sont :

-le groupe CTX-M-2 comprend les CTX-M-2, CTX-M-4, CTX-M-5, CTX-M-6, CTX-M-7 et TOHO-1 ;

-le groupe CTX-M-9 comporte les CTX-M-9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-17, CTX-M-19, CTX-M-21, CTX-M-27 et TOHO-2 ;

2.1.5Carbapénèmases à sérine

Les carbapénèmases à sérines regroupent des enzymes des familles NMC (not-metallo-enzyme carbapenemase), IMI (imipenem-hydrolysing enzyme), SME (Serratia marcescens enzyme) dont les gènes sont portés par le chromosome, et GES (Guyana extendedspectrum) et KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) dont les gènes sont portés par un plasmide. Ces enzymes ont un spectre d'hydrolyse très large et touchent la quasi-totalité des â-lactamines (pénicillines,céphalosporines, monobactames et carbapénèmes)(Queenanetal., 2007). KPC est la carbapénèmase la plus répandue de ce groupe.Elle hydrolyse plus efficacement les C3G et est faiblement inhibée par les inhibiteurs de â-lactamases (Papp-Wallaceetal.,2010).

2.2 Métallo-â-lactamases

Les Métallo-â-lactamases (MBLs) appartiennent à la classe B de Ambler. Elles se caractérisent par un large spectre d'hydrolyse vis-à-vis des â-lactamines et restent insensibles aux inhibiteurs. A l'exception des monobactames, elles sont capables d'hydrolyser toutes les classes de â-lactamines. Les métallo-â-lactamases utilisentun ion (zinc généralement) comme cofacteur lors de l'attaque nucléophile du noyau â-lactame d'où leur nom (Munitaetal.,2016). L'éthylène diamine tétra acétique (EDTA), ayant un pouvoir chélateur inhibe l'action des MBLs in vitro. IMP, VIM et NDM sont les MBLs les plus souvent rencontrées chez les entérobactéries (Munitaetal.,2016 ; Boutaletal., 2017).

2.3 Oxacillinases

Les oxacillinases appartiennent à la classe D de Ambler. Elles confèrent plusieurs phénotypes de résistance en fonction du type. Elles ont une activité pénicillinase mais sont capables d'hydrolyser l'oxacilline, d'où leur nom. L'OXA 48 a une activité carbapénèmase. Elle est uniquement présente chez les entérobactéries. En France, 75 % des déclarations d'entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) correspondent à des souches productrices d'OXA-48 (Dortetet al., 2013).

2.4Céphalosporinases

Les â-lactamases de la classe C de Ambler sont des céphalosporinases, ces enzymes sont insensibles aux inhibiteurs des â-lactamases. Elles sont connues sous le nom AmpC, et leur site actif contient une sérine (Harriset al.,2015). On distingue :

- les céphalosporinases chromosomiques non inductibles chez les entérobactéries du groupe 1 (E. coli, Shigella spp) : très peu ou pas exprimées, leur spectre d'hydrolyse se limite aux pénicillines et aux C1G ;

- les céphalosporinases chromosomiques inductibles chez les entérobactéries du groupe 3 (Enterobacter sp, Citobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia stuartii).Elles peuvent être hyper-produites suite à une mutation du gène de régulation : on parle alors de céphalosporinases déréprimées. Elles ont un spectre d'hydrolyse très large, en plus des pénicillines et des C1G, elles hydrolysent les G, C3G voire les C4G ;

- les céphalosporinases plasmidiques (AmpC) : présentes sur des éléments mobiles transférables,leur site actif contient une sérine. Ce sont des céphalosporinases à large spectre. Elles sont également actives sur l'aztréonam et insensibles aux inhibiteurs de â-lactamases.

3. Classification des entérobactéries en fonction de leur phénotype de résistance

Les entérobactéries produisent naturellement diverses â-lactamases ce qui permet de les classer en groupes phénotypiques de résistance (Bonnet et al., 2012).

3.1 Groupe 0 : phénotype sensible d'espèces dépourvues de gènes de â-lactamases

Le groupe 0 est constitué de phénotype sensible d'espèces dépourvues de gènes de â-lactamases. Salmonella sp et Proteus mirabilis sont dépourvus de â-lactamase à l'état sauvage et sont naturellement sensibles aux aminopénicillines, carboxypénicillines, uréïdopénicillines, à l'aztréonam, aux céphalosporines et aux carbapénèmes. Les diamètres d'inhibition de l'imipénème sont souvent réduits pour P. mirabilis comme pour les autres Proteae(Bonnet et al., 2012). La faible affinité de cette molécule pour les PLP2 de ces espèces serait responsable de cette diminution. Toutefois, elle est sans conséquence clinique contrairement à la résistance acquise par mutation de PLP2.

La fréquence du phénotype sauvage chez Proteus mirabilis est d'environ 50% en milieu hospitalier ; chez Salmonella, elle est d'environ 90% avec une grande disparité selon les sérogroupes (Chanalet al., 2000).

3.2 Groupe 1 : phénotype céphalosporinase de bas niveau

Il est constitué de phénotype sensible d'espèces produisant naturellement une céphalosporinase de classe C. E. coli et Shigella spp sont naturellement sensibles aux aminopénicillines, carboxypénicillines, uréïdopénicillines, à l'aztréonam, aux céphalosporines et aux carbapénèmes. Cependant, elles produisent à très bas niveau une céphalosporinase chromosomique non inductible de type AmpC qui peut entrainer chez certaines souches une réduction de la sensibilité aux aminopénicillines, à leurs associations au clavulanate et/ou aux C1G. La fréquence du phénotype sauvage chez E. coli est d'environ 50% en milieu hospitalier (Chanalet al., 2000).

3.3 Groupe 2 : phénotype pénicillinase bas niveau

Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Citrobacterkoseri, Citrobacteramalonaticus et Escherichia hermanni produisent naturellement et de façon constitutive des enzymes chromosomiques de classe A sensibles aux inhibiteurs (SHV-1 ou LEN-1 pour K. pneumoniae, OXY pour K. oxytoca, CKO pour C. koseri, CdiA pour C. amalonaticuset HER-1 pour E. hermanni). Elles confèrent une résistance patente aux aminopénicillines et aux carboxypénicillines et souvent inapparente aux uréïdopénicillines. Les associations pénicillines-inhibiteurs sont actives (Bonnet et al., 2012). Environ 70% des souches de K. pneumoniae, 75% des K. oxytoca et C. koseri sont de phénotypes sauvages ou sensibles.

3.4 Groupe 3 : Phénotype céphalosporinase de bas niveau

Les entérobactéries appartenant à ce groupe réunissent des espèces productrices de céphalosporinases de classe C (AmpC) chromosomiques et inductibles par les â-lactamines. Ces céphalosporinases sont très répandues chez Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia stuartii, Providencia rettgeri et Pantoeaagglomerans. Le phénotype sauvage de ces espèces comprend une résistance aux aminopénicillines, à leurs associations aux inhibiteurs des â-lactamases et aux C1G (Bonnet et al., 2012).

La fréquence du phénotype sauvage est variable selon l'espèce et la situation épidémiologique du lieu considéré.

3.5 Groupe 4 : Yersinia enterocolitica et Serratia fonticola

Yersinia enterocolitica et Serratia fonticola produisent naturellement une céphalosporinase inductible de classse C et une enzyme de classe A. Chez Yersinia enterocolitica, cette dernière est une pénicillinase constitutive de classe A tandis que chez Serratia fonticolal'enzyme de classe A est une â-lactamase inductible (Bonnet et al., 2012).

Yersinia enterocolitica est résistante aux aminopénicillines, à leurs associations avec l'acide clavulanique, aux carboxypénicillines et aux C1G. La résistance aux uréïdopénicillines n'apparait pas in vitro. Le phénotype de résistance de Serratia fonticolaest similaire. Cependant le céfuroxime n'est pas actif et la résistance à l'association aminopénicillines-inhibiteurs de â-lactamases normalement induite par l'AmpC n'est pas toujours exprimée in vitro (Bonnet et al., 2012).

3.6 Groupe 5 : phénotype céfuroximase

Proteus vulgaris et Proteus penneri produisent naturellement une céphalosporinase de classe A inductible par les â-lactamines appelée céfuroximase. Le phénotype se caractérise par une résistance aux aminopénicillines, aux C1G, aux G (céfuroxime, céfamadole) à l'exception des céphamycines (céfoxitine) et une sensibilité aux associations pénicillines-inhibiteurs de â-lactamases (Bonnet etal., 2012).

3.7 Groupe 6 : Phénotype â-lactamase à spectre étendu chromosomique

Kluyvera ascorbata, Kluyvera cryocrescens, Kluyvera georgiana, Rahnellaaquatilis, Citrobactersedlakii et Erwinia persicina produisent naturellement des â-lactamases à spectre élargi de classe A. Ces BLSE souvent exprimées à bas niveau confèrent une résistance aux aminopénicillines, aux carboxypénicillines, aux C1G et G. La résistance aux uréïdopénicillines et aux C3G est souvent inapparente (Bonnet etal., 2012).

4. Impact économique et social de la résistance bactérienne

L'émergence et la dissémination des bactéries multirésistantes (BMR) ont réduit considérablement les possibilités thérapeutiques des patients infectés par des BMR. Les antibiotiques de derniers recours, notamment les carbapénèmes qui sont utilisés dans les infections causées par des entérobactéries multirésistantes connaissent aujourd'hui des limites du fait de l'émergence et de la dissémination des carbapénèmases à travers le monde. Cette impasse thérapeutique à caractère mondial est à l'origine de morbi-mortalité importante. En effet, Peraltaetal. (2012) ont rapporté dans une étude multicentrique que les traitements probabilistes étaient inadéquats dans près de 50% des cas de bactériémie à BLSE avec un risque de mortalité dans les 72 heures suivant le choc septique estimé à plus de 20%.

Dans les pays de l'Union Européenne, des Etats Unis et du Thaïlande, le nombre de décès annuel lié au BMR est estimé à plus de 23 000, 25000 et 38 000 avec un coût global direct pouvant atteindre 20 milliards de dollars (Kardaoe-Somaet al., 2017).

L'impact économique de la résistance bactérienne n'est plus à démonter, il est tributaire des coûts liés à la durée d'hospitalisation, des frais inhérents aux médicaments ainsi que du coût de la prévention. En effet, on estime à plus de 24 millions de personnes dans le monde qui seraient réduites dans l'extrême pauvreté d'ici 2030 à cause des BMR et le coût minimal annuel pour freiner l'émergence et l'extension des BMR estimé à 9 milliards de dollars ( https://genmarkdx.com/).

Selon les estimations de la banque mondiale, la résistance bactérienne pourrait d'ici 2050 avoir des effets dévastateurs sur l'économie mondiale d'une ampleur comparable à ceux de la crise financière de 2008. Cette étude montre également que la résistance microbienne pourrait accroître la pauvreté en touchant surtout les pays démunis avec plus de 5% du PIB et précipiter jusqu'à 28 millions de personnes dans la pauvreté.

Chapitre 2 :Outils de détection de la résistance bactérienne

1. Antibiogramme

C'est la méthode de référence pour la détermination des phénotypes de résistance des bactéries après isolement. Il peut se faire sur milieu gélosé comme en milieu liquide (automatisé).

On distingue principalement 2 types sur milieu solide: la diffusion en milieu gélosé et la méthode de gradient en gélose (Etest).

La méthode en diffusion gélosée reste largement utilisée et est basée sur la formation d'un gradient de concentration en gélose de l'antibiotique (ATB) par diffusion radiale à partir d'un disque imprégné de cet ATB et placé sur gélose. Certains ATB diffusent mal en milieu gélosé et le CA-SFMdéconseille la technique pour ces antibiotiques comme la colistine, et la vancomycine (CA-SFM 2018).La méthode en diffusion gélosée est applicable à la majorité des bactéries. Il existe actuellement des systèmes de lecture automatisée.

La méthode en gradient de concentration sur gélose se fonde sur l'utilisation d'une bandelette au verso de laquelle des spots en quantité croissante de l'ATB étudié sont placés.Lorsque la bandelette est placée sur une gélose préalablement ensemencée, un gradient continu d'ATB croissant du bas vers le haut se crée. Après incubation, une zone d'inhibition en forme d'ellipse est apparente permettant la lecture de la CMI à l'intersection basse avec la bandelette. C'est une méthode évaluée pour de nombreux ATB et largement utilisée au laboratoire surtout quand la détermination de CMI est recommandée (CA-SFM 2018).

2. Outils de détection rapide

2.1 Tests immunochromatographiques

Ce sont des tests qualitatifs rapides basés sur les réactions antigènes-anticorps. On peut citer entre autres le test Coris qui permet la détection des carbapénèmases (OXA 48/48 like, NDM, KPC et VIM) à partir des colonies, ainsi que le NG-Test CTX-M MULTI pour la détection des BLSE type CTX-M qui sont les plus répandues parmi les BLSE. Ce test permet la mise en évidence des CTX-M des groupes 1, 2, 8, 9,25. La détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus aureus peut se faire également par des tests immunochromatographiques qui mettent la présence des PLP2a.

2.2 Tests chromogéniques

Les tests chromogéniques les mieux connus sont des tests complémentaires de l'antibiogramme pour rendre un résultat fiable.Le plus utilisé est le test à la nitrocéfine, une céphalosporine chromogène. La détection de production de â-lactamase par un test chromogénique est recommandée par le CA-SFM dès l'isolement de certaines bactéries comme Haemophilus spp, Neisseria gonorrhoeae et Moraxella catarrhalis (CA-SFM 2018).

Le â-LACTA^TM Test, basé sur l'hydrolyse d'une céphalosporine chromogène (HMRZ-86) en présence d'une â-lactamase. Ce testinitialement conçu pour la détection de production de â-lactamasesur coloniea vu ses applications dérivées à des produits pathologiques notamment les hémoculturespositives et les culots urinaires.

La céphalosporine chromogène HMRZ-86 n'est pas hydrolysée par lesâ-lactamases types SHV1 et TEM1, elle est cependant sensible aux BLSE, carbapénèmases (KPC et MBLs) et aux céphalosporinases acquises.

2.3 Tests de biologie moléculaire

Les tests moléculaires de mise en évidence des gènes de résistances sont très peu utilisés en routine en raison de leur coût. Toutefois quelques-uns sont utilisés notamment dans des situations d'urgences pouraider à la décision d'antibiothérapie. Dans le cadre des PCR simplex, on peut citer le CEPHEIDen technologie gèneExpert pour l'identification de Staphylococcus aureus et son gène mecA dans les bactériémies à staphylocoques. Des cassettes CARBA sont également utilisées pour la mise en évidence des gènes qui gouvernent l'expression des carbapénèmases.

Dans les PCR multiplex, outre le filmaray® qui a déjà fait ses preuves et actuellement utilisé dans certains laboratoires,l'appareil ePlex® de GenMark propose un panel d'identification de BGN ainsi que les gènes de résistances associés. En expérimentation sur les produits pathologiques, il pourrait être l'un des outils de détection de la résistance bactérienne dans un futur proche dans les laboratoires de routine.

DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE

1. Objectif général

Evaluer les performances diagnostiques des 3 testspour la détection des BLSE à partir des urines et des flacons d'hémocultures positives à BGN.

2. Objectifs spécifiques

- Déterminer la sensibilité de l'automate ePlex® pour l'identification des espèces et la détection des gènes de résistance ;

- Evaluer les performances des cassettes immunochromatographiques pour la détection des BLSE à partir des échantillons d'urines et d'hémocultures ;

- Déterminer la sensibilité et la spécificité du â-LACTA^TM test dans la mise en évidence de la résistance aux C3G par production de BLSE.

3. Cadre d'étude

Le service de bactériologie de l'hôpital Saint Louis a servi de cadre d'étude. L'hôpital Saint Louis est situé au dixième arrondissement de la ville de Paris et constitue avec l'hôpital Lariboisière et Fernand Vidal le Groupe Hospitalier Universitaire Saint Louis-Lariboisière-Fernand Vidal, rattaché à l'université Paris VII.

4. Type d'étude

Il s'agit d'une étude prospective qui s'est déroulée du03 Mai au 28 Septembre 2018.

5. Analyse des échantillons

5.1 Matériel biologique

Les échantillons d'urines collectés dans des tubes monovettesavec comme critères d'inclusion une leucocyturie = 100/mm³et la présence de BGN (>1 bacille par champs) ainsi que les flacons d'hémocultures positives avec la présence de BGN à l'examen microscopique ont servi à la réalisation de ce travail.

5.2 Prise en charge des hémocultures positives à Saint Louis (figure 2)

Les flacons d'hémocultures positives subissent les étapes de l'examen cytobactériologique suivantes :

J0 : sont réalisés au premier jour de la positivité d'un flacon d'hémoculture, l'examen microscopique après coloration de Gram, l'ensemencement sur milieu gélosé, l'identification au MALDI-TOF-MS et la réalisation de l'antibiogramme à partir de la suspension d'hémoculture si présence de BGN à l'examen microscopique.

J1 : rendu des antibiogrammes réalisés en milieu solide et transmission de souches isolées (cocci à Gram positif) pour l'antibiogramme en milieu liquide.

J2 : rendu des antibiogrammes des cocci à Gram positif et conservation des souches.

Figure 2: procédure de prise en charge des hémocultures positives à Saint Louis

5.3 Prise en charge des échantillons d'urines à l'hôpital Saint Louis

A l'hôpital Saint Louis, l'examen cytobactériologique des urines est réalisé suivant les 3 étapes classiques que sont : l'examen direct, la culture et l'antibiogramme.

Examen direct : la numération des éléments cellulaires (hématies et leucocytes), ainsi que la détection de bactéries dans l'urinesont réalisées sur l'automate UF500i de bioMérieux.La coloration de Gram n'est réalisée que sur les urines dans lesquelles l'automate a détecté la présence de bactéries.

Culture et identification : les urines sont ensemencées sur milieu chromogène (gélose URI4) et incubées à 37°C pendant 18 à 24h. Les bactéries obtenues en culture sont identifiées par spectrométrie de masse (VITEK2 SM de bioMérieux) comme suit:

Au moyen d'öses, les colonies bactériennes ont été prélevées puis étalées sur les cibles de la lame pour spectrométrie. La lame est ensuite mise à sécher à l'étuve. Enfin, 1 ul de matrice a été ajouté sur chaque dépôt et le tout a été mis à sécher avant de passer la lame au MALDI-TOF-MS.

Antibiogramme :l'antibiogramme en milieu liquide sur VITEK2 a été le plus couramment réalisé à l'hôpital Saint Louis. La méthode par diffusion n'est effectuée que pour les cas nécessitant des tests complémentaires afin d'étayer au mieux les phénotypes de résistance.L'ADAGIO a été l'automate de lecture utilisé pour l'antibiogramme en milieu solide.

5.4 Test chromogénique de détection de la résistance aux C3G

5.4.1 Matériel nécessaire

La réalisation des tests chromogéniques a nécessité l'utilisation d'une micro centrifugeuse pour l'obtention des culots dans des tubes Eppendorf ainsi que des réactifs R₁et R₂ du â-LACTA^TM Test lot numéro 64160447 pour la mise en évidence de la production de â-lactamases. Le matériel utilisé pour la réalisation du â-LACTA^TM Test est représenté dans la figure 4.

5.4.2 Réalisation du test à partir des flacons d'hémocultures

Dans un tube Eppendorf, 1 ml de suspension de sang a été transféré au moyen d'une pipette,50 ul de triton 10% ont été ajouté puis laisser reposer pendant 10 minutes et passer au vortex pendant 5 secondes. Le mélange est ensuite centrifugé à 13000 tours par minutes pendant 2 minutes. Après élimination du surnageant, le culot est repris en suspension dans 500 ul d'eau distillée par pipetage aller/retour. Après une seconde centrifugation à 13000 tours par minutes pendant 2 minutes, le surnageant est éliminé à nouveau. Enfin, une goutte de réactifs R1 et une goutte de réactifs R2 de â-LACTA^TMpréalablement sorti à température du laboratoire sont ajoutées au culot et remise en suspension. La lecture de la coloration du mélange à T=15 minutes a été réalisée.

5.4.3 Réalisation du test à partir des échantillons d'urines

Les urines positives à BGN répondant aux critères d'inclusions sus cités ont fait l'objet de test de mise en évidence de bactéries résistantes aux céphalosporines de 3^ème génération par production de béta-lactamases suivant le protocole ci-dessous.

Au total, 1,5 ml d'urine ont été transférés à l'aide d'une pipette dans un tube Eppendorf, puis centrifugés à 3000 tours par minute pendant 5 minutes. Après élimination du surnageant, une goutte du réactif R1 et une goutte du réactif R2 du â-LACTA^TMpréalablement sortis à température du laboratoire pendant 10 minutes ont été ajoutées au culot. Le mélange est remis en suspension au moyen d'une pipette tout en évitant la formation de mousse.

La lecture de la coloration du mélange a été faite à T=15 minutes et T=30 minutes. Suivant les recommandations du fabricant la lecture doit se faire à 15 minutes avec l'interprétation sus citée.

5.5 Identification des espèces bactériennesà partir des culots

5.5.1 Matériel nécessaire

Le matériel ayant servi à l'identification des espèces bactériennes à partir des culots d'urines et d'hémocultures est représenté dans la figure 5.

Figure 5: Matériel nécessaire à l'identification des germes au spectromètre de masse

A= Pipette + matrice + lame de spectrométrie + E. coli de contrôle, B = MALDI-TOF-MS,

5.5.2 Réalisation des identifications

Le test au â-LACTA^TM était systématiquement couplé à l'identification d'espèce bactérienne à partir des culots en spectrométrie de masse suivant la procédure ci-après.

Dans un tube Eppendorf, 1,5 ml d'urine ou de suspension d'hémoculture ont été transférés à l'aide d'une pipette,puis centrifugés à 3000 tours par minute pendant 5 minutes. Après élimination du surnageant, le culot a été repris dans 500 ul d'eau distillée puis remis en suspension par pipetage aller/retour. Cette suspension est ensuite centrifuger à 13000 tours par minute pendant 2 minutes, le surnageant est à nouveau éliminé et le culot a été repris dans 50 ul d'éthanol pure (éthanol 100%). Au moyen d'une pipette, 1 ul de la suspensiona été déposé dans la cible puis séché à l'étuve à 37°C. Enfin, 1 ul de matrice a été ajouté sur chaque dépôt ; le touta été mis à sécher avant de passer la lameau MALDI-TOF-MS.

5.6 Test immunochromatographique de détection de BLSE

5.6.1 Matériel nécessaire

Les Cassettes CTX-M lot numéro 180604-01, une solution d'extraction, des tubesEppendorf et des micropipettes de 100ul ont servi à la réalisation de ce test (figure 6).

Figure 6: Matériel pour la réalisation du test immunochromatographique NG-Test-CTX-M

5.6.2 Réalisation du test

La réalisation de test CTX-M a été faite directement à partir des échantillons comme suit :

Dans un tube Eppendorf, 5 gouttes (environ 150ul) de réactif et 5 gouttes d'échantillons (urines ou suspension d'hémoculture) ont été mélangées au moyen d'une pipette. Après homogénéisation du mélange au vortex, 100ul ont été déposés au moyen d'une pipette à usage unique destinée à cet effet sur la petite rigole de la cassette immunochromatographique. Le mélange migre par capillarité le long de la cassette, les résultats ont été lus dans les 15 à 20 minutes suivant le dépôt :

- une seule bande rouge apparait dans de la zone de contrôle(C) : test négatif

- 2 bandes rouges apparaissent respectivement dans les zones de C et dans la zone test (T) :test positif

5.7 Analyse des échantillons sur l'automate ePlex® de GenMark

5.7.1 Matériel nécessaire

Les cartouches GenMark RUO lot numéro 53043525 et CE lot 53111999, une pipette calibrée de 50ul, et l'automate ePlex® de GenMark ont servi à l'identification d'espèces et de gènes de résistance (figure 7).

La technologieePlex® de GenMark repose sur un principe de PCR multiplex, elle est entièrement automatisée et permet l'identification d'espèce et de gènes de résistance. Le temps requis pour l'identification d'un germe est de 1h37 minutes. Cette technologie propose actuellement trois panels : un panel Gram positif, un panel de fungi et un panel Gram négatif, ce dernier est celui utilisé dans notre étude, il permet la détection de 21 bactéries à Gram négatif et de 6 gènes de résistance (figure 8).

5.7.2 Réalisation du test

La préparation et le chargement des cartouches sur l'appareil ePlex® a suivi le protocole ci-contre.

Les cartouches ePlex® de GenMark ont été ramenées à température ambiante du laboratoire avant leur utilisation.Un code-barres d'identifiant échantillon correspondant au code-barres de l'échantillon principal a été appliqué sur la cartouche. Après homogénéisation de l'échantillon par retournement du tube, 50 ul ont été prélevés au moyen d'une pipette calibrée et transférés dans l'orifice d'échantillonnage sur la cartouche. Le bouchon a ensuite été tourné de 90° dans le sens des aiguilles d'une montre et pressé pour fermer la cartouche. Les codes-barres de la cartoucheont été balayés au lecteur. Après une lecture réussie du code-barres de numéro unique d'identification de la cartouche et du code-barres d'identifiant échantillon, le lecteur émet un bip et la LED clignote en vert pour indiquer la réussite de la lecture. La cartouche est ensuite insérée dans l'une des baies prêtes, indiquées par une LED blanche clignotante. Le système fait correspondre cet identifiant échantillon avec la baie et lance automatiquement le test.

6. Traitement des données

Les données issues de cette étude ont été saisies sur Excel 2016. Les calculs statistiques pour l'évaluation des performances des différentes techniques ont été également réalisés sur Excel 2016. EPI INFO version 7.2.2.6 a servi à la réalisation des comparaisons entre les différentes valeurs avec P< 5% comme seuil de signification statistique. Les références ont été générées par Zotero-5.0.56.

RESULTATS

1. Aspects épidémiologiques

1.1 Total des échantillons analysés

Au total, 53 échantillons d'urines et 52 hémocultures non redondants ont été inclus dans cette étude.

Parmi les 52 hémocultures positives, 47 (90,4 %) flacons aérobies et 5 (9,6 %) flacons anaérobies ont été enregistrés.Quant aux 53 échantillons d'urines, ils sont issus de 29 femmes (55%) contre 24 hommes (45%), soit un sex-ratio Homme/Femme de 0,83.

1.2 Espèces responsables d'ITU et de bactériémie

Les échantillons positifs à BGN ont fait l'objet d'identification directe sur ePlex®, et sur spectrométrie de masse (MALDI-TOF-MS) à partir des colonies isolées en culture (tableau 1 et 2)

Tableau I: Récapitulatif des espèces identifiées, ePlex® versus MALDI-TOF-MS à partir des urines

	Identification par automate ePlex® de GenMark			Identification par MALDI-TOF-MS après culture		Concordance d'identification
Espèces	Positif	Négatif	Echec	Positif	Négatif	ePlex® Vs Culture
Escherichia coli	33	2	2	37	0	33/35
Klebsiella pneumoniae	10	0	0	10	0	10/10
Klebsiella oxytoca	1	0	0	1	0	1/1
Enterobacter cloacae	2	0	1	3	0	2/2
Providencia rettgeri	Hors panel			1	0	-
Pseudomonas aeruginosa	0	0	1	1	0	0
Bacteroidesfragilis	1	0	0	-	1	-
Staphcoagnég	Pan Gram positive = 1			1	0	-
Strepto B	0	1	0	1	0	-
Total	47	4	4	55	1	46/48 (95,8%)

TableauII: Récapitulatif des espèces identifiées ePlex® versus MALDI-TOF-MS à partir des hémocultures positives

Espèces	Identification par automate ePlex® de GenMark			Identification par MALDI-TOF-MS après culture		Concordance d'identification
Espèces	Positif	Négatif	Echec	Positif	Négatif	ePlex® Vs Culture
Escherichia coli	20	1	0	21	0	20/21
Klebsiella pneumoniae	5	0	0	5	0	5/5
Klebsiella oxytoca	1	0	0	1	0	1/1
Enterobacter cloacae	3	0	0	3	0	3/3
Morganella morganii	1	0	0	1	0	1/1
Proteus mirabilis	1	0	0	1	0	1/1
Salmonella sp	1	0	0	1	0	1/1
Pseudomonas aeruginosa	6	0	1	7	0	6/6
Fusobacteriumnecrophorum	0	1	0	1	0	0/1
Stenotrophomonasmaltophilia	1	0	0	1	0	1/1
Acinetobacterbaumanii	2	0	0	2	0	2/2
Acinetobacterlwoffii, Campylobacter coli, Pseudomonas oryzyhabitans, Pseudomonas stutzeri	Hors panel			1 1 1 1	0	- - - -
Paenibacilusresidui	Hors panel			-	1	-
Bacillus subtilis	Pan Gram positive = 1			1		-
Bacillus licheniformis	Pan Gram positive = 1			1	0	-
Staphylococcus epidermidis	Pan Gram positive=2 Echec = 1			3	0	-
Staphylococcus hominis	Pan Gram positive= 1			1	0	-
Staphylococcus haemolyticus	Pan Gram positive= 1			1	0	-
Total	41	2	1	55	1	41/43 (95,3 %)

1. 3 Résistance aux antibiotiques

1.3.1 Phénotypes de résistance des entérobactéries isolées

Les phénotypes de résistance des entérobactéries isolés sont représentés dans les figures 9 et 10. On enregistre 9 BLSE dans les bactériémies contre 11 dans les ITU mais il n'existe aucune différence significative dans la survenue d'une infection à BLSE en fonction du site d'infection dans cette étude, P = 0,7.

Figure 9: Répartition des phénotypes des entérobactéries isolées dans les hémocultures

Parmi les entérobactéries isolées dans les hémocultures, 27,3% (9/33) était productrice de BLSE dont 7 E. coli et 2 Klebsiella pneumoniae.

Figure 10: Répartition des phénotypes des entérobactéries isolées dans les urines

Les entérobactéries uropathogènes isolées, étaient productrices de BLSE dans 21,2 % (11/52). Au sein des espèces majoritaires, 21,6 % (8/37) de E. coli contre 27,3 % (3/11) de Klebsiella spétaient productrices de BLSE.Il y avait autant de souches sauvages que de souches productrices de pénicillinases de haut niveau (35 %) au sein des E. coli isolés.

Toutes les bactéries productrices de BLSEisolées avaient une résistance associée aux quinolones (100% des BLSE était résistant à l'ofloxacine). Cependant, elles ont été toutes sensibles aux carbapénèmes (100% de sensibilité vis-à-vis de l'ertapénème).

La prévalence d'entérobactéries uropathogènes productrices de BLSE dans cette étude était d'environ 21,2 %. Un patient sur cinq faisait donc une ITU à BLSE.

Plus de 27 % des klebsielles isolées étaient productrices de BLSE contre 21,6 % des E. coli.

1.3.2 Répartition des BLSE issues des uroculturesen fonction des services

La majorité des BLSE isolées était issue du service de néphrologie. La répartition des BLSE

Dans le service de néphrologie, 54,5% des ITU étaient essentiellement dues à des bactéries productrices de BLSE. Aucun patient des urgences médicales ne faisait une ITU à BLSE.La forte prévalence des BLSE en néphrologie pourrait s'expliquer par le long séjour des patients et le port des sondes. Une intensification de la lutte contre la transmission des BLSE par des activités de dépistage et d'isolement systématique des patients dans ce service s'impose.

2. Performances diagnostiques des tests

2.1 Identification sur MALDI-TOF-MS à partir des culots de produits pathologiques

Les résultats de l'identification sur MALDI-TOF-MS à partir des culots de centrifugation sont consignés dans le tableau ci-dessous.

TableauIII: Résultats de l'identification sur MALDI-TOF-MS à partir des culots de centrifugation

Tous les échantillons d'urines (100 %) ont bénéficié d'un test d'identification sur MALDI-TOF-MS à partir du culot. Des résultats mitigés ont été enregistrés. En effet, 17% (9/53) d'identification correcte ont été enregistré.

2.2 Identification des espèces sur l'automate ePlex® de GenMark

Parmi les bactéries isolées dans les hémocultures, 44 BGN du panel, 4 BGN et 3 BGP hors panel GN de ePlex® ainsi que 5cocci à Gram positif ont été enregistrés. Dans les 44 BGN identifiés en culture faisant partir du panel Gram négatif de ePlex®, 1 échec, 3 tests négatifs ont été enregistrés et 41 bactéries ont été détectées sur ePlex®, soit une concordance de 95,3 % (41/43).

Dans les 53 échantillons d'urines, 56 souches bactériennes ont été identifiées en culture dont 52BGN du panel GN de ePlex®, 1 BGN anaérobie, 1BGN hors panel et 2 cocci à Gram positifont été enregistrés.Parmi les 52 BGN identifiés en culture faisant parti du panel GN de ePlex®, 4 échecs ont été enregistrés, 2 tests négatifs et 46 (95,8%)bactéries ont été identifiées sur ePlex®.

Les concordances diagnostiques de l'automate ePlex® de GenMark pour l'identification des espèces bactériennes étaient de l'ordre de 95 % dans les deux produits pathologiques étudiés (tableau 1 et 2).

2.3 Détection des gènes de résistance sur ePlex®

Sur un total de 12 entérobactéries uropathogènes résistantes aux C3G isolées dans les urines, 11 BLSEet 1 HCASE ont été enregistrées. 9/11 BLSE de type CTX-Mont étédétectées sur ePlex®, 1 échec d'identification et 1 test négatif ont été enregistrés.

Quant aux 9 entérobactéries productrices de BLSE isolées dans les hémocultures, 8/9 BLSEde type CTX-M ont été mise en évidence sur ePlex®. Un échec d'identification d'un E. coli BLSE a également été enregistré.

Les résultats des performances diagnostiques de ePlex®, dans la détection des gènes de résistance sont consignés dans le tableau 4.

TableauIV: Performance diagnostiques de ePlex® dans la détection des gènes de résistance

Echantillons d'urines
Résultats du test ePlex®	Présence de BLSE	Absence de BLSE	Total
Positif	9	1	10
Négatif	2	36	38
Total	11	37	48
Sensibilité= 81,8% VPP=90% Spécificité=97,3% VPN=94,7%
Hémocultures
Résultats du test ePlex®	Présence de BLSE	Absence de BLSE	Total
Positif	8	0	8
Négatif	1	24	25
Total	9	24	33
Sensibilité= 88,9% VPP= 100% Spécificité=100 % VPN= 96%

Les 2 bactéries productrices de BLSE résistantes aux C3G dont aucungène de résistance n'a été mis en évidence dans les urines sont des E. coli : l'une n'a pas été détectée sur l'automate ePlex® et l'autre a été détectée sans gène de résistance associé.

2.4Détection des BLSE par les tests immunochromatographiques

Tous les échantillons retenus ont fait l'objet de la recherche de CTX-M par les cassettes immunochromatographiques. 10/11 desBLSE issus des urines ont été positives au test CTX-M. La BLSE non détectée avait un mécanisme de résistance autre que la production de CTX-M.

Toutes les 9 BLSE issues des hémocultures ont été détectées par les cassettes immunochromatographiques. La sensibilité et la spécificité diagnostiques des cassettes immunochromatographiquessont consignées dans le tableau 5.

Echantillons d'urines
Résultats NG-Test-CTXM MULTI	Présence de BLSE	Absence de BLSE	Total
Positif	10	1	11
Négatif	1	40	41
Total	11	41	52
Sensibilité = 90,9 % VPP= 90,9 % Spécificité= 97,6 % VPN= 97,6 %
Hémocultures
Résultats NG-Test-CTXM MULTI	Présence de BLSE	Absence de BLSE	Total
Positif	9	0	9
Négatif	0	24	24
Total	9	24	33
Sensibilité = 100 % VPP= 100 % Spécificité= 100 % VPN= 100 %

Les entérobactériesrésistantes aux C3G isolées avaient comme principal mécanisme de résistance la production de BLSE de type CTX-M, 83,3 % (10/12) des cas dans les urines et 100% des cas dans les hémocultures.

2.5Mise en évidence de la résistance aux C3G par le test â-LACTATM

Le test â-LACTA^TMa été réalisé sur tous les échantillons d'urines et d'hémocultures à partir du culot. Les résultats sont consignés dans le tableau 6.

TableauVI: Résultats du test â-LACTATM pour la détection de la résistance aux C3G par production de BLSE

	Echantillons d'urines
Résultats â-LACTAtest		Présence de BLSE	Absence de BLSE	Ininterprétable	Total
Positif		9	1	0	10
Négatif		2	40	0	42
Total		11	41	0	52
	Sensibilité= 81,8 % VPP=90 % Spécificité = 97,6 % VPN= 95,2 %
	Hémocultures
Résultats â-LACTAtest		Présence de BLSE	Absence de BLSE	Ininterprétable	Total
Positif		9	0	0	9
Négatif		0	23	1	24
Total		9	23	1	33
	Sensibilité = 100 % VPP = 100 % Spécificité = 95,8% VPN= 100 %

Le test â-LACTA^TMa été positif dans 10 cas sur 12 bactéries uropathogènes résistantes aux C3G, avec 5 échantillons positifs en moins de 15 minutes et 5 échantillons positifs entre 15 et 30 minutes. Suivant les critères établis par le fournisseur, la sensibilité du test dans cette étude était de 45,5%. Selon les critères de lectures utilisés dans cette étude, la sensibilité diagnostic du test â-LACTA^TM était de 81,8 %.

Le â-LACTA^TMtest, couplé à l'identification précoce par MALDI TOF MS permet une détection précoce des BLSE dans les hémocultures.

2.6 Résultats comparés du diagnostic de la résistance aux C3G par production de BLSE

Les performances des trois tests pour la détection de la résistance aux C3G par production de BLSE sont résumées dans les figures 12 et 13 ;

Les performances diagnostiques de l'automate ePlex® sont similaires à celles du â-LACTA^TMtest. Le test immunochromatographique a montré de meilleurs résultats. Toutefois, les résultats de cette étude montrent que ces trois tests sont suffisamment bons pour être recommandés dans la détection rapide des BLSE dans les bactériémies et les ITU.

Figure 12: Comparaison des performances diagnostiques des techniques de détection de la résistance aux C3G par production de BLSE dans les urines.

* présence d'une (1) urine polymicrobienne (E. cloacae et K. pneumoniae isolés dans un échantillon).

Figure 13: Comparaison des performances diagnostiques des techniques de détection de la résistance aux C3G par production de BLSE dans les hémocultures

DISCUSSION

1. Aspects épidémiologiques

1.1 Répartition des échantillons analysés

53 échantillons d'urines et 52 hémocultures non redondants ont été analysés. Parmi les 52 hémocultures positives, 47 (90,4 %) flacons aérobies et 5 (9,6 %) flacons anaérobies ont été enregistrés.La fréquence élevée de la positivité des flacons aérobies s'expliquerait par la prédominance des bactéries aérobies ou anaérobies tolérantes en l'occurrence les entérobactéries dans les bactériémies à BGN.

Quant aux 53 échantillons d'urines, ils sont issus de 29 femmes (55%) contre 24 hommes (45%), soit un sex-ratio Homme/Femme de 0,83.Les ITU sont les infections bactériennes les plus communes chez la femme, et un motif fréquent de consultation en médecine générale. On estime que 75% des infections urinaires concernent des femmes et plus de 50 % des femmes feront un jour un épisode d'ITU (Foxmanet al., 2002 ; Merisier et al., 2014).

1.2 Fréquence des germes responsables de bactériémie

Au total, 56 souches bactériennes ont été identifiées en culture à partir des 52 flacons d'hémocultures dont 48 BGN, 3 BGP et 5 CGP. Les bactériémies à BGN étaient essentiellement dominées par les entérobactéries qui représentaient environ 69 % (33/48) des cas, avec E. coli en tête 43,7 % (21/48). Les entérobactéries constituent l'une des principales étiologies des bactériémies potentiellement mortelle. Mizrahiet al. (2018) ont rapporté que sur 335 épisodes de bactériémies à BGN, 81,2% (272/335) était causé par des entérobactéries avec E. coli en tête 51% (171/335).

1.3 Fréquence des germes responsables d'infection du tractus urinaire

Au total, 56 souches bactériennes ont été identifiées en cultures à partir des 53 urines. Les entérobactéries représentaient 93 % des espèces (52/56) dont le chef de fil (E. coli) représentait 66 % (37/56) de l'ensemble suivi des espèces du genre Klebsiella qui constituaient 19,6 % (11/56) des isolats. L'implication des entérobactéries dans les ITU n'est plus à démontrer. En milieu communautaire comme hospitalier, les étiologies des ITU sont dominées par les entérobactéries. La physiopathologie ascendante de l'ITU ainsi que la forte colonisation du périnée par les entérobactéries, associées aux facteurs spécifiques d'uropathogénicité telles que les adhésines bactériennes capables de se lier à l'épithélium urinaire expliqueraient cette prédominance. Ces résultats sont similaires à ceux décrits dans la littérature. En effet, des auteurs avaient rapporté des prévalences de 80 à 92 % d'entérobactéries uropathogènes avec 57 à 73 % de E. coli (Sarkiset al., 2017 ; Hailajiet al., 2016 ; Sbitiet al., 2017).

Dans cette étude, les espèces du genre Klebsiella viennent en deuxième position après les colibacilles dans les ITU. Ce même constat avait été fait par Hailajietal. (2016)qui avaient rapporté que les klebsielles représentaient 24 % des bactéries uropathogènes et qu'elles venaient en seconde position après E. coli.

1.4 Fréquence des BLSE parmi les entérobactéries isolées dans les hémocultures

Parmi les entérobactéries isolées dans les hémocultures, 27,3% (9/33) était productrice de BLSE. Ces résultats sont similaires à ceux rapportés par Mainardiet al.ainsi que Walewski et al. (2015)qui ont retrouvé qu'environ 30 % des entérobactéries isolées dans les bactériémies était résistantes aux C3G dont 17,8 à 24 % de BLSE.

1.5 Fréquence des entérobactéries uropathogènes productrice de BLSE

Les entérobactéries uropathogènes isolées, étaient productrices de BLSE dans 21,2 % (11/52). Au sein des espèces majoritaires, 21,6 % (8/37) de E. coli contre 27,3 % (3/11) de Klebsiella sp étaient productrices de BLSE. Il y avait autant de souches sauvages que de souches productrices de pénicillinases de haut niveau (35 %) au sein des E. coli isolés.

Toutes les bactéries productrices de BLSE isolées avaient une résistance associée aux quinolones (100% des BLSE était résistant à l'ofloxacine). Cependant, elles ont été toutes sensibles aux carbapénèmes (100% de sensibilité vis-à-vis de l'ertapénème).

La prévalence d'entérobactéries uropathogènes productrices de BLSE dans cette étude était d'environ 21,2 %. Un patient sur cinq faisait donc une ITU à BLSE. Un constat similaire avait été rapporté par Sarkisetal. (2017) au Liban qui avait montré que 23 % des entérobactéries isolées étaient productrices de BLSE. Toutefois la prévalence des BLSE dans les entérobactéries uropathogènes est très variée dans le temps et dans l'espace en fonction des études. En effet, au cours des années 2004, les pays du sud de l'Europe enregistraient des prévalences de BLSE pouvant aller jusqu'à 10 % contre 5 % dans les pays du Nord (Nijssenetal., 2004). Des études menées respectivement au Maroc et en Mauritanie entre 2013 et 2015 ont rapporté des prévalences de BLSE nettement inférieures aux résultats de cette étude, allant de 10,25 à 13,77 % (Hailajietal., 2016 ; Sbitietal., 2017). Ouedraogoet al. (2017) au Burkina Faso ont rapporté des prévalences de 57,8% chez les entérobactéries uropathogènes. La fréquence élevée des BLSE dans cette étude pourrait s'expliquer par la spécificité de la structure hospitalière. En effet, l'hôpital Saint Louis a une cohorte importante de patients immunodéprimés dont la majorité est sous antibioprophylaxie, ce qui serait sans doute à l'origine de la sélection des bactéries productrices de BLSE.

Plus de 27 % des klebsielles isolées étaient productrices de BLSE contre 21,6 % des E. coli, ces résultats sont similaires à ceux rapportés par Hailajiet al. (2016). Des prévalences plus élevées 62,7% de Klebsiella BLSE contre 58,8% de E. coli BLSE ont été retrouvées au Burkina Faso (Ouedraogoetal., 2017).

2. Performances diagnostiques des tests

2.1 Performances du MALDI-TOF-MS dans l'identification d'espèces bactériennes à partir des culots de centrifugation

Des résultats mitigés ont été enregistrés lors de l'identification d'espèces bactériennes à partir du culot urinaire. En effet, 17% (9/53) d'identification correcte ont été enregistré. Toutefois, des études de comparaison de la spectrométrie de masse aux techniques classiques d'identification bactérienne ont conclu que la technique MALDI-TOF-MS était une méthode prometteuse dans l'identification des bactéries directement à partir du culot urinaire obtenu après centrifugation à faible vitesse suivie d'une centrifugation à grande vitesse. Cette technique serait plus sensible si les urines sont mono microbiennes avec une bactériurie = 10⁵(Ferreira etal.,2010). En outre, la technique pourrait être optimisée par une précipitation à l'éthanol des protéines du culot obtenu après la double centrifugation, suivie d'une remise en suspension de celui-ci par de l'acide formique et de l'acétonitrile(Ferreira et al., 2011).

L'établissement d'un protocole standard d'identification des bactéries au MALDI-TOF à partir du culot urinaire sur un nombre important d'échantillon s'avère donc indispensable pour uniformiser les pratiques et optimiser cette technique.

Quant aux hémocultures, l'identification à partir des culots de suspensions a été réalisée sur 45échantillons dont 71 % (32/45) d'identification correcte. L'identification bactérienne par MALDI-TOF-MS à partir des suspensions d'hémocultures a donné des meilleurs résultats comparativement au culot urinaire, P < 0,001. Ces bonnes performances sur les flacons d'hémocultures s'expliqueraient par la présence d'un protocole standard validé ; en outre les hémocultures étant des milieux d'enrichissement, la charge bactérienne serait nettement plus élevée comparativement aux urines.Mizrahiet al. (2018) ont rapporté que la technique MALDI-TOF-MS est performante dans le diagnostic précoce des bactériémies à BGN et contribue à une antibiothérapie précoce adaptée avec une sensibilité diagnostique de 89,8 %.

2.2 Performances de l'automate ePlex® pour l'identification des espèces à partir des produits pathologiques

Les concordances diagnostiques de l'automate ePlex® de GenMark pour l'identification des espèces bactériennes étaient respectivement de 95,8 % (46/48) dans les urines contre 95,3% (41/43) dans les hémocultures. Très peu de données sur cet appareil dans l'analyse des urines existent dans la littérature. Cependant, il pourrait être d'un grand intérêt dans la prise en charge rapide des ITU. Casparet al. (2017) ont rapporté des sensibilités de 90 % dans l'identification d'espèces bactériennes à partir des flacons d'hémocultures positives à BGN.

2.3 Performances de l'automate ePlex® pour la détection des gènes de résistance

Les Sensibilités et spécificités diagnostiques de l'automate ePlex® pour la détection des BLSE variaient respectivement entre 81,8 - 88,9 % et 97,3%- 100 %.

Aucune étude d'évaluation de cet appareil pour la détection des gènes de résistance dans les urines n'a été retrouvée dans la littérature. Cependant, une sensibilité de 90 % avait été rapportée par Casparetal.(2017) dans leur étude sur la détection de BLSE à partir desflacons d'hémocultures positive à BGN. Ces mêmes auteurs avaient montré que l'automate ePlex® offre la possibilité d'une antibiothérapie efficace, précoce et rationnelle tout en préservant les carbapénèmes qui sont les antibiotiques de derniers recours.

Il ressort de cette étude que les performances diagnostiques de l'automate ePlex® sont suffisamment bonnes pour son utilisation dans la détection de la résistance bactérienne directement à partir des produits pathologiques (urines et hémocultures). Cependant le nombre de gènes inclus dans le panel reste limité bien que ceux-ci soient les plus fréquemment incriminés dans la multirésistance.

2.4 Performances du NG-Test-CTX-M MULTI dans la détection des BLSE

Les paramètres sensibilité et spécificité diagnostiques des cassettes NG-Test-CTX-M MULTI étaient respectivement de 90,9 % et 97,6 % dans les ITU et 100% dans les bactériémies. Le NG-Test CTX-M MULTI est d'un grand intérêt dans la détection rapide des BLSE. C'est un test simple à réaliser qui peut être pratiqué dans tous les laboratoires et même dans le cabinet du médecin généraliste. En outre, la majeure partie des BLSE isolées actuellement en clinique sont de type CTX-M. Leur apparition dans ces dernières décennies a inversé la tendance épidémiologique faisant d'elles les plus répandues et les plus fréquentes dans le monde entier, indépendamment du milieu (hospitalier ou communautaire) (Ruppéet al., 2010).

2.5 Performances du â-LACTATMtest dans la détection des BLSE

Suivant les critères établis par le fournisseur, la sensibilité du test dans cette étude pour ce qui concerne les échantillons d'urines était de 45,5 %. Selon les critères de lectures utilisés dans cette étude, la sensibilité diagnostic du test â-LACTA^TM était de 81,8 %. Jonas et al. (2016) dans une étude d'optimisation de l'utilisation du test â-LACTA^TM avaient trouvé une sensibilité similaire de l'ordre de 81 %. Ces résultats confortent une fois de plus que les conditions d'utilisation et d'interprétation du test â-LACTA^TMdans la mise en évidence de la résistance aux C3G dans les urines doivent être réadaptées. Gallahetal. (2014) dans le même sens, ont rapporté que tous les cas de tests positifs ou ininterprétables étaient des BLSE.

Tous les échantillons d'hémocultures contenant des BLSE ont été positifs au â-LACTA^TMtest. Une sensibilité de 100%, une spécificité de 95,8% et des valeurs prédictives positives et négatives de 100 % sont les performances diagnostiques du â-LACTA^TMtest pour la détection des BLSE à partir des hémocultures ; des résultats similaires ont été rapportés par Walewski et al. (2015) ainsi que Mizrahiet al. (2018) avec des sensibilités et spécificités respectives de 89,3 - 95,7 % et 100%. Le â-LACTA^TMtest, couplé à l'identification précoce par MALDI TOF MS permet une utilisation efficace et rationnelle des antibiotiques dans les ITU et les bactériémies à BGN.

3. Avantages et limites des trois tests étudiés

Les tests étudiés présentent tous de bonnes performances pour le diagnostic rapide des BLSE. Ils ont en commun, la simplicité, la rapidité et la facilité d'exécution mais aucun test n'est suffisamment parfait pour remplacer l'antibiogramme.

La technique de ePlex®, outre le diagnostic d'espèces et des gènes de résistance présente l'avantage d'être entièrement automatisée et s'affranchit des erreurs dépendant des techniciens. Les résultats sont obtenus en moins de 2 heures. Elle est facilement réalisable en période de service à personnel réduit (garde, astreinte). Elle permet également de prévoir le phénotype bactérien. Cependant, cette technique a un coût très élevé (environ 120 € par test) et implique la disposition de matériel sophistiqué. C'est une technique réservée aux laboratoires spécialisés. Le nombre de gène détecté est assez limité et la présence d'un gène de résistance n'est pas synonyme d'expression du gène.

La technique du â-LACTA^TMtest est la moins coûteuse comparée aux 2 autres. Elle est réalisable dans tout laboratoire disposant d'une centrifugeuse. Les résultats sont obtenus en moins de 30 minutes. Cependant, la lecture des résultats à l'oeil nu est sujette à des erreurs. En plus une bonne interprétation des résultats nécessite une identification couplée du pathogène. Ce test présente une faible sensibilité pour les entérobactéries du groupe 3. Un résultat négatif de â-LACTA^TM test n'exclut pas la présence de bactéries résistantes aux C3G.

Le NG-Test CTX-M MULTI présente l'avantage d'être facilement praticable. Ce test ne nécessite pas l'utilisation de matériel supplémentaire en dehors du kit fourni par le fabriquant. Il est réalisable dans tous les laboratoires et peut être pratiqué dans le cabinet du médecin généraliste. Cependant, son coût est peu élevé comparativement au â-LACTA^TMtest, il ne permet de détecter que les BLSE de type CTX-M.

CONCLUSION

La résistance aux antibiotiques constitue un grand enjeu de santé publique. La lutte contre la résistance bactérienne implique nécessairement l'utilisation des outils de diagnostic rapide.

Il ressort de cette étude que le panel Gram négatif de ePlex® est bien adapté au diagnostic rapide des entérobactéries et à l'identification des gènes de résistance associés. Cette technique, entièrement automatisée pourrait être d'un grand apport dans le diagnostic rapide des ITU et des bactériémies surtout en période de service à personnel réduit dans les hôpitaux. Toutefois, la simplicité et le moindre coût des tests â-LACTA^TMainsi que des cassettes immunochromatographiques CTX-M MULTI font d'eux des alternatives efficaces dans le diagnostic rapide des entérobactéries productrices de BLSE. L'examen direct et la culture demeurent indispensables pour l'amélioration de la sensibilité et de la complémentarité de ces tests.

Recommandations

- Mettre à disposition des biologistes d'astreintes et de gardes, l'automate ePlex® pour améliorer le diagnostic en urgence des bactériémies et des ITU d'allures sévères ;

- Améliorer le rendu des résultats des ECBU à J0 en associant les cassettes CTX-M ou le â-LACTA^TMtest au service du jour.

Etendre les délais de lecture du â-LACTA^TM test à 30 minutes pour le culot urinaire avec considération de tout changement de coloration comme un résultat positif.

Intégrer les tests de diagnostic rapide de la résistance bactérienne dans les laboratoires d'analyses biomédicales.

Perspectives

Au vu des résultats de l'identification des espèces à partir du culot urinaire, l'optimisation du MALDI-TOF-MS pour l'identification des bactéries à partir des urines sera envisagée à la suite de ce travail.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1.Amzalag J, Mizrahi A, Naouri D, Nguyen JC, Ganansia O, Le Monnier A. Optimization of the â LACTA test for the detection of extended-spectrum- â -lactamase-producing bacteria directly in urine samples. Infect Dis.2016 ; 48 (9) : 695?8.

2. Bauernfeind A, Schweighart S, Grimm H. A new plasmidiccefotaximase in a clinical isolate of Escherichia coli. Infection. 1990 ; 18 (5) : 294?8.

3. Bonnet R. â-lactamines et entérobactéries. In Antibiogramme, 3^ème ed., ESKA. 2012: p 165-188.

4. Boutal H. Développement et validation de tests de détection rapide de la résistance aux antibiotiques.Thèse. Université Paris-Saclay, 2017 :245p.

5. Cantón R, Coque TM. The CTX-M â-lactamase pandemic. Curr Opin Microbiol. 2006 ; 9 (5) : 466?75.

6. Caspar DY. Apports des panels BCID à la prise en charge du sepsis. : RICAI 2017.

7. Chanal C, Bonnet R, De Champs C, Sirot D, Labia R, Sirot J. Prevalence of â-lactamases among 1072 clinical strains of Proteus mirabilis: 2 years survery in French hospital. Antimicrob. Agents Chemother.2000. 44: 1930-1935.

8. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, Wolk DM. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry: a Fundamental Shift in the Routine Practice of Clinical Microbiology. ClinicalMicrobiologyReviews. 2013;26(3):547-603.

9. Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie: Recommandations de fevrier 2018.

10. Costelloe C, Metcalfe C, Lovering A, Mant D, Hay AD. Effect of antibiotic prescribing in primary care on antimicrobial resistance in individual patients : systematic review and meta-analysis. BMJ. 2010 ; 340 : c2096?c2096.

11. Donhofer A, Franckenberg S, Wickles S, Berninghausen O, Beckmann R, Wilson DN. Structural basis for TetM-mediated tetracycline resistance. ProcNatlAcad Sci. 2012 ; 109 (42) :16900?5.

12. Dortet L, Poirel L, Nordmann P. Épidémiologie, détection et identification des entérobactéries productrices de carbapénèmases Feuill De Biol. 2013.

13. Drawz SM, Bonomo RA. Three Decades of -Lactamase Inhibitors. ClinMicrobiol Rev. 2010 ; 23 (1) : 160?201.

14. Ferreira L, Sanchez-Juanes F, Gonzalez-Avila M, Cembrero-Fucinos D, Herrero-Hernandez A, Gonzalez-Buitrago JM, et al., Direct Identification of Urinary Tract Pathogens from Urine Samples by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. J ClinMicrobiol.2010 ; 48 (6) : 2110?5.

15. Ferreira L, Sánchez-Juanes F, Muñoz-Bellido JL, González-Buitrago JM. Rapid method for direct identification of bacteria in urine and blood culture samples by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry: intact cell vs extraction method.ClinMicrobiol Infect.2011 ; 17 (7) : 1007?12.

16. Foxman B. Epidemiology of urinary tract infections : incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 2002 ; 113 (1) : 5?13.

17. Gallah S, Decre D, Genel N, Arlet G. The -Lacta Test for Direct Detection of Extended-Spectrum- -Lactamase-Producing Enterobacteriaceae in Urine. J ClinMicrobiol. 2014 ; 52 (10) : 3792?4.

18. Hailaji NSM, Ould Salem ML, Ghaber SM.La sensibilité aux antibiotiques des bactéries uropathogènes dans la ville de Nouakchott - Mauritanie. Prog En Urol.2016 ; 26 (6) : 346?52.

19. Harris P. Clinical Management of Infections Caused by Enterobacteriaceae that Express Extended-Spectrum â-Lactamase and AmpC Enzymes. SeminRespirCrit Care Med. 2015 ; 36 (01) : 056?73.

20. Hiramatsu K, Ito T, Tsubakishita S, Sasaki T, Takeuchi F, Morimoto Y, et al., Genomic Basis for Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus. Infect Chemother. 2013 ; 45 (2) :117.

21. Hooper DC. Fluoroquinolone resistance among Gram-positive cocci. Lancet Infect Dis. 2002 ; 2 (9) : 530?8.

22. Karanika S, Karantanos T, Arvanitis M, Grigoras C, Mylonakis E. Fecal Colonization With Extended-spectrum Beta-lactamase-Producing Enterobacteriaceae and Risk Factors Among Healthy Individuals: A Systematic Review and Metaanalysis. Clin Infect Dis. 2016 ; 63 (3) : 310?8.

23. Kardaoe-Soma L. Coût de la résistance bactérienne. la santé publique.Séminaire DESC d'Infectiologie. 2017 :36.

24. Kliebe C, Nies BA, Meyer JF, Tolxdorff-Neutzling RM, Wiedemann B. Evolution of plasmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother. 1985 ; 28 (2) : 302-307.

25. Kumar A, Roberts D, Wood KE, Light B, Parrillo JE, Sharma S, et al., Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock : Crit Care Med. 2006 ; 34 (6) : 1589?96.

26. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin Infect Dis. 2002 ; 34 (4) : 482-492.

27. Mainardi J-L, Compain F, Bensekhri H, Lavollay M, Rostane H. â LACTA test for rapid detection of Enterobacteriaceae resistant to third-generation cephalosporins from positive blood cultures using briefly incubated solid medium cultures. Journal of Medical Microbiology. 2015;64(10):1256-9.

28. Melzer M, Petersen I. Mortality following bacteraemic infection caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E. coli compared to non-ESBL producing E. coli. J Infect. 2007 ; 55 (3) : 254?9.

29. Merisier S. Le médecin généraliste et les infections urinaires basses communautaires (cystites simples), chez la femme de 15 à 75 ans : évaluation des pratiques professionnelles en fonction des nouvelles recommandations du SPILF de juin 2014. 2017 ; 85.

30. Mizrahi A, Amzalag J, Couzigou C, Péan De Ponfilly G, Pilmis B, Le Monnier A. Clinical impact of rapid bacterial identification by MALDI-TOF MS combined with the bêta-LACTA^TM test on early antibiotic adaptation by an antimicrobial stewardship team in bloodstream infections. Infectious Diseases. 2018;50(9):668-77.

31. Munita JM, Arias CA. Mechanisms of Antibiotic Resistance. In : Kudva IT, Cornick NA, Plummer PJ, Zhang Q, Nicholson TL, Bannantine JP, et al., Editeurs. Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens, Fifth Edition. Am Society of Microbiol; 2016 ; 481?511

32. Naber KG, Schito G, Botto H, Palou J, Mazzei T. Surveillance Study in Europe and Brazil on Clinical Aspects and Antimicrobial Resistance Epidemiology in Females with Cystitis (ARESC): Implications for Empiric Therapy. EurUrol. 2008;54 (5):1164?78.

33. Netgen. Que signifie «?bêtalactamases à spectre élargi?» en pratique ? Rev Med Suisse. - www.revmed.ch - 2009.

34. Nijssen S, Florijn A, Bonten MJM, Schmitz FJ, Verhoef J, Fluit AC. Beta-lactam susceptibilities and prevalence of ESBL-producing isolates among more than 5000 European Enterobacteriaceae isolates. Int J Antimicrob Agents. 2004 ; 24 (6) : 585?91.

35. Ouedraogo A-S. Prévalence, circulation et caractérisation des bactéries multirésistantes au Burkina Faso. Thèse, Université de MONTPELLIER 2017 :191p.

36. Pagès J-M, James CE, Winterhalter M. The porin and the permeating antibiotic : a selective diffusion barrier in Gram-negative bacteria. Nat Rev Microbiol. 2008 ; 6 (12) : 893?903.

37. Papp-Wallace KM, Bethel CR, Distler AM, Kasuboski C, Taracila M, Bonomo RA. Inhibitor Resistance in the KPC-â-Lactamase, a Preeminent Property of This Class A â-Lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 2010 ; 54 (2) : 890?7.

38.Paterson DL, Bonomo RA. Extended-Spectrum â-Lactamases : a Clinical Update. ClinMicrobiol Rev. 2005 ; 18 (4) : 657?86.

39. Peralta G, Lamelo M, Álvarez-García P, Velasco M, Delgado A, Horcajada JP, et al., Impact of empirical treatment in extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella spp. bacteremia. A multicentric cohort study. BMC Infect Dis. 2012; 12 (1).

40. Poole K. Efflux-mediated antimicrobial resistance. J AntimicrobChemother. 2005 ; 56 (1) : 20?51.

41. Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the Versatile -Lactamases. Clin MicrobiolRev. 2007 ; 20 (3) : 440?58.

42. Ruppé E. Épidémiologie des bêta-lactamases à spectre élargi?: l'avènement des CTX-M. Antibiotiques. 2010 ; 12 (1) : 3?16.

43. Sarkis P, Assaf J, Sarkis J, Zanaty M, Rehban R. Profil de résistance aux antibiotiques dans les infections urinaires communautaires au Liban. Prog En Urol. 2017 ; 27 (13) : 727.

44. Sbiti M, Lahmadi khalid, louzi L. Profil épidémiologique des entérobactéries uropathogènes productrices de bêta-lactamases à spectre élargi. Pan Afr Med J. 2017 ; 28.

45. Schwaber MJ, Carmeli Y. Mortality and delay in effective therapy associated with extended-spectrum -lactamase production in Enterobacteriaceae bacteraemia: a systematic review and meta-analysis. J AntimicrobChemother. 2007 ; 60 (5) : 913?20.

46. Sirot D, Sirot J, Labia R, Morand A, Courvalin P, Darfeuille-Michaud A, et al., Transferable resistance to third-generation cephalosporins in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae?: identification of CTX-1, a novel â-lactamase. J AntimicrobChemother. 1987 ; 20 (3) : 323?34.

47. Strahilevitz J, Jacoby GA, Hooper DC, Robicsek A. Plasmid-Mediated Quinolone Resistance : A multifaceted Threat. ClinMicrobiol Rev. 2009 ; 22 (4) : 664?89.

48. The-War-on-Drug-Resistance_PPC-Fall-2017. Disponible sur : https://genmarkdx.com/wp-content/uploads/2018/06/.

49. Walewski V, Podglajen I, Lefeuvre P, Dutasta F, Neuschwander A, Tilouche L, et al. Early detection with the â-LACTA^TM test of extended-spectrum â-lactamase-producing Enterobacteriaceae in blood cultures. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2015;83(3):216-8.

50. Woerther P-L, Burdet C, Chachaty E, Andremont A. Trends in Human Fecal Carriage of Extended-Spectrum â-Lactamases in the Community : Toward the Globalization of CTX-M. ClinMicrobiol Rev. 2013 ; 26 (4) : 744?58.

51. Yasufuku T, Shigemura K, Shirakawa T, Matsumoto M, Nakano Y, Tanaka K, et al., Correlation of Overexpression of Efflux Pump Genes with Antibiotic Resistance in Escherichia coli Strains Clinically Isolated from Urinary Tract Infection Patients. J Clin Microbiol. 2011 ; 49 (1) :189?94

RESUME

Les entérobactéries sont les principaux germes responsables de bactériémies et d'infections du tractus urinaire. Ces bactéries sont devenues une menace mondiale du fait de leurs multirésistances aux antibiotiques, essentiellement due à l'acquisition de â-lactamases à spectre élargi. Le but de ce travail est d'évaluer d'une part, les performances diagnostiques de l'automate ePlex® dans l'identification des bacilles à Gram négatif et les gènes de résistances associés et d'autres part évaluer les performances du NG-Test-CTXM MULTI et â-LACTA^TMtest dans la détection des BLSE à partir des échantillons d'urines et d'hémocultures.

Sur une période de cinq mois, les automates ePlex® et MALDI-TOF-MS ont été utilisés pour l'identification des bactéries à partir des échantillons d'hémocultures et d'urines positives à bacilles à Gram négatif à l'examen microscopique. La détection des BLSE a été réalisée par l'automate ePlex® et par les NG-Test-CTXM MULTI et â-LACTA^TM Test.

Au total, 53 échantillons d'urines et 52 hémocultures ont été analysés, les entérobactéries représentaient respectivement 93 % (52/56) et 59 % (33/56) des identifications avec Escherichia coli en tête, 66 % (37/56) et 37,5 % (21/56) dans les ITU et les bactériémies. Les entérobactéries productrices de BLSE étaient de 21,2 % (11/52) dans les ITU et 27,3% (9/33) dans les bactériémies.Les concordances d'identification entre ePlex® et MALDI-TOF-MS après isolement étaient d'environ 95 % dans les deux types d'échantillons. Les performances diagnostiques de l'automate ePlex® pour la détection des BLSE sont similaires à celles du â-LACTA^TMtest avec des sensibilités de 81,8 à 100 % et des spécificités de 95 à 100%. Le NG-Test-CTX-M MULTI a montré de meilleurs résultats avec des sensibilités allant de 90,9 à 100 % et des spécificités de 97,6 à 100 %. Le panel Gram négatif de ePlex® est bien adapté au diagnostic rapide des entérobactéries et la mise en évidence des gènes de résistance associés. Toutefois, la simplicité et le moindre coût des tests â-LACTA^TMainsi que des NG-Test-CTX-M MULTI font d'eux des alternatives efficaces dans le diagnostic rapide des entérobactéries productrices de BLSE.

ABSTRACT

Enterobacteria are the main germs responsible for bloodstreams and urinary tract infections. These bacteria became a global threat because of their multidrug resistance, essentially due to the Extended Spectrum Betalactamase (ESBL) acquisition. The purpose of this study is to evaluate on the one hand, the diagnostic performances of the ePlex® PLC from urines and blood cultures samples for Gram negative bacilli (BGN) and associated resistances genes identification and, on the other hand, to evaluate the performance of NG-Test-CTXM MULTI and â-LACTA^TM test in the detection of ESBL from urine and blood cultures samples.

During five months, an identification has been achieved by ePlex® and by MALDI-TOF-MS, from the positive urines and blood cultures with BGN to the microscopic exam. The detection of the ESBL has been achieved by ePlex®, NG-Test-CTXM MULTI and â-LACTA^TM Test.

On 53 samples of urines and 52 blood cultures analyzed, the enterobacteria represented 93 % (52/56) and 59 % (33/56) respectively, with 66 % (37/56) and 37,5 % (21/56) of E. coli in UTI and bacteremia. ESBL-producing enterobacteria were 21.2% (11/52) in the UTI and 27.3% (9/33) in the bacteremia. The corresponding identification between ePlex® and MALDI-TOF-MS were approximately 95 % in both types of samples.

The diagnostics performances of the ePlex® PLC for ESBL production are similar to that of the â-LACTA^TM test with sensitivities of 81.8 to 100% and specificities of 95 to 100%. The NG-Test-CTX-M MULTI showed better results with sensitivities ranging from 90.9 to 100% and specificities from 97.6 to 100%. The Gram-negative panel of ePlex® is adapted to the rapid diagnosis of the enterobacteria and their genes of resistance. However, the simplicity and the lower cost of â-LACTA^TM test as well as NG-Test-CTX-M MULTI are both coalesces for efficient alternatives in the rapid detection of ESBL.