3. Discussion et perspectives
L'objectif de nos travaux était de décrire et
explorer la variabilité génétique de la sensibilité
de l'abricotier à Pseudomonas syringae et d'identifier les
régions du génome impliquées dans la résistance ou
la tolérance de l'espèce au chancre bactérien. Sur la base
des résultats obtenus nous allons structurer la discussion en
synthétisant les informations obtenues sur les rameaux, puis sur les
feuilles avant de les rapprocher et de terminer en proposant des pistes pour la
suite à donner à notre travail.
Résistance au dépérissement
bactérien sur rameaux
Inoculation: Les travaux conduits sur la
population biparentale `BerBa' et sur le panel de ressources
génétiques pendant les années 2013 et 2014, ont
systématiquement opposé une inoculation tissulaire avec de l'eau
(témoin) et une inoculation à l'aide de suspension
bactérienne titrée de Pseudomonas syringae pv. syringae
(souche 41A). La comparaison des couples de rameaux témoin vs
inoculés montre que les lésions tissulaires observées
résultent de la présence des bactéries et de leur mise en
contact avec le système vasculaire. Les variables analysées
s'avèrent dont être pertinentes pour rendre compte de la
réaction des plantes à l'inoculation.
Phénotypage :
Dans le cadre des essais conduits sur la population
bi-parentale « BerBa », et toutes choses étant égales
par ailleurs, des différences significatives de comportement ont
été observées au sein de la population hybride pour les
variables étudiées. Le caractère de résistance
ségrége au sein de la population de manière quantitative
(contrôle génétique polygénique) avec un effet
annuel et des interactions GxAnnée significatifs. Malgré tout les
effets années, fonction des conditions de milieu (froids et
humidité hivernale),
Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
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Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
n'altèrent pas le classement relatif des individus qui
reste inchangé et permet d'identifier les matériels les plus
intéressants. L'année 2013 a ainsi été
caractérisée par des symptômes plus sévères
(lgc, lge notamment) que l'année 2014. A des fins de sélection,
les individus C026, C041 et C029 ont été parmi identifiés
comme les plus résistants au chancre (et au monilia) en cohérence
avec les données obtenues en (2012) par Carlos Gil .
Dans le cadre de la collection, une grande diversité de
comportements a aussi été mise en évidence entre les
accessions étudiées, ainsi que des différences de
comportement selon les années. Les accessions potentiellement les plus
résistantes restent A1314 « Arrogante », A2311 «
Lambertin n°1 » et A2137 « Bakour ». Ces observations vont
dans le même sens que celles obtenus par Prunier et al (1987; 1991) sur
une collection de 81 cultivars suivis pendant deux années sur les
domaines des Bannettes en Avignon et de Mevouillon en Drôme.
Les corrélations entre les différentes variables
montrent des liens intéressant entre les mesures de longueur de chancre
(lgc/lge), de brunissements (bs/bi) mais aussi entre lgc et bs et bi. Ce
résultat nous invite à chercher à exploiter cette
diversité de comportement pour concourir à la sélection de
matériel de moindre sensibilité.
Génotypage :
La mise en relation des données de phénotypage
et de génotypage a permis la détection des régions du
génome (QTLs) impliquées dans les variables
étudiées:
- les analyses de liaison mises en oeuvre sur la descendance
bi-parentale BerBa ont ainsi permis de détecter, malgré une
profondeur de marquage limitée, 3 QTLs liés aux variables bs2013
et lge2013 sur le GL8, ainsi que 4 autres à la limite du seuil de
significativité sur GL1 pour les variables lgc2013, lge2013 et bi2013.
Ces résultats confirmés par l'analyse par marqueur
révèlent une forte liaison des QTLs avec les marqueurs
adjacents.
- Les analyses d'association mises en oeuvre sur 76 accessions
re-séquencées représentatives de la collection sont
caractérisées par le fait que malgré la forte
densité de marqueurs (16478SNPs), il n'y a pas d'influence de la
structure du panel variétal sur la qualité du modèle de
prédiction. Cette information suggère que les composantes de
résistance observées sont « indépendantes » de
l'origine phylogéographique des individus. Un total de 209 associations
liées aux
65
différentes variables observées a
été obtenu avec des parts de variabilité
phénotypique expliquées pouvant atteindre 53%.
- Cependant, aucune liaison stable n'a pu être
détectée pour une variable donnée pendant les deux
années. Ce manque de stabilité pourrait être
expliqué d'une part par les fortes interactions GxE et notamment les
situations climatiques très contrastées des 2 années
d'étude, et d'autre part par la taille des populations
génotypées (87 individus dans le cas de la population
bi-parentale et 76 accessions dans le cas de la core-collection) qui n'explore
certainement pas toutes les possibilités de recombinaison.
Mécanismes : Bien qu'il existe une
corrélation non négligeable entre les différentes
variables, leurs liens nécessitent d'être éclairés
dans la mesure où ils pourraient nous renseigner sur la nature des
mécanismes de résistance impliqués. Les relations entre la
mesure classique de la « résistance» avec la longueur de la
lésion induite après inoculation et les phénomènes
de brunissement observés méritent une attention
particulière. Le brunissement interne n'est pas significatif dans la
core-collection au cours des deux années d'étude, les
interactions GxE ne sont pas significatives pour les deux types de population
or l'effet génétique est très hautement significatif au
sein de la population biparentale BerBa. Il s'agit donc d'un effet
génétique spécifique dont l'impact pourrait nous
intéresser et justifier des travaux complémentaires.
En outre, et au-delà des limites liées à
l'aspect très préliminaire de la carte génétique et
donc de l'approche QTL sur la population BerBa. Les associations mises en
évidence en GWAS traduisent des liens indirects entre lésions et
brunissements:
- 2013 a été caractérisé par des
lésions importantes et des brunissements réduits avec 50
associations en lien avec le brunissement,
- 2014 a été caractérisé par des
lésions limitées et des brunissements importants avec des
associations plus nombreuses en lien avec le brunissement allant jusqu'à
99 associations qui traduisent d'une part une forte corrélation entre le
nombre de candidats détecté et l'intensité du trait et
d'autre part une interaction entre ces deux caractères.
Ces brunissements pourraient être la résultante
de deux hypothèses. Une première hypothèse liée
à l'excrétion par le pathogène d'enzymes de nature
protéique
Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
66
(Chevaugeon J, 1957). Des études ont montré
suite à une inoculation de tomates par Fusarium vasinfectum et
Gibberella Fujikuroi que la présence d'une toxine
appelée `vasinfuscarine' dans le filtrat produit une couleur brune des
vaisseaux de la tige et des nervures des feuilles (Stoll and Kern, 1953). Une
seconde hypothèse pourrait être basée sur une
réaction de la plante. Dans ce cas, les phénomènes de
brunissement (bs et bi) résulteraient d'interactions entre l'oxydation
des tissus et la synthèse de toxines par la bactérie. A titre
d'exemple les phytoalexines (enzymes de détoxication) sont connues pour
être impliquées dans ces mécanismes de résistance et
produites de la voie de biosynthèse des flavonoïdes et
isoflavonoïdes. Ces molécules sont donc des composantes
potentielles de la résistance quantitative. La présence d'un
effet génétique au sein de la BerBa pourrait être
liée à la synthèse de ses molécules. En effet des
études biochimiques, dans le pathosysthème
Arabidopsis-Botrytis, ont montré que le niveau de camalexine
(phytoalexine) était corrélé à la présence
de QTL (Denby et al., 2004) suggérant l'implication des gènes de
la voie des phytoalexines dans la résistance quantitative, par contre
des mutants d'Arabidopsis thaliana, incapables de produire des
phytoalexines sont sensibles à un champigon Alternaria brassicicola
mais capables de développer une résistance vis-à-vis
de plusieurs pathogènes notamment la bactérie Pseudomonas
syringae (Glazbrook, 1999). Des investigations autour de cette
hypothèse telle que l'analyse des flavonoïdes pourraient consolider
et éclaircir nos résultats.
Conséquences en termes de
sélection:
Les résultats obtenus sur le comportement des individus
à l'inoculation par Pseudomonas syringae, traduisent
l'extrême fragilité des variétés actuellement
cultivée et notamment la sensibilité du fond
génétique européen continental auquel est rattaché
la variété Bergeron. Il serait primordial de valoriser le
potentiel de résistance mis en évidence chez les
variétés A2137, et A1314, et chez les hybrides BerBa C026 et C041
au cours des trois années d'évaluation (i) en continuant leur
évaluation pour évaluer la robustesse du phénotypage et
(ii) en caractérisant en même temps leur sensibilité
à d'autres maladies comme le monilia et enroulement chlorique dans une
logique de culture sous faible niveaux d'intrants afin d'identifier les sources
de résistance les plus résilientes.
Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
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Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
Résistance aux criblures bactériennes sur
feuilles
Inoculation : Pour les feuilles comme pour
les rameaux, les résultats obtenus suite à l'inoculation
tissulaire des feuilles de la population GoMo et de la core-collection sont
caractérisés par une réaction due à la
présence de la bactérie par comparaison avec le témoin
eau. Un effet hautement significatif de l'inoculation a été
systématiquement mis en évidence pour les variables
mesurées. Comme précédemment nous pouvons donc
considérer que les différences entre génotypes
étudiés résultent de l'inoculation.
Phénotypage :
Dans le cadre de la population bi-parentale GoMo, les parents
Goldrich et Moniqui ont été inoculés comme les hybrides de
la descendance. Or les deux variétés ont présenté
des comportements similaires après inoculation, ce qui ne correspondait
pas au comportement attendu. En effet, nous avions observé en verger une
sensibilité de Goldrich à la criblure sur les feuilles
situées à la base des rameaux (tronçon
préformé, préférentiellement) alors que nous
n'avions rien observé sur les feuilles de la variété
Moniqui cultivée dans les mêmes conditions. Cette
sensibilité à la criblure avait été reliée,
lors d'analyses préliminaires, à la présence de
bactéries à Pseudomonas. Effectivement, ces
bactéries épiphytes déjà présentes dans les
bourgeons, pourraient coloniser les nouvelles feuilles pendant leur
émergence au printemps (Crosse, 1966). Pour simuler cette contamination
nous avons mis en place un test par blessure qui s'est avéré trop
sévère et traduire une résistance des tissus du limbe
à une attaque bactérienne. Nous pouvons donc considérer
que la sensibilité tissulaire n'explique pas le syndrome de criblure,
mais nous pouvons imaginer que les différences de comportement entre les
variétés Goldrich et Moniqui pourraient être liées
à la nature des portes d'entrées mobilisées par les
bactéries et notamment les bourgeons.
Toutefois, les observations réalisées sur la
descendance GoMo ont mis en évidence une ségrégation dans
la réaction de la population hybride. Des effets «
génétique » », effets « année» et des
interactions « génotype x année» ont été
enregistrés pour les deux caractères «
sévérité et criblure » étudiés.
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Génotypage : Dans le cadre de la
population GoMo et malgré l'absence de différence entre les
parents, des QTLs ont été détectés par analyse de
liaison dont un stable en 2013 et 2014 et localisé sur le chromosome
8.
Dans le panel de RG, les analyses d'association ont permis la
mise en évidence deux zones communes entre la
sévérité et la criblure au niveau du GL1 et GL8.
Mécanismes: Même si nous n'avons
pas pu mimer la sensibilité à la criblure de Goldrich, par
analogie avec ce qui a été observé dans le cas de la
résistance de la tomate à Pseudomoans syringae pv.
Tomato. Nous devons constater qu'existe des mécanismes latents
héritables et à l'état hétérozygote chez les
variétés d'abricotier qui vont permettre à la plante de
réagir à une inoculation bactérienne au niveau des limbes.
Au regard du nombre de SNP candidats et de leur localisation, il serait
intéressant de mettre en relation les réactions de la plante avec
les mécanismes de régulation des métabolismes secondaires.
On peut en effet supposer que ces QTLs liés à l'inoculation sont
basés sur des gènes contrôlant l'activité des
polyphénol oxydases et l'accumulation des phénols au niveau des
feuilles. En effet, les phénols extraits de plantes résistantes
inoculées sont connus pour inhiber la croissance du pathogène
(Bashan et al., 1987). D'autre part, l'ouverture des stomates et leur
densité, ou le degré d'hydrophobicité de la cuticule sont
aussi connus pour avoir des effets importants sur la résistance à
la maladie tout comme la surface et l'inclinaison foliaire (Melotto et al.,
2006). Sur tomate deux QTLs dont l'un se situe à côté d'un
cluster d'un gène de résistance et l'autre capable de diminuer la
progression des symptômes en raison d'une augmentation du taux de
maturation vasculaire (Coaker GL et al., 2002), ont été
détectés et sont fortement liés à la
résistance au chancre bactérien causé par Clavibacter
michiganensis.
Quelles relations entre les variables
étudiées et quelles conséquences sur l'appréciation
de la sensibilité?
L'ensemble des caractères étudiés (lgc,
lge, bs, bi, sévérité, criblure) dans les deux types de
population (biparentale ou collection) montre une variation continue et un
déterminisme de type polygénique. L'effet marqué du
génotype sur les populations biparentales nous indique que les
caractères observés ségrégent de manière
quantitative au sein des populations choisies. On a aussi pu mettre en
évidence une variabilité
Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
69
génétique large au sein de la core-collection
pour la plupart des variables étudiées, ce qui constitue un
substrat de travail intéressant.
La comparaison entre les observations de résistance
tissulaire sur les deux types d'organes nous conduit à considérer
qu'il s'agit de deux caractères distincts, tous deux quantitatifs et non
liés à la structure phylogénétique du panel
étudié. En effet, les analyses en composantes principales sur
l'ensemble des variables mesurées (Annexe IX) montrent que les variables
ne sont pas liés et les approches génétiques impliquent
des régions du génome différentes. Les résultats
des études d'association vont dans le même sens que ceux obtenus
sur les populations biparentales :
- les chromosomes 2, 4, et 8 possèdent la
particularité d'avoir un nombre important de candidat liés
à la longueur du chancre et au brunissement, et ils sont aussi
caractérisés par de fortes interactions entre les variables
- le chromosome 1 contient le maximum de candidats liés
à la résistance sur feuilles.
Sur feuilles comme sur rameaux, le modèle de
résistance semble être une superposition d'effets faibles
liés à des composantes de résistance à effet
partiel (QTLs) (Poland et al., 2009). Enfin ces résultats ne signifient
pas qu'une sélection basée sur lgc va favoriser une
sélection des autres variables.
Analyse critique des dispositifs expérimentaux et
pistes d'amélioration:
Aspects génétiques : Toutes les
associations identifiées durant ce travail représentent autant de
cibles d'intérêt pour mieux comprendre les déterminants
génétiques. Cependant, il est important de noter que dans ces
études d'associations, les « core-collections » restent des
échantillons de taille restreinte et qu'il est nécessaire de
valider les résultats obtenus, en testant un plus grand nombre
d'accessions. En effet, d'après Korte et Farlow (2013) sur
Arabidopsis, il est nécessaire pour avoir une puissance de
détection correcte pour une association avec une variance
phénotypique de 5% d'étudier 800 individus.
Au niveau des populations biparentales, et malgré la
robustesse des marqueurs SSR, leur nombre est trop limité dans le cas de
la population BerBa pour que des conclusions
Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
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Mlle HADJ BRAHIM Mouna RESULTATS ET DISCUSSION
pertinentes soient dressées. Par contre d'ores et
déjà des pistes apparaissent et la densification du marquage en
cours devrait renforcer la qualité des résultats. Une
densification par des marqueurs SNPs, en cours d'élaboration, devrait
accentuer la puissance de l'analyse et de faire le pont entre les
résultats de la GWAS et le biparental.
De point de vue du phénotypage, une
nouvelle méthode de lecture des symptômes sur feuilles, par des
approches à haut débit pourrait aussi être envisagée
afin de quantifier la sévérité. L'imagerie par
fluorescence de la chlorophylle (Rousseau et al., 2013) a permis grâce au
calcul du rendement quantique maximum de photosystème II de
caractériser des plants de haricot cv. Flavet suite à une
inoculation bactérienne. Cette technique mériterait d'être
testée afin de minimiser l'effet d'observateur et d'accroitre
potentiellement la vitesse de lecture.
S'agissant des mécanismes de
résistance aux Pseudomonas syringae, nos dispositifs
expérimentaux aussi bien sur rameaux que sur feuilles ont
altéré les barrières physiques de la plante laissant la
bactérie en contact direct avec le système vasculaire. Cette
approche rend assez bien compte des comportements en verger dans le cas des
inoculations sur rameaux. Par contre, elle ne renseigne pas sur les portes
d'entrées des bactéries qui restent un enjeu majeur. Une
étude complémentaire par inoculation des bourgeons à un
stade précoce permettrait peut être de mimer la sensibilité
typique de Goldrich et pouvoir traiter la question des portes d'entrées
propres au syndrome de criblure sur cette variété.
Maîtrise des dispositifs expérimentaux
dans le temps: Enfin, une contrainte non contrôlée, a
engendré la perte d'une partie de l'information génétique
au sein des populations biparentales du fait des facteurs environnementaux. En
effet, sur un total de 300 individus de BerBa plantés en 2004, 224
individus seulement ont été analysés suite à la
perte de matériel due au dépérissement bactérien et
à l'enroulement chlorotique.
Variabilité de l'agent pathogène
: Les résistances partielles, ou quantitatives sont
censées être plus robustes et sommes-toutes plus difficiles
à contourner que des résistances monogéniques
vis-à-vis des différents isolats du pathogène. Toutefois
des interactions de type spécifique ont pu être
démontrées dans le cas d'autres agents
pathogènes(Parlevliet, 1988). Or, de manière préliminaire,
dans notre étude nous avons travaillé avec une seule souche
(41A), agressive et très virulente, en faisant varier le
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génotype de l'abricotier. Même si la
démarche a été réfléchie en utilisant une
souche naturelle très agressive. Il est d'importance majeure
d'intégrer la variabilité de l'agent pathogène dans la
logique de recherche de résistance stables et durables. L'existence
d'une telle interaction pourrait signifier que le pathogène est
susceptible d'éroder la résistance partielle, ce qui remettrait
en cause sa durabilité. Dans ce contexte, une étude sur une
échelle plus faible de plusieurs combinaisons (souches x
variétés) notamment les souches portant les « woody
genes» qui permettent à la bactérie de
pénétrer le système vasculaire de l'hôte (Lamichhane
et al., 2014) serait utile pour évaluer le potentiel d'adaptation
à la résistance de Pseudomonas syringae. Cette
hypothèse est soutenue par l'existence d'interactions isolat/cultivar et
l'existence de QTL race-spécifique (Marcel TC et al., 2008).
Mlle HADJ BRAHIM Mouna CONCLUSION
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