Memoire Online - Effet scavenger des radicaux oxygénés et inhibiteur de la xanthine oxydoreductase des extraits de Cachrys libanotis. L

République Algérienne Democratique et Populaire
Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique
Université Ferhat ABBAS-Setif

Encadreur : M. BAGHIANI Abderrahmane Prof.UFAS Setif Examinateur: M^me.BOUMERFEG Sabah MCB CUBBA

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RESUME : L'objectif principal de cette étude est l'évaluation de l'effet inhibiteur des extraits des racines de la plante cachrys libanotis, utilisée en médecine traditionnelle en Algérie, sur la xanthine oxydase (XO) et de ses propriétés inhibitrices. La XO a été purifiée du lait bovin avec un rendement de17.97 mg/l, un rapport protéine/flavine de 7.18, et avec une bande majeure d'environ 150 KDa, en SDS-PAGE, indiquant une pureté acceptable de l'enzyme. L'activité spécifique de l'enzyme purifiée a été de 2261 nmol/min/mg protéine. L'EAc inhibe la XO (IC50 = 0.11#177; 0.006mg/ml) et la réduction du cytochrome c (IC50 = 0.415 #177; 0.015mg/ml), suivi par l'ECh avec des IC50 de la XO et de la réduction du cyt c de (0.138 #177; 0.002 et 0.222 #177; 0.001mg /ml) respectivement. Enfin, l'EBr a un faible effet sur la XO (IC50 = 1.048#177; 0.001 mg / ml), possède l'effet inhibiteur de la réduction du cyt c le plus faible avec une IC50 de (2.68 #177; 0.084). Les résultats obtenus suggèrent que ces produits naturels peuvent être utilisés pour traiter les maladies qui nécessitent l'inhibition de la XO et le piégeage des radicaux libre

SUMMARY: This study was conducted to search for xanthine oxidase (XO) inhibitors from Cachrys libanotis L.root extracts traditionally used in folk medicine in Algeria. XO was purified from fresh bovine milk with yields of 17.97 mg / L, protein / flavine ratio of 7.18 and a major band, on SDSPAGE, of approximately 150 KDa, indicating an acceptable purity of the enzyme. The total specific activity of the purified enzyme was of 2261 nmol / min / mg protein. The EAc showed the highest inhibitory properties on the XO activity (IC50 = 0.11 #177; 0.006 mg / ml), followed by ECh with IC50 of XO inhibitory activity 0.138 #177; 0.002 mg / ml and EBr with an IC50 1.048 #177; 0.001 mg / ml. Whereas, the inhibition of cyt c reduction the highest activity was that of ECh with IC50 ( 0.222 #177; 0.001 mg / ml), followed by EAc and EBr extracts with an IC50 of (0.415 #177; 0.015 mg a /ml and 2.68 #177; 0.084 mg / ml), respectively. These results suggest that these natural products could be used to treat lot of diseases, where inhibition of XO and free radical scavenging activity are necessary.

REMERCIEMENTS

DEDICACE

Sommaire

LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION	1
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. La xanthine oxydoréductase	2
1.1. Structure	..3
1.2. Propriétés enzymatique	3
1.3.Interconvertion xanthine déshydrogénase /oxydase	5
1.4.Distribution et localisation de la XOR	5
1.5.Rôles physiologiques et physiopathologique de la XOR	5
1.5.1. Rôles physiologiques	6
1.5.2. Rôles physiopathologiques de la XOR	6
1.5.3. Rôle de la XOR dans l'inflammation et l'ischémie / réperfusion	.6
2. Le stress oxydatif	8
2.1. Les especes oxygénés réactives (ROS) .	8
2.2. Nature et sources cellulaires des (ROS)	..8

3. Stress oxydant et ses conséquences biologiques	.11
4. Les principales cibles des (ROS)	12
4.1 Les lipides	.12
4.2 Les proteines	.12
4.3 Les acides nucleiques (ADN)	13
5.Les maladies liées au stress oxydant	.13
6.Systhemes de défences antioxydants	.13
6.1 Systhèmes enzymatique	14
6.2. Systhème non enzymatiques	. .15
7. Les polyphénols		..15
7.1. Les acides phénoliques		..16
7.2. Les tannins		.16
7.3. Les flavonoïdes		..16
7.3.1. Structure et classification des flavonoïdes		16
7.3.2. Localisation et distribution des flavonoïdes		17
7.3.3. Effets biologiques et pharmacologiques des flavonoïdes		.18
7.3.4. Activité antioxydante des flavonoides		..18
8. Piégeage direct de radicaux libres		18
8.2. Inhibition enzymatique		19
*9. La plante médicinale Cachrys libanotis* L.**		..19
9.1. Description de la plante		....19
9.2. Répartition		19
9.3. Classification classique			20
9.4. Description			20
5.4. Utilisation traditionnelle de la plante			20
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel biologique			..21
1.1. Réactifs chimiques			..21
2. Méthodes			.21
2.1. Purification de la xanthine oxydase			21
2.2. Contrôle de pureté de la XO			22
2.3. Estimation de l'activité enzymatique de la XO			23
2.4. Extraction des flavonoïdes d'Cachrys libanotis			23
2.5. Fractionnement de l'extrait brut			24
2.6. Dosage des composés phénoliques			25
2.7.Dosage des flavonoides			26
2.8. Dosage des tannins			26
2.7. Inhibition de l'activité de la xanthine oxydase par les extraits d'Cachrys libanotis.27
2.8.Effet scavenger des extraits d'Cachrys libanotis sur le superoxyde produit par la OX			28

4. Effet scavenger des extraits d'Cachrys libanotis sur l'O2^°- produit par la XO 35

LISTE DES ABREVIATIONS

INTRODUCTION

Depuis l'antiquité, le monde a connu l'utilisation des plantes dans le traitement des maladies humaines, il s'agit de la médicine traditionnelle. Actuellement, la pharmacie utilise toujours une forte proportion de médicaments d'origine végétale. Entre autres, la recherche trouve chez les plantes des molécules actives, Ces molécules peuvent être des enzymes, des protéines ou d'autres molécules de faible poids moléculaire tels que les vitamines (Halliwell, 1996), les caroténoïdes (Edge et al., 1997), les flavonoïdes, les anthocyanines ainsi que d'autres composés phénoliques (Sanchez-Moreno et al., 1998).

La xanthine oxydoréductase (XOR) est une enzyme responsable de la production de l'anion superoxyde (O2^°-) et de peroxyde d'hydrogène (H2O2), ces deux espèces oxygénées peuvent être des précurseurs des autres espèces réactives soit de l'oxygène (ROS) soit de nitrogène (RNS) qui sont impliquées dans les grands dommages cellulaires et tissulaires dont leur surproduction provoque des lésions directes de molécules biologiques tels que l'ADN, les protéines, les lipides et les glucides. L'implication de ces espèces réactives dans le vieillissement et dans les maladies chroniques telles que l'athérosclérose, le diabète, le cancer et certaines maladies inflammatoires ou neurodégénératives est maintenant reconnue.

Les flavonoïdes représentent une classe de métabolites secondaires (Markak, 2003), où ils agissent: sur le scavenger des ROS, l'inhibition des enzymes et la chélation des traces métalliques responsables de la production de ROS et enfin sur la protection des systèmes de défense antioxydants (Halliwell, 1994).

Dans la présente étude on a essayé d'étudier l'activité inhibitrice de différents extraits de Cachrys libanotisL. Cette plante est utilisée en Algérie comme un anti inflammatoir pour le rhumatisme, où elle présente des propriétés antirhumatismales,

L'objectif de ce présent travail consiste à extraire les différents composés actifs (polyphénoles et flavonoïdes) de Cachrys libanotis L, leurs dosages et l'étude de leurs effets inhibiteurs. Pour montrer l'activité inhibitrice de notre plante, on a choisi de tester sa capacité d'inhiber la XO comme une source génératrice des radicaux libres, son effet scavenger sur l'O2^°-qui est peu réactif par lui-même, mais représentant un précurseur d'espèces plus agressives.

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1. La xanthine oxydoréductase

La xanthine oxydoréductase (XOR) est un complexe métalloflavo-protéine, qui a été découverte la première fois au niveau du lait bovin par Schardinger (1902). Chez les mammifère XOR existe sous deux formes interconvertibles: la xanthine déshydrogénase (XDH; EC 1.1.1.204 ) est la forme la plus dominant in vivo et la xanthine oxydase (XO; EC 1.1.3.22) Bien que la XOR peut réagir avec plusieurs substrats dont les purines, les pyrimidines et les ptérines (Krenitsky et al., 1974), la propriété catalytique principale la plus connue est le catabolisme des purines où elle convertit l'hypoxanthine en xanthine et la xanthine en acide urique qui est le produit finale du catabolisme des purines chez l'homme (Parks and Granger, 1986) (figure 1)

1.1. Structure

La XOR est une enzyme homodimère constituée de deux sous unités identiques de 150kDa de chacune, chaque sous unités est partagé en 3 domaines :

- le domaine C terminale de 85kDa (590-1332 acides aminés) est le molybdo-protéique (Mo) - le domaine central de 40kDa (226-531 acides aminés), est une molécule de flavine adénine di nucléotides (FAD)

- le domaine N terminale de 20kDa (1-165 acides aminés) se constitue de deux sousdomaines, avec deux centres (Fe2/S2) combinés jusqu'à quatre résidu de cystéine (figure 2) (Bray, 1975)

Figur2 : Structure secondaire et tertiaire de la XOR. A, structure secondaire de la XOR, les flèches indiquent les sites de clivage par la trypsine (Lys186, Lys552) (Amaya et al., 1990), les étoiles indiquent les résidus de cystéine modifiés dans la conversion réversible de XOR (Cys535, Cys992) (Nishino and Nishino, 1997). B, domaines de sous-unité de la XOR, leurs tailles et leurs cofacteurs associés (Enroth et al., 2000). C, structure cristallisée de l'homodimère de la XOR bovine (Enroth et al., 2000).

1.2 Les propriété enzymatique

Le mécanisme réactionnel de la XOR est constitué de deux demi-réactions indépendantes; réductive et oxydative (Berry and Hare, 2004). La demi-réaction réductive a eu lieu au site Mo où se produit une hydroxylation oxydative du substrat (RH) avec réduction simultanée de l'enzyme (Xia et al. 1999). Le NADH est le seul substrat réducteur qui réagit avec le centre FAD et non avec le centre Mo (Berry and Hare, 2004). Les inhibiteurs de la XOR sont généralement des analogues du substrat, tels que l'allopurinol, oxypurinol et certaines purines et pyrimidines, inactivent l'enzyme en agissant sur le site Mo (Berry and Hare, 2004; Pacher et al., 2006).

Contrairement à la réaction demi-réductive, la réaction demi-oxydative prenne lieu au site FAD qui transfert des électrons aux accepteurs physiologiques (O2 et NAD⁺) (Hille and Nishino, 1995). La réoxydation de l'enzyme réduite permet d'oxyder l'oxygène en O
·- 2 et en H2O2 (Hille and Massey, 1981).

Les trois centres redox peuvent aussi transférer les électrons entre eux (Figure 3) (Massey and Edmonson, 1970). Cependant, les accepteurs artificiels d'électrons (Ferricyanure ou bleu de methylène) reçoivent leurs électrons des centres Fe/S.

La XOR a deux formes inactives, démolybdo et désulfo-XOR, ces formes représentent environ 60 % de l'enzyme du lait bovin et plus de 97 % du lait humain (Baghiani et al., 2002; 2003). Ces deux formes ne peuvent pas oxyder les composés qui réagissent au niveau du centre Mo, mais elles peuvent réagir avec le NADH au niveau du centre FAD (Bray, 1975). Dans la forme désulfo, l'atome de soufre au niveau du site Mo est remplacé par un atome d'oxygène. Cette enzyme désulfo peut récupérer son activité après une résulfuration en l'incubant avec des composés sulfurés comme le (Na2S) (Baghiani et al., 2003).

1.3. Interconversion xanthine déshydrogénase/oxydase

La XOR existe sous deux formes: forme déshydrogénase (XDH : forme D, EC.1.1.1.204) et forme oxydase (XO : forme O, EC.1.1.3.22) (Della Corte et al., 1969; Waud and Rajagopalan, 1976). La XOR existe dans la plupart des tissus des mammifères sous forme déshydrogénase (Berry and Hare, 2004). Les deux formes de l'enzyme catalysent des réactions impliquant des substrats analogues, mais chacune préfère des accepteurs d'électrons différents. Les deux formes réduisent l'oxygène moléculaire mais la forme D peut réduire aussi le NAD qui est son préférable accepteur d'électrons (Martin et al., 2004). La réduction de l'oxygène conduit à la formation de l'O^·-₂ et de _H2O2. La conversion de la forme D à la forme O de l'enzyme se fait par deux mécanismes enzymatiques. Le traitement de la XOR par des protéases tels que la trypsine, la chymotrypsine, ou la pancréatine conduit à la formation d'une forme O irréversible (Della Corte et al., 1969; Stirpe and Della Corte, 1969). La conversion réversible se produit par l'oxydation des groupements sulfhydriles (SH) (Nishino and Nishino, 1997).

1.4-Distribution et localisation de la XOR

La XOR est largement distribuée dans l'organisme vivant, les bactéries, les levures, les insectes, certain nombre d'espèces des plantes, ainsi que chez les mammifères au niveau de la glande mammaire, très abadant dans le lait (Harrison ; 2002 Nakagawa et al .2007) et localisé à forte concentration dans le cytoplasme et la membrane cellulaire et surtout dans les cellules hépatiques ou elle possède une activité très élevée, les cellules endothéliales des capillaires sanguines (Harrison, 2002)

1.5. Rôles physiologiques et physiopathologiques de la XOR

1.5.1-Rôles physiologiques

LA (XOR) est une enzyme qui a une propriété catalytique très importante est le catabolisme des purines en urate. In vitro, la XOR a des propriétés antimicrobiennes par sa capacité d'inhiber la croissance bactérienne (Hancock et al. 2002). In vivo, dans le lait maternel, la XOR joue le même rôle (Stevens et al., 2000). Une activité antioxydante est attribuée à l'enzyme par le biais de la production de l'urate. La XOR est suggérée d'avoir un rôle dans d'autres processus physiologiques tel que les mécanismes de transduction du signal (Meneshian and Bulkley, 2002).

1.5.2. Rôles physiopathologiques

La XOR est également une source importante des radicaux libres (superoxyde), elle produit l'O2
·- et de _H2O2, ces deux espèces oxygénées peuvent être par la suite des précurseurs des autres espèces réactives quelque soit de l'oxygène (ROS) ou de nitrogène (RNS) qui sont impliquées dans les grands dommages cellulaires et tissulaires. Ces espèces réactives peuvent induire un changement structural des molécules biologiques; les lipides, les protéines et l'ADN, ces modifications vont impliquer dans la physiopathologie de plusieurs maladies. La XOR joue un rôle important dans différentes formes de pathologies humaines telles que les maladies inflammatoires, les lésions post-ischémiques, les dommages tissulaires et vasculaires et les maladies cardiaques chroniques (Pacher et al., 2006).

1.5.3. Rôle de la XOR dans l'inflammation et l'ischémie / réperfusion

La XOR produit les ROS qui provoquent les lésions ischémiques dues au catabolisme de l'ATP pendant l'hypoxie, ce qui entraine une augmentation de concentration de l'hypoxanthine (Figure4). Lorsque la concentration intracellulaire de L'ATP est diminuée, il se produit un déséquilibre dans le gradient ionique de part et d'autre de la membrane plasmique permettant ainsi la pénétration de Ca²⁺ à l'intérieur de la cellule. L'augmentation de la concentration cytoplasmique en Ca²⁺ provoque l'activation des protéases Ca²⁺- dépendantes (Granger et al., 1981; Mc Cord, 1985) qui catalysent la conversion irréversible de la XDH, prédominante in vivo, en XO (Figure 4) (Della Corte and Stirpe, 1968; Granger et al., 1981; Kooij et al., 1992).Dans la réperfusion, la XO oxyde l'hypoxanthine accumulé en xanthine, laquelle redevient acide urique, et réduit l'O2 en O2^°- et _H2O2 (Figure 4) (Hille and

Massey, 1981). L'interaction entre ces deux espèces par la réaction de Haber-Weiss produit le radical hydroxyle, provoquant ainsi des lésions tissulaires (Huang et al., 2001).

Durant l'inflammation, la XOR est activée par plusieurs types d'interférons, tels que TNF á et C5a, qui incite la conversion de la XDH en XO (Friedl et al., 1989). Cependant, la production de ROS s'élève et provoque l'activation de NF-KB régulateur de la production des cytokines (TNF-, IL-1, IL-2 et IL-6) (Schreck and Baeuerle, 1991; Burdon and Gill, 1993).

la XOR permet la production des espèces réactives oxygènes qui peuvent réagir avec les composés de la membrane cellulaire, tel l'acide arachidonique, pour produire des lipides chimio-attractants des neutrophiles amplifiant ainsi la réponse inflammatoire (Perez et al., 1990).

La XOR, impliquée dans le déroulement de la réaction physiologique de l'inflammation, contribue également dans son amplification par sa capacité de production des ROS. Par exemple ; dans l'arthrite rhumatoïde, la XOR amplifie l'inflammation synoviale conduisant à l'érosion de l'os et la propagation de la maladie (Blake et al ., 1997)

Figure 4 : Mécanisme de génération des ROS par la XOR dans les tissus lors du processus
d'ischémie / réperfusion (Granger et al., 1981).

2. Stresse oxydatif

Le stress oxydatif est un déséquilibre dans la balance métabolique cellulaire durant laquelle, la génération d'oxydants accable le système de défenses antioxydants, que ce soit par une augmentation de la production d'oxydants et/ou par une diminution des défenses antioxydants (Sorg, 2004).

2.1. Les espèces oxygénées réactives (ROS)

Les espèces oxygénées réactives (ROS) regroupent les radicaux libres de l'oxygène (radical superoxyde, radical hydroxyle, monoxyde d'azote, etc...) ainsi que certains dérivés réactifs non radicalaires dont la toxicité est plus importante tels que le peroxyde d'hydrogène et le peroxynitrite (Bartosz, 2003).

2.2. Nature et sources cellulaires des ROS

Divers types cellulaires et tissus donnent naissance aux ROS par des réactions enzymatiques ou par auto-oxydation au cours de leur métabolisme normale et parfois en réponse à un stimuli spécifique. Dans ce contexte, plusieurs exemples peuvent être cités. (Figure 5).

2.2.1. Le radical anion superoxyde

Par sa configuration électronique l'oxygène moléculaire est un radical qui possède deux électrons non appariés; les spins de ses deux électrons son parallèles lui attribuant une stabilité relativement grande.

Dans l'organisme, une partie de cet oxygène moléculaire peut capter Un électron conduisant à la formation du radical superoxyde (O2 ?-); (Koechilin-Ramonatxo, 2006).

La poussée respiratoire (respiratory burst) des polynucléaires neutrophiles constitue une source cellulaire importante de l'anion superoxyde qui est produit au niveau de la NADPHoxydase, Cette enzyme normalement dormante est activée lorsque la cellule phagocytaire est stimulée pour produire l'O2 ?-. Cette production est à l'origine de la synthèse des molécules comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou l'hypochlorite (ClO^?-) indispensables à la digestion du matériel phagocyté (Babior et al,.2002).

Le système enzymatique xanthine/xanthine oxydase intervient aussi dans la production du

superoxyde au cours de l'oxydation de la xanthine en acide urique selon la réaction suivante

2.2.2. Le peroxyde d'hydrogene

Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) se forme par la dismutation spontanée ou enzymatique du radical superoxyde (Pal Yu, 1994), La dismutation enzymatique est catalysée principalement par le superoxyde dismutase (SOD)

En plus de la SOD, il existe d'autres enzymes produisant _H2O2, comme les oxydases (la glycoxylate oxydase, la D-aminoacide oxydase) présentes particulièrement dans les peroxysomes (kohen et nyska et al., 2002). Cependant, ces oxydases peuvent catalyser directement la réduction divalente d'oxygène moléculaire produisant ainsi le peroxyde d'hydrogène sans former le radical superoxyde (Del Rio et al., 1996).(Figure 5)

2.2.3. Le radical hydroxyle

Le radical hydroxyle (OH^?) est formé principalement par la dégradation du _H2O2 en présence de métaux de transition sous leur forme réduite, ainsi _H2O2 associé à du fer ferreux conduit à la réaction de Fenton.

H2O2 peut également réagir avec le radical superoxyde, aboutissant là encore à la production du OH^?, ce mécanisme réactionnel est appelé réaction d'Haber et Weiss (Sorg, 2004).

D'autres voies de formation de l'OH^? sont : la décomposition de l'acide peroxonitrique et la réaction de l'acide hypochloreux avec O2 ?- (Bartosz, 2003). Le radical hydroxyle est le plus réactif de toutes les espèces dérivées de l'oxygène, il réagit avec de nombreuses espèces moléculaires se trouvant dans son voisinage (protéine, lipide, ADN). (Figure 5).

2.2.4. L'oxygène singulier

Pour l'oxygène moléculaire l'état triplet (biradical) est plus stable que l'état singulier Il peut être produit par plusieurs réactions biochimiques d'oxydation incluant la peroxydase et la lipooxygénase, par la réaction entre divers ROS ou en présence de la lumière, de l'oxygène et de photo sensibilisateur comme la porphyrine, tel est le cas de la porphyrie erythropoétique- congénitale (Sorg, 2004). (Figure 5)

2.3. Les espèces nitrogènes réactives

2.3.1. Le monoxyde d'azote

Le monoxyde d'azote (NO^?) est produit par l'oxydation de l'un des atomes N terminaux de la L-arginine, cette réaction est catalysée par le nitrique oxyde synthase (NOS) (Sorg, 2004) selon la réaction suivante

Le NO devient délétère pour les cellules notamment en réagissant avec le O2 ?- pour former un puissant oxydant le peroxynitrite (ONOO
·) qui peut secondairement se décomposer en d'autres oxydants comme leNO2 et le OH^· (Densiov et Afanas'ev, 2005). (Figure 5)

Figure 5: Les principales sources cellulaires des ROS (D'après Bonnefont-Rouseelot.,
2003)

3. Stress oxydant et ses conséquences biologiques

L'accumulation des ROS a pour conséquence l'apparition de dégâts cellulaires et tissulaires souvent irréversibles dont les cibles biologiques les plus vulnérables sont les protéines les lipides et l'acide désoxyribonucléique (Halliwell et Whiteman 2004; Valko et al., 2007) (Figure 6)

Figure 6 : Cibles biologiques et endommagement oxydatifs induits par les ROS(D'après
Kohen et Nyska, 2002).

4. Les principales cibles des ROS

4.1. Les lipides

Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont la cible privilégiée des ROS en raison de leurs Hydrogènes bis allyliques facilement oxydables. Comme ces derniers sont les lipides majeurs des membranes cellulaires et des lipoprotéines, on comprend leurs vulnérabilités particulières. Les produits d'oxydation formés peuvent participer en tant que second messager à la régulation de fonctions métaboliques, de l'expression des gènes et de la prolifération cellulaire. Ils peuvent aussi, et surtout, se comporter comme des substances toxiques responsables des dysfonctionnements et d'altérations cellulaires (perte d'acides gras polyinsaturés, diminution de la fluidité membranaire, modification de l'activité des enzymes et des récepteurs membranaires, libération du matériel à partir du compartiment subcellulaire) (Beckman et Ames, 1998 ; Lehucher-Michel, 2001)

4.2. Les protéines

Les protéines sont constitués principalement par des acides amines qui sont la cible des ROS les acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) et aromatiques (tyrosine, tryptophane) devient les plus sensibles Si la majorité des acides aminés peuvent oxydés par les ROS. L'oxydation des acides amines génère des groupements hydroxyles et carbonyles sur les protéines mais peut également induire des modifications structurales plus importantes, (Martinez-Cayuela, 1995 ; Lehucher-Michel et al., 2001 ; Valko et al,. 2007). Les protéines modifiées deviennent généralement plus sensibles à l'action des protéases et sont alors dirigées vers la dégradation protéolytique au niveau du protéasome (Jung et al., 2007).

4.3. Les acides nucléiques (ADN)

Les bases puriques, pyrimidiques et le désoxyribose sont la cible privilégiée des ROS, ils sont alors transformés en produits de fragmentations et en bases oxydées, (Martinez-Cayuela, 1995).

La guanine est facilement transformée en 8-hydroxy-2'-déoxyguanosine (8-OHdG) qui est éliminée par des enzymes de réparation de l'ADN. Si ces systèmes de protection sont débordés ou défectueux, les altérations du matériel génétique s'accumuleront au sein de l'ADN représentant ainsi la première étape impliquée dans la mutagenèse, la carcinogenèse et le vieillissement (Lehucher-Michel et al., 2001 ; Favier, 2003 ; Valko et al., 2006).

6. Systèmes de défenses antioxydants

Un antioxydant peut être défini comme toute substance capable, à concentration relativement faible, d'entrer en compétition avec d'autres substrats oxydables et ainsi retarder ou empêcher l'oxydation de ces substrats (Berger, 2006). Les cellules utilisent de nombreuses stratégies anti-oxydantes et consomment beaucoup d'énergie pour contrôler leurs niveaux d'espèces réactives de l'oxygène. Les défenses antioxydantes de notre organisme peuvent se diviser en systèmes enzymatiques et systèmes non enzymatiques (Goudable et Favier, 1997).

6.1. Systèmes enzymatiques

a) La superoxyde dismutase

Comme l'indique son nom, la superoxyde dismutase (SOD) accélère la dismutation de l'anion superoxyde en peroxyde d'hydrogène, Il existe plusieurs isoenzymes de SOD; SOD ferreux (Fe-SOD), SOD à cuivre (Cu-SOD) et SOD à manganèse (Mn-SOD) qui diffèrent selon la localisation chromosomique du gène, leur contenu métallique, leur structure quaternaire et leur localisation cellulaire (Zelko et al., 2002).

Ces deux enzymes sont localisées dans le cytosol et dans les mitochondries. La glutathion peroxydase est une sélénoenzyme (Se-GPx) qui joue un rôle très important dans la détoxification du peroxyde d'hydrogène, mais aussi d'autres hydroperoxydes résultants de l'oxydation du cholestérol ou des acides gras en couplant la réduction de ces dérivés réactifs avec l'oxydation de substrats réducteurs comme le glutathion (GSH). La glutathion réductase (GR), quant à elle, a pour rôle de régénérer le GSH à partir du GSSG tout en utilisant le NADPH comme un cofacteur (Martínez-Cayuela, 1995 ; Sorg, 2004).

6.2. Systèmes non enzymatiques

L'acide ascorbique est une vitamine hydrosoluble, qui se trouve dans le cytosol et dans le fluide extracellulaire. Elle peut capter directement l'O2^°- et l'OH^°. Elle peut aussi réduire le

La famille des polyphénols, ils sont considérés comme des pigments quasi universels des végétaux, dont plusieurs sont responsables de couleur vive des fleurs, des fruits et des feuilles (Pietta, 2000 ; Ghedira, 2005).

7. Les polyphénols

Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires, d'un poids moléculaire élevé. Ils sont largement distribués dans le règne végétal (Haslam, 1993). La structure de base qui les caractérise est la présence d'un ou plusieurs noyaux aromatiques auxquels sont directement liés un ou plusieurs groupement hydroxyles libres ou engagés dans une autre fonction (éther, ester) (Harborne, 1994).

7.1. Les acides phénoliques

Une fonction carboxylique et un hydroxyle phénolique. La pratique courante en phytochimie conduit à réserver l'emploi de cette dénomination aux seules dérivés des acides benzoïque (acides-phénols en C6-C1) et cinnamiques (acides-phénols en C6-C3) Comme exemple d'acides phénoliques, on cite : acide caféique, acide protocatechique, acide ferulique, acide sinapique et acide gallique (Hallman ,et al., 1997) Ont une distribution très large. Ils possèdent notamment un grand pouvoir antioxydant, c'est-à-dire qu'ils neutralisent les radicaux libres qui endommagent les cellules, ce qui a pour effet de renforcer les défenses immunitaires (Kim ,2000).De plus, certains composés poly-phénoliques sont des agents antibiotiques, anti-diarrhéiques, antiulcéreux et anti-inflammatoires. Ils peuvent ainsi être utilisés dans le traitement des maladies comme l'hypertension, la faiblesse vasculaire, les allergies et l'hypercholestérolémie (Kondratyuk et al., 2004).

7.2. Les tanins

Les tanins inhibent la peroxydation lipidique des mitochondries du foie et des microsomes mais aussi l'oxydation de l'acide ascorbique et du linoléate. Lors de la peroxydation les tannins donnent des protons face aux radicaux libres, et ainsi des radicaux tanniques stables sont formés. Ce qui permet de stopper la réaction en chaîne de l'auto-oxydation lipidique. Les effets bénéfiques du thé vert ne sont plus à prouver. Le thé par ses polyphénols en particulier le gallate d'épigallocatéchine, possède des propriétés antioxydantes et capte les radicaux libres. Les polyphénols du thé vert ont en plus des propriétés antimutagènes; des propriétés anticancéreuses qui ont été démontrées (Ekoumou, 2003).

7.3. Les flavonoïdes

Ce sont des pigments responsables de la coloration des fleurs, possèdent tous un même squelette de base à 5 atomes de carbones, constitué de 2 unités aromatiques ,2 cycles en C6 (A et B) reliés par une chaine en C3 (Brunton ,1999)

7.3.1. Structure et classification des flavonoïdes

Ils ont une origine biosynthétique commune et par conséquent, possèdent tous un même squelette de base à quinze atomes de carbones, constitué de deux unités aromatiques; deux cycles en C6 (A et B), reliés par un hétérocycle en C3 (Figure7) (Brunneton, 1999; Pietta, 2000).

Figure7: Structure générale du noyau des flavonoïdes
(D'après Heim et al., 2002)

Les 14groups différents ont été identifiés dont six groupes sont particulièrement les plus
répandus et les mieux caractérisés, flavones, isoflavones, flavanones, flavanols, flavonols,
anthocyanidines (Heim et al., 2002 ; Hendrich., 2006). Les composés de chaque classe se

distinguent entre eux par le nombre, la position et la nature des substituants (groupements hydroxyles, méthoxyles et autres. . .) sur les deux cycles aromatiques A et B (Heim et al., 2002). Dans les flavonoïdes au sens strict, le Deuxième cycle benzène (B) se lie à l'hétérocycle (C) en position 2. Lorsque la liaison s'effectue en position 3, les composés résultants sont appelés isoflavonoïdes. En plus, l'hétérocycle (C) peut être une pyrone (flavone) ou son dihydrodérivé (flavanone). La fixation d'un groupement hydroxyle (OH) sur le carbone 3 dans les deux cas précédents constitue respectivement les flavonols et les flavanonols (Birt et al., 2001). À l'état naturel, on trouve très souvent les flavonoïdes sous forme de glycosides. Une ou plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors glycosylés. La partie du flavonoïde autre que le sucre est appelée aglycone ou génine, l'unité glycosidique la plus commune est le glucose mais par fois elle peut être glucorhamnose, galactose, arabinose ou rhamnose (Heim et al., 2002).

7.3.2. Localisation et distribution des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires des plantes. Ces molécules ont été identifiées dans presque toutes les parties de la plante : les feuilles, les racines, les tiges, les fleures, les graines et l'écorce (Lee et al., 1994). Les flavonoïdes sont trouvés dans les fruits, les légumes, les noix, les herbes, les épices, aussi bien que dans le thé et le vin rouge.

En effet, le thé, les agrumes, les pommes, l'huile d'olive, les oignons, le cacao et plusieurs autres fruits et légumes sont très riches en flavonoïdes, les flavanols et les flavonols y seraient les plus abondants (Schewe et Sies, 2003).

7.3.3. Effets biologiques et pharmacologiques des flavonoïdes

La principale propriété, initialement attribuée aux flavonoïdes, est d'être vasculoprotectrices et vagotoniques, car ils sont capables de diminuer la perméabilité des capillaires sanguins et de renforcer leur résistance (Brunneton, 1999). Actuellement, les flavonoïdes sont connus par de remarquables activités pharmaco biologiques comme entre autres des effets, antivirales, antimicrobiens et anticancéreux (Narayana et al., 2001 ; Seyoum et al., 2006) antiallergiques, anti-inflammatoires, anti-thrombotiques, anti-tumoraux et hépato protecteurs (Middleton et al., 2000). Ces activités sont attribuées en partie aux propriétés anti-oxydantes de ces composés naturels.

7.3.4. Activité antioxydante des flavonoïdes

Ces dernières années, une importance particulière a été accordée aux propriétés antioxydantes des flavonoïdes qui sont attribuées à; (i) leur capacité de piéger directement les RL, (ii) de chélater les ions métalliques impliqués dans la production des ROS via les réactions de Fenton et Haber-Weiss, (iii) d'inhiber quelques enzymes en particulier les oxydases, (iv) d'activer les enzymes antioxydantes et (v) de réduire les radicaux á- tocophéryl (Cotelle 2001; Lin et Weng.,2006 ; Heim et al., 2002).

8. Piégeage direct des radicaux libres

Les flavonoïdes (Flav-OH) sont thermo dynamiquement capables de réduire les radicaux libres oxydants (R^·) comme le superoxyde, le radical peroxyle, le radical alkoxyle et le OH^· par transfert d'hydrogène.

Le radical aroxyle résultant (Fl^-O^·) peut réagir avec un autre radical libre pour former une structure quinone stable. En outre, le radical aroxyle peut interagir avec l'oxygène pour donner une quinone et un anion superoxyde. La capacité des flavonoïdes d'agir comme antioxydants dépend donc, non seulement du potentiel redox du couple Flav- O
·/Flav-OH, mais aussi de la réactivité du radical aroxyle. (Rice-Evans, 2001).

8.2. Inhibition enzymatique

Les flavonoïdes sont capables d'inhiber une large gamme d'enzymes génératrices du O2 ?- et d'autres ROS, comme la xanthine oxydase, la protéine kinase C, la cyclooxygenase, lipooxygénase, monoxygénase microsomal, et la glutathion S-Transferase. Les flavonoïdes ayant une moitié catéchol sur le cycle B inhibent la succinoxidase mitochondriale et la NADH oxydase (Pietta, 2000 ; Densiov et Afanas'ev, 2005).

9. La plante médicinale Cachrys libanotis L.

9.1. Description de la plante

C'est une plante aromatique et astringique. Ses grains sont extrêmement acarides, elle possède des pétales lancéolés égaux et courbés à leur sommet, le fruit très gros, ovoïdes, anguleux muni d'une écorce épaisse et d'une substance fongueuse, a des fleurs jaunes.

9.2. Répartition

Il s'agit d'une espèce méditerranéenne présentant dans le sud de la France, Espagne, Portugal, Italie et le nord de l'Afrique, plus particulièrement en Algérie et en Tunisie. Elle croît dans les coteaux arides et ensoleillés.

9.3. Classification classique

9.5. Utilisation traditionnel de la plante

Cette plante est utilisée traditionnellement pour diminuer les douleurs résultantes du rhumatisme, son utilisation était sous forme de compresse sur les articulations du genou et ainsi utilisée pour les bébés qui avaient la difficulté dans premier tâtant

Matériel et méthode

1. Matériel biologique

Lait bovin d'une ferme de la région de Sétif collecté le jour de l'expérience, sang bovin de l'abattoir de Sétif. La récolte de la plante Cachrys libanotis L.a été effectuée au mois de décembre 2010 à la région d'Ain Touta (Wilaya de Batna).la plante a été identifié par Professeur Oudjhih Bachir département d'agronomie l'université de Batna

1.1. Réactifs chimiques

Dithiothreitol (DTT), bicine, sulfate d'ammonium, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS), gel d'héparine-agarose, xanthine, allopurinol, cytochrome c, Quercitine, rutine, acide gallique, acide tannique, Tween 40, Bleu de Coomassie Brillant (CBB) G250, Acrylamide, Bisacrylamide, proviennent tous de Sigma-Aldrich, les autres réactifs et solvants (méthanol, nbutanol, n-hexane, chloroforme, acétate d'éthyle;

Parmi l'appareillage utilisé: rotavapeur (BÜCHI), centrifugeuse 3-K30 (Sigma), 1601 Shimadzu spectrophotomètre et le spectrophotomètre UV-Vis à double faisceau (Techcomp).

2. Méthodes

2.1. Purification de la xanthine oxydase

La purification de la xanthine oxydase du lait bovin (BMXO) a été conçue suivant la technique de Nakamura et Yamazaki (1982) modifiée par Baghiani et al. (2003). le lait bovin a été centrifugé à 5000 rpm pendant 20 minutes. La crème extraite à partir de la centrifugation, a été dissoute dans un tampon composé de phosphate de potassium 0,2 M, 1mM EDTA et 5mM de DTT. Ce mélange a été soumis à une agitation douce durant 1h 30 mn, puis recentrifugé à 5000 t/m /20mn. Le surnagent récupéré additionné progressivement de 15 % (V/V) du butanol froid (-20°C) et de sulfate d'ammonium 15% (P/P), sous agitation pendant 1 heure, une fois de plus centrifugé à 10000 T/m pendant 20 mn. Apres cette opération, une autre filtration du surnageant sur de la laine de verre est intervenue, d'ou la XO à été précipité par un ajout progressif de sulfate d'ammonium 20% (P/V) sous agitation douce durant une nuit, puis centrifugation à 11000T/M pendant 30 mn. Le précipité (brunâtre) a été récupéré doucement et resuspendu dans 20 ml de tampon héparine (NaH2PO4 / Na2HPO4 25 mM, contenant 1 mM d'EDTA, (pH = 6.2), et dialysé contre ce même tampon pendant une nuit sous agitation. Afin d'éliminer les impuretés insolubles, le dialysat a été centrifugé à

18000 rpm pendant 60 min. Après filtration à travers un filtre de 45 JIm, le produit final constitue l'extrait brut de la XO.

L'extrait brut obtenu a été déposé sur une colonne chromatographique contenant un gel d'héparine-agarose équilibré et lavé par le même tampon héparine. La XO a été récupérée de la colonne par le tampon héparine contenant 0.2 M de NaCl, et dialysée contre un tampon Bicine 50 mM, pH 8.3, pendant une nuit. Enfin, l'enzyme a été répartie en aliquotes de 0.5 ml et conservée à -20 °C jusqu'à son utilisation. La colonne a été régénérée par lavage avec une solution de NaCl 1 M puis avec le tampon héparine pour une nouvelle utilisation.

2.2. Contrôle de pureté de la XO

La pureté de l'enzyme purifiée a été estimée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE) et par le rapport protéine / flavine PFR (Protein to Flavin Ratio), correspondant à la lecture de l'absorbance aux longueurs d'ondes 280 nm et 450 nm (A280nm / A450nm). Une valeur 5 ou proche de 5 est un bon signe de pureté (Bray, 1975).

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) a été réalisée selon la méthode de Laemmli (1970); le gel de séparation (10 % d'acrylamide et 2.74 % de bis-acrylamide) a été préparé dans un tampon Tris-HCl (0.125 M, pH 6.8) contenant 0.1 % de SDS (P/V) et polymérisé par ajout de 0.042 % de N,N,N'N' Tetramethylene diamine (TEMED) (V/V) et 0.1% de persulfate d'ammonium (P/V). Le gel de concentration a été préparé dans le même tampon Tris-HCl (0.125 M, pH 6.8) contenant 0.1% de SDS (P/V) et polymérisé par ajout de 0.1% de TEMED (V/V) et 0.1% de persulfate d'ammonium (P/V). Les échantillons (XO, environ 1 mg / ml) ainsi que les standards des poids moléculaires (1 mg / ml) ont été préparés dans une solution échantillon constituée d'un tampon Tris-HCl (62.5 mM, pH 6.8), 2 % de SDS (P/V), 20 % de glycérol (V/V) et 0.005 % de bleu de bromophénol (P/V). Ensuite, ils ont été chauffés à 100 °C pendant 5 minutes. Les standards des poids moléculaires (Sigma) utilisés sont de 29000 Da à 205000 Da.

La migration électro phorétique a été réalisée dans un tampon Tris-HCl (25 mM) contenant
0.192 M de glycine et 0.1 % de SDS (P/V) par application d'un courant électrique de 10 mA
jusqu'à ce que les protéines pénètrent dans le gel de séparation, l'ampérage a été ensuite

augmenté jusqu'à 37- 45 mA. Les protéines séparées ont été colorées pendant au moins une heure dans une solution de bleu de Coomassie 0.2 % (P/V) contenant 10 % d'acide acétique (V/V), 45 % de méthanol (V/V) dans de l'eau distillée. Le gel a été ensuite décoloré par une solution d'acide acétique 5-10 % (V/V).

2.3. Estimation de l'activité enzymatique de la XOR

L'activité totale de la XOR a été estimée en suivant l'augmentation de la production de l'acide urique à 295 nm, en présence de 100 jtM de xanthine comme substrat de l'enzyme et 500 uM de NAD⁺ comme accepteur d'électrons dissous dans un tampon Bicine buffer à pH 8.3 (Avis et al., 1956). L'activité de la forme oxydase a été mesurée par la même méthode mais en absence de NAD⁺:

L'activité enzymatique totale = l'activité de la forme O + l'activité de la forme D

L'activité enzymatique a été exprimée en nombre de nano mole d'acide urique produit dans une minute par milligramme de l'enzyme (nmols / min).

2.4. Extraction des flavonoïdes Cachrys libanotis

Les racines de la plante sont préalablement nettoyées, séchées et broyées à l'aide d'un mortier, 200 g de la poudre de Cachrys libanotis est mise à macérer dans un mélange méthanol/eau (85 % V/V) à un rapport de 1/10 (P/V), sous agitation douce pendant une nuit à température ambiante. L'extrait hydro alcoolique est récupéré dans un premier temps après filtration du mélange au niveau du coton puis sur verre fritté (entonnoir N°03) pour récupérer le filtrat 1 et conservé à 4°C. L'extraction a été répétée une fois et le précipité a été complété à 1 L par le méthanol 50% pour avoir le filtrat 2 qui a été mélangé avec le filtrat 1. Le mélange obtenu a été filtré pour la dernière fois sur papier filtre. Le méthanol est éliminé du filtrat par évaporation sous pression réduite dans un rotavapeur (BÜCHI). Permettant ainsi d'obtenir un extrait caractérisé par une couleur jaune foncée, qui est considéré comme étant l'extrait brut (EBr) de Cachrys libanotis. Un volume 50 ml de cet extrait a été soumis à une évaporation jusqu'à l'élimination de l'eau puis conservé à -20°C jusqu'à son utilisation puis déterminer leur valeur en matière sèche ainsi que le rendement d'extraction. Le volume restant sera fractionné ultérieurement.

2.5. Fractionnement de l'extrait brut

L'extrait brut est fractionné selon la méthode de Markham (1982) modifié par Boumarfag (2006), en utilisant une série de solvants à polarité croissante (Figure 8). L'extrait brut est initialement mélangé avec l'hexane (1 V/V), après décantation la phase organique supérieure est récupérée. Cette étape est refaite plusieurs fois avec renouvellement du solvant jusqu'à ce qu'il devient transparent. L'hexane est par la suite évaporé et l'extrait résultant est considéré comme étant la fraction de l'hexane (EHx). La phase aqueuse inférieure est soumise à un autre fractionnement par le chloroforme pour donner l'extrait du chloroforme (ECh), et enfin par l'acétate d'éthyle pour donner la fraction de l'acétate d'éthyle (EAc), en suivant les mêmes étapes que le premier fractionnement par l'hexane. Le raffinat qui en résulte représente la fraction aqueuse (EAq) les cinq fractions ont été conservées à -20°C jusqu'à utilisation. (Figure8).

Figure 8:Les étapes du fractionnement de l'extrait brut de Cachrys libanotis. Markham
(1982)

2.5.1. Dosage des composés phénoliques

La teneur en composés phénoliques des différents extraits de Cachrys libanotis a été estimée par la méthode de Folin-Ciocalteu selon (Li et al., 2007) qui est basée sur la réduction en milieux alcalin de la mixture phosphotungstique (WO42-) phosphomolybdique ( MoO42-) de réactif de Folin par les groupements oxydables des composés phénoliques, conduisant à la

formation de produits de réduction de couleur bleue. Ces derniers présentent un maximum d'absorption à 765 nm dont l'intensité est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents. La concentration des polyphénols totaux est calculée à partir de l'équation de régression de la gamme d'étalonnage établie avec l'acide gallique (0-160 jtg/ml) et est exprimée en jig d'équivalent d'acide gallique par milligramme d'extrait (jig EAG/mg d'extrait) , dans l'échantillon (Georgé et al., 2005). Brièvement, 1 ml de réactif de Folin (10 fois dilué) est ajouté à 200 jil d'échantillon ou standard (préparés dans le méthanol ou l'eau distillée) avec des dilutions convenables, Après 4 min, 800jil d'une solution de carbonate de sodium (75 mg/ml) sont additionnés au milieu réactionnel. Après 2 h d'incubation à température ambiante l'absorbance est mesurée à 765nm.

La concentration des poly phénols totaux est calculée à partir de l'équation de régression de la gamme d'étalonnage établie avec l'acide gallique (0-160 jig/ml) et est exprimée en jig d'équivalent d'acide gallique par milligramme d'extrait (jig EAG/mg d'extrait).

Figure 9 : courbe d'étalonnage de l'acide gallique. Chaque point de la courbe représente la
moyenne #177; SEM (n =3).

2.5.2. Dosage des flavonoïdes

La méthode du trichlorure d'aluminium (Bahorun et al. 1996) est utilisée pour quantifier les flavonoïdes dans les extraits de Cachrys libanotis . À 1 ml d'échantillon ou standard (préparés dans le méthanol) est ajouté 1 ml de la solution d'AlCl3 (2% dans le méthanol). Après 10

minutes de réaction, l'absorbance est lue à 430 nm. La concentration des flavonoïdes est déduite à partir d'une gamme d'étalonnage établie avec la quercétine (0-40 jtg/ml) et est exprimée en microgramme d'équivalent de quercétine par milligramme d'extrait (jtg EQ/mg d'extrait).

Figure10: courbe d'étalonnage de la Quercetine () et Rutine(?).Chaque point des deux
courbes représente la moyenne #177; SEM (n = 3)

2.5.3. Dosage des tanins

La capacité de précipiter l'hémoglobine a été déterminé par l'hémoanalyse en utilisant le sang frais bovin selon la méthode décrite par Bate smith (1973). Brièvement, un volume de sang hémolysé (absorbance =1.6) a été mélangé avec un volume d'extraits. L'absorbance de surnageant (4000 rpm pendant 10 min à4°c) est mesuré à 576 nm contre une solution blanc. La courbe d'étalonnage est construite avec l'acide tannique (0-600ug/ml) et l'efficacité de précipitation des solutions test est exprimée par équivalent d'acide tannique.

Figure11: courbe d'étalonnage de l'acide tannique. Chaque point de la courbe représente la
moyenne #177; SEM (n = 3).

2.5.4. Inhibition de l'activité de la xanthine oxydase par les extraits de Cachrys libanotis

L'effet inhibiteur des extraits de Cachrys libanotis sur l'activité de la XO a été étudié spectrophotométriquement en suivant la quantité de l'acide urique produit par oxydation de 100 uM de xanthine dissous dans un tampon phosphate de sodium saturé on air (Na2HPO4 / NaH2PO4, 50 mM, pH 7.4, contenant 0.1 mM d'EDTA), en présence de plusieurs concentrations de chaque extrait de Cachrys libanotis (préparées dans le tampon phosphate de sodium ou dans le méthanol) (Robak and Gryglewski, 1988 ; Boumerfeg et al., 2009). L'absorbance a été lue à 295 nm, et l'activité inhibitrice de ces extraits a été comparée par rapport au standard allopurinol qui est l'inhibiteur spécifique de la XO. Après ajout de la XO, la réaction a été suivie pendant 60 secondes et l'activité inhibitrice des extraits de Cachrys libanotis a été exprimée en pourcentage d'inhibition (I %) calculé ainsi:

AC: absorbance en absence de l'inhibiteur (contrôle négatif) AE: absorbance en présence de l'inhibiteur

la concentration de l'inhibiteur (Y = a X + b). Elle a été exprimée en mg/ml et comparée avec celle de l'allopurinol; IC50 = (50 - b) / a

2.5.5. Effet scavenger des extraits de cachrys libanotis sur O2°- produit par la XO

L'effet scavenger des extraits de Cachrys libanotis sur l'O2°^- produit par la XO a été déterminé en suivant la réduction du cytochrome c à 550 nm (Robak and Gryglewski, 1988). Le milieu réactionnel a été composé d'un tampon phosphate de sodium (50 mM, pH 7.4, 0.1 mM d'EDTA) bien saturé en oxygène aérien, contenant 100 uM de xanthine et 25 uM de cytochrome c et en présence de plusieurs concentrations de chacun des extraits de Cachrys libanotis (préparées dans le méthanol ou dans le tampon phosphate de sodium). La réaction est suivie pendant 60 secondes après ajout de la XO. L'activité inhibitrice de la réduction du cytochrome c par les extraits de Cachrys libanotis a été exprimée en pourcentage d'inhibition (I %) calculé ainsi:

L'IC50 de chaque extrait (concentration inhibitrice de la réduction de 50 % du cytochrome c) a été par la suite calculée à partir de l'équation qui détermine le pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration de l'extrait.

RESULTATS ET DISCUSSION

1. Purification, contrôle de pureté et estimation de l'activité de la XO

La purification de la XO a été réalisée par la méthode décrite par Nakamura et Yamazaki (1982) modifiée par Baghiani et al., (2003) à partir du lait bovin frais, par une série de centrifugations puis précipitation au sulfate d'ammonium, suivie d'une chromatographie d'affinité sur colonne de gel d'héparine basée sur l'affinité de la XO aux glycosaminoglycanes sulphatés. Le rendement de la purification est de 17.97 mg d'enzyme purifiée par litre du lait bovin frais. Il est similaire à ce qui est trouvé par Baghiani et al., (2002; 2003).

Le spectre d'absorption caractéristique de la XO par un balayage spectrophotométrique (UVVis) a présenté trois pics majeurs à 280, 325 et 450 nm (Figure 12A) qui est similaire aux résultats obtenus par les travaux de Abadeh et al., (1992), Baghiani et ses collaborateurs (2002; 2003), Benboubetra et al, (2004). Le rapport protéine / flavine PFR a été calculé comme suit: A280nm / A450nm. La XOR purifiée a un PFR de7.18, donc l'enzyme purifiée a une pureté acceptable parce qu'une valeur proche de 5 est considérée comme critère de pureté (Bray, 1975).

La pureté de l'enzyme a été confirmée par une électrophorèse (SDS-PAGE). Le chemin électrophorétique a présenté une bande majeure d'approximativement 150 KDa (Figure12B) ce qui est similaire aux résultats des études effectués en 2003 par Baghiani et ses collaborateurs, et en 2004 par Atmani et ses collaborateurs.

Figure 12: Spectre d'absorption UV-Vis (A), électrophorèse (SDS-PAGE) (B) de la XO purifiée. B1: XO pure (150 000 Da), B2: Standards des poids moléculaires (220 000; 100 000; 65000; 40 000; 30 000)

L'activité totale et l'activité de la forme oxydase de l'enzyme purifiée a été estimée en présence de xanthine comme un substrat réducteur et de NAD+ et d'O2 comme substrat oxydant, et le pourcentage de la forme oxydase a été par la suite calculé. Donc, l'enzyme pure a présenté une activité totale de 2261 nmol / min / mg protéine, et le pourcentage de la forme oxydase (XO) de l'enzyme a été de 89 % (Tableau 2). Ces résultats sont similaires à ceux de Baghiani et al., (2003), qui indiquent, que l'activité de la XOR du lait des différentes espèces mammifères est liée à la forme inactive démolybdo de l'enzyme.

Tableau 2: L'activité totale et oxydase de la XOR purifiée à partir du lait bovin frais.

Activité (nmol /min / mg protéine)^* Pourcentage de Rapport
la forme protéine/flavine

2. Extraction et dosage des polyphénols, des flavonoïdes et des tannins

L'extraction des flavonoïdes de la racine de Cachrys libanotis a été effectuée par les solvants organiques à partir d'une poudre végétale. Cette extraction a permis d'obtenir cinq extraits. Selon Newman et al., (1974) et Markham et al., (1982) les composés que pourraient contenir les différents extraits préparés seraient comme suit: l'extrait brut peut contenir des flavonoïdes, des acides aminés, des terpènes, des cires et des tannins, l'extrait d'hexane qui est en générale constitué de lipides et de flavonoïdes aglycones hautement méthoxylés, l'extrait du chloroforme est plus riche en flavonoïdes aglycones, l'extrait d'acétate d'éthyle contient les flavonoïdes glycosylés en particulier mono, di et tri-glycosylés et l'extrait aqueux peut être constitué des flavonoïdes les plus polaires (di, tri et tetra-glycosylés).

Le calcule des rendements par rapport au poids de la poudre végétale (Tableau 3) a montré que l'EBr a (15.2 #177; 0.16 %),. l'ECh a un rendement de (0.26 #177; 0.007 % )qui est 7 fois inférieur à celui de l'EAq, l'EAc (0.208 #177; 0.008 %) est le plus faibles et 7 fois inférieurs à celui de l'EAq et enfin l'EAq représente le rendement le plus élevé (7.38 #177; 0.10%)

Tableau3: Le rendement des extraits de Cachrys libanotis et ses teneurs en polyphénols totaux, tanins et en flavonides.

	Rendement	Polyphénols	Flavonoïdes
Les	(%)	totaux	Flavonoïdes		Tanins
Les	(%)	totaux			Tanins
extraits		(mgEAG/g E)	mg EQ / g E	mg ER / g E
EBr	15.2 #177; 0.16	175.34 #177; 1.42	0.50 #177; 0.0069	1.24 #177; 0.03	0.055 #177; 0.004
ECh	0.26 #177; 0.007	12.90 #177; 6.014	0.002 #177;0.0011	0.067 #177; 0.022	0.08 #177; 0.018
EAc	0.208 #177; 0.008	17.30 #177; 2.033	0.26 #177; 0.28	0.38 #177; 0.29	0.1 #177; 0.015
EAq	7.38 #177; 0.10	124.64 #177;.1.077	0.39 #177; 0.011	1.062 #177; 0.003	0.06 #177; 0.005

majorité des effets pharmacologiques des plantes est dû à ces substances, un dosage des polyphénols totaux et des flavonoïdes des quatre extraits (EBr, ECh, EAq et EAc) de Cachrys libanots, a été effectué pour en estimer les teneurs.

Les polyphénols totaux dans ces extraits sont dosés selon la méthode de Folin-Ciocalteu selon (Li et al., 2007). D'après les résultats présentés dans le (Tableau 3), l'EBr (175.34 #177; 1.42 ug EAG/g E), pour l'ECh qui contient presque la moitié de la quantité de polyphénols trouvée dans l'ECh (12.90 #177; 6.01 ug EAG/g E) l'EAc (17.30 #177; 2.033). L'EAq est le plus riche en polyphénols (124.64 #177; 1.077 ug EAG/g E). La détermination des taux des flavonoïdes par la méthode de trichlorure d'aluminium révèle que l'EBr représente la fraction la plus riche en flavonoïdes avec une teneur (0.50 #177; 0.006mg EQ / g E), ensuite l'EAq avec (0.39 #177; 0.01 mg EQ/g E) et enfin l'EAc et l'ECh (0.26 #177; 0.28 ; 0.002 #177; 0.001mg EQ/g E ) Si les calcules sont effectués à partir de la courbe d'étalonnage de la rutine, la concentration des flavonoides dans ces extraits est doublée parce que la pente de la courbe d'étalonnage de la rutine égale à la moitié de celle de la quercétine (Figure 10, section matériel et méthodes).pour les tanins, selon nos resultats on peut considerer que la partie racine la plante de Cachrys libanotis est pauvre des tanins.(Tableau 3)

3. Inhibition de la xanthine oxydase par les extraits de Cachrys libanotis

L'effet inhibiteur des extraits de Cachrys libanotis sur l'activité de la XO du lait bovin a été évaluée spectrophotométriquement à 295 nm. Les résultats obtenus montrent que tous les extraits inhibent l'activité de la XO très significativement d'une maniére dose depandante.(Figure 13)

Figure 13 : Effet inhibiteur des extraits de Cachrys libanotis. Chaque point représente la
moyenne #177; SD (n = 3). (A) : Extrait brut, (B) : Extrait chloroform, (C) : Extrait éthyl acétate

(IC50 = 0.138 #177; 0.002 mg/ml, 1.048 #177; 0.001 mg/ml), respectivement. L'ECh et l'EAc ont un effet presque 32 et 26 fois inferieur à l'allopurinol (IC50 = 0.00419#177;0.00036) (Adjadj, 2009), respectivement, alors que l'EBr est presque 250 fois plus faible.

Figure14: Les concentrations des extraits de Cachrys libanotis, qui inhibent 50 % de
l'activité de la XO. Chaque valeur représente la moyenne #177; SD (n = 3).

Il existe des substances qui inhibent la XO en bloquant la fixation du substrat au sites actifs de l'enzyme (Skibo, 1986; Sanders et al., 1997), donc l'inhibition de l'activité de la XO par les extraits Cachrys libanotis est traduite par la présence d'un ou de plusieurs composés agissant sur les sites actifs, Mo et FAD, de l'enzyme. Chose qui confirme la corrélation entre nos résultats de l'activité inhibitrice de l'enzyme, cette activité peut etre attribuée à la presence des flavonoides glycosylés. De nombreuses études ont évalué l'effet inhibiteur de différentes plantes sur l'activité de la XO (Owen and Johns, 1999; Kong et al., 2000; Sweeney et al., 2001; Zhu et al., 2004; Ferraz Filha et al., 2006; Umamaheswari et al., 2007; Boumerfag et al.,2009 ;Baghiani et al., 2010), cette activité inhibitrice est peut être attribuée a la présence de différents composés bioactifs tels que les polyphénols (Costantino et al., 1992; Chiang et al., 1994), les tannins (Schmeda-Hirschmann et al., 1996) et les flavonoïdes (Iio et al., 1985; Hanasaki et al., 1994; Cos et al., 1998; Lin et al., 2002; Van Hoorn et al., 2002; Da Silva et al., 2004).

Cos et ses collaborateurs (1998) ont déterminé la relation entre la structure chimique des
flavonoïdes et leurs activités inhibitrices de la XO. Ils ont montré que la présence de la double
liaison entre les carbones C2 et C3 et l'absence du groupe hydroxyle en C3 des flavonoïdes

augmentent leur activité inhibitrice. Malgré que les deux extraits Ch et l'Ac contenant une quantité faible en flavonoides comparent a l'EBr, il ce peut que l'ECh et EAc contient des substances avec une structure spécifique qui pourraient être à l'origine de son activité inhibitrice le plus puissante.

4. Effet scavenger des extraits de Cachrys libanotis sur l'O2°- produit par la XO

Pour étudier l'effet scavenger des extraits de Cachrys libanotis sur l'anion superoxyde produit par la XO, la réduction du cytochrome c (cyt c) par l'O2^°- a été suivie à 550 nm. Les résultats ont montré que les extraits inhibent la réduction du cyt c, d'une manière dose-dépendante (Figure15). Les résultats des _IC50 des trois extraits de Cachrys libanotis sont représentés dans le (Tableau 5). L'effet inhibiteur de la réduction du cyt c le plus puissant est celui de l'ECh (IC50 = 0.222 #177; 0.001mg/ml), suivie par EAc (IC50 = 0.415 #177; 0.015mg/ml) qui a un effet presque 2 fois inférieur à celui de l'ECh et 6.5 fois superieur à celui de l'EBr qui est le plus faible (IC50 = 2.68 #177; 0.084mg/ml).

Tableau 5:les concentrations des extraits de Cachrys libanotis , qui inhibent la reduction de 50% du cyt c par l'O2°^- produit par la XO.

Figure 15 : Effet scavenger des extraits de Cachrys libanotis. Chaque point représente la
moyenne #177; SD (n = 3). (A) : Extrait brut, (B) : Extrait chloroform, (C) : Extrait éthyl acétate

L'inhibition de la réduction du cyt c est dû à l'effet inhibiteur de la XO et / ou l'effet scavenger sur l'O2^°- produit par cette enzyme (Valentao et al., 2002). Les _IC50 des trois extraits de Cachrys libanotis, sont représentés dans la (Figure 16) Pour l'EBr, _IC50 de la production de l'acide urique à partir de l'oxydation de la xanthine par la XO est presque 2.5 fois plus faible que celle inhibitrice de la réduction du cyt c. La même chose pour l' l'EAc qui a une _IC50 de la réduction cyt c presque 4 fois supérieur à celle inhibitrice de la XO. Alors que l'ECh a une _IC50 de la réduction du cyt c presque double de celle inhibitrice de la XO.

Figure 16: Effet inhibiteur de la réduction du cyt c par l'O2^° produit par la XO des extraits de
Cachrys libanotis. Chaque point représente la moyenne #177; SD (n = 3).

L'effet scavenger des radicaux libres par les différents constituants des plants est peut être dû aux acides phénoliques (Kimura et al., 1985; Hatono et al., 1989) et aux flavonoïdes (Hatono et al., 1989). Plusieurs études ont établi des relations entre les structures chimiques des flavonoïdes et leur capacité à piéger les radicaux libres (Jovanovic et al., 1994; Cotelle et al., 1996; Bors et al., 1997; Cos et al., 1998; Dugas et al., 2000). Les composés les plus actifs sont ceux qui combinent les trois critères suivants: la structure ortho-dihydroxy sur le cycle B (groupement catéchol), la double liaison _-C3 adjacente à la fonction 4-oxo et la présence du groupe 3-OH en combinaison avec la double liaison _-C3 (Rice-Evans et al., 1996; Furuno et al., 2002). Selon Cos et al.la classification des flavonoïdes qui possèdent un effet inhibiteur de l'enzyme et au même temps une activité anti radicalaire. Ces substances peuvent être classer à la class C, cette classe a une propriété très spécifique qui contient un hydroxyle au niveau du carbone (-C3).malgré que l'ECh a un teneur de flavonoïde plus faible que l'EAc et l'Br l'ECh est le plus elevée comme scavenger, ce qui peut indiquer que les extraits contient des molécules avec une structure spécifique pour l'activité scavenger.

On conclusion, les résultats de notre présent travail montrent que les deux extraits de Cachrys libanotis, ECh et EAc ont un effet relativement élevé sur l'inhibition de l'acide urique et la réduction du cyt c, ce qui est peut être dû à la richesse des deux extraits en polyphénols et en flavonoïdes specifique . La diminution de la production de l'acide urique est suivie par une diminution de la production de l'anion superoxyde. Donc, l'inhibition de la réduction du cyt c par les extrais de Cachrys libanotis.L est dû soit à l'inhibition de la XO ou à l'effet scavenger sur le radical superoxyde, ce qui est en accord avec les résultats de Fridovich (1970). Wu et Ng (2008) ont démontré que les extraits de Momordica charantia abbreviata possèdent un

effet inhibiteur de la XO et un effet scavenger sur le superoxyde très élevés. Les résultats de notre travail ont montrés que l'ECh possède un effet scavenger proche à celui de l'inhibition de la XO, alors que les deux extraits (EAc et EBr) ont un effet inhibiteur plus élevé que leur effet scavenger sur le superoxyde.

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RESUME : L'objectif principal de cette étude est l'évaluation de l'effet inhibiteur des extraits des racines de la plante cachrys libanotis, utilisée en médecine traditionnelle en Algérie, sur la xanthine oxydase (XO) et de ses propriétés antioxydants. La XO a été purifiée du lait bovin avec un rendement de17.97 mg/l, un rapport protéine/flavine de 7.18, et avec une bande majeure d'environ 150 KDa, en SDS-PAGE, indiquant une pureté acceptable de l'enzyme. L'activité spécifique de l'enzyme purifiée a été de 2261 nmol/min/mg protéine. L'EAc donne la plus puissante inhibition en vers XO avec un IC50 de (IC50 = 0.11#177; 0.006mg/ml)suivi par l'ECh et l'EBr _(IC50 =0.138#177; 0.002 et 1.048#177; 0.001mg /ml) par contre l'inhibition de la l'ECh donne la plus grande inhibition en vers la reduction de cyt c avec un (IC50 = 0.222 #177; 0.0015mg/ml), suivi par l'EAc et l'EBr respectivement avec (0.415 #177; 0.015et 2.68 #177; 0.084mg /ml), les résultats obtenus suggèrent que ces produits naturels peut être utiliser pour traiter les maladies qui nécessites l'inhibition de la XO et le scavenger des radicaux libres

SUMMARY: This study was conducted to search for xanthine oxidase (XO) inhibitors from Cachrys libanotis L.root extracts traditionally used in folk medicine in Algeria. XO was purified from fresh bovine milk with yields of 17.97 mg / L, protein / flavine ratio of 7.18 and a major band, on SDSPAGE, of approximately 150 KDa, indicating an acceptable purity of the enzyme. The total specific activity of the purified enzyme was of 2261 nmol / min / mg protein. The EAc showed the highest in inhibitory properties on the XO activity (IC50 = 0.11 #177; 0.006 mg / ml), followed by ECh with IC50 for XO inhibitory activity of 0.138 #177; 0.002 mg / ml then EBr with an IC50 ( 1.048#177;0.001 mg / ml). Whereas, the inhibition of cyt c reduction the highest activity was that of ECh with IC50of 0.222 #177; 0.001 mg / ml), followed by EAc then EBr extracts with an IC50 of 0.415 #177; 0.015 mg a /ml and 2.68 #177; 0.084 mg / ml, respectively. These results suggest that these natural products could be used to treat lot of diseases, where inhibition of XO and free radical scavenging activity are necessary.