Hépatite virale B: intérêt de l'utilisation des échantillons de sang séché dans l'extraction de l'ADN viral

3.3. Résultats de PCR en fonction du mode de conservation

Tableau IX : Répartition des résultats de la PCR du VHB en fonction des sujets du

groupe I

a. Groupe I

Groupe Is Groupe Ip

N % N %

Inhibiteurs 3 15,00 1 5,00

Négatif 9 45,00 11 55,00

Positif 8 40,00 8 40,00

TOTAL 20 100 20 100

p= 0,54, la différence est non significative

b. Groupe II

Tableau X: Répartition des résultats de la PCR du VHB en fonction des sujets du

groupe II

Groupe IIs Groupe IIp

N % N %

Inhibiteurs 1 5,00 1 5,00

Négatif 11 55,00 11 55,00

Positif 8 40,00 8 40,00

TOTAL 20 100 20 100

p= 1,00 ; la différence est non significative

3.4. Résultats de la PCR en fonction du type de prélèvement

a. Sang total

Tableau XI : Répartition des résultats de la PCR du VHB du sang total

GI GII

N % N %

Inhibiteurs 3 15,00 1 5,00

Négatif 9 45,00 11 55,00

Positif 8 40,00 8 40,00

TOTAL 20 100 20 100

p= 0,54 ; la différence est non significative

b. Plasma

Tableau XII : Répartition des résultats de la PCR du VHB du plasma

GI GII

N % N %

Inhibiteurs 1 5,00 1 5,00

Négatif 11 55,00 11 55,00

Positif 8 40,00 8 40,00

TOTAL 20 100 20 100

P=1,00 ; pas de différence

Nous avons trouvé 5 patients ADN viral positif et 9 patients ADN viral négatif sur les 4 groupes, c'est-à-dire le même profil (Positif ou négatif) quelque soit le mode de conservation et le type de prélèvement.

Par ailleurs, 6 patients ont des profils différents selon les conditions de conservation et de prélèvement, soit :

· Un patient positif dans les groupes Is, Ip, IIs mais avec la présence d'inhibiteurs dans le groupe IIp ;

· Un patient positif dans les groupes Is, Ip, IIp, mais négatif dans le groupe IIs ;

· Un patient positif dans les groupes Is, IIp, IIs, mais négatif dans le groupe Is ;

· Un patient négatif dans les Groupes Ip et IIp, mais avec la présence des inhibiteurs dans les groupes Is et IIs ;

· Un Patient positif dans les groupes IIs et IIp, mais ayant présenté les inhibiteurs dans les groupes Is et Ip ;

· Un patient Négatif dans les groupes IIs et IIp, mais positif dans le groupe Ip, avec la présence des inhibiteurs dans le groupe Is.

DISCUSSIONCES

1. Analyse de la méthodologie

1.1. Types et période de l'étude

Le caractère prospectif de cette étude assure une qualité optimale aux résultats, le recueil d'informations étant contemporain au prélèvement.

La comparaison des groupes constitués des mêmes patients a permis d'éviter le biais lié à la différence des critères de sélection des patients.

La durée de la période d'étude a été définie par la nécessité d'obtenir un échantillon statistiquement significatif, cependant la faible taille de l'échantillon, limitant l'interprétation des données épidémiologiques, s'explique par le fait que les moyens financiers que nous avons eu étaient faibles pour réaliser une étude fondamentale, comportant plusieurs patients.

1.2. Population de l'étude

Le seul critère d'inclusion à l'étude a été établi dans le but d'éviter le biais dans l'interprétation des résultats. Il s'agit de la positivité à l'AgHBs. Ce critère a été également utilisé par Khelifa F. et al, dans une étude visant à déterminer les génotypes du VHB circulant en Algérie [39]. Ce choix s'explique par le fait que seule la recherche de l'Ag Hbs est réalisée dans les centres de transfusion sanguine au Congo, dans le cadre du dépistage du VHB. Cependant, la présence de l'Ag HBs ne signifie pas toujours la présence de l'ADN viral. Seule l'Ag HBe est considérée comme témoin indirect de la présence de l'ADN viral [23].

1.3. Critères de jugement

Les critères définis ont permis de comparer les 2 protocoles de traitement des échantillons de sang séchés, sans tenir compte de la présence ou non de l'Ag HBe. Les résultats de la quantification de l'ADN total ont été repartis en 4 groupes pour pouvoir évaluer le rendement des protocoles utilisés, car l'ADN total était considéré comme l'ensemble de l'ADN humain et de l'ADN viral du VHB y compris les autres virus.

Les résultats de la PCR du VHB ont été exprimés en positif ou négatif au lieu de valeurs quantitatives car le protocole utilisé pour l'extraction de l'ADN a permis d'obtenir 50ul d'extrait et que 10ul ont été utilisés pour la quantification de l'ADN total. Ainsi, pour la PCR du VHB, nous avons utilisé 40ul d'extrait au lieu de 50ul, tel que prévu par le protocole du kit COBAS Taq Man test. Cette erreur ne met pas en cause la qualité de l'étude, car la PCR du VHB permet de détecter l'ADN viral même pour des volumes plus faibles. Cependant les valeurs quantitatives doivent être considérées avec précaution.

1.4. Protocoles d'extraction et d'élution de l'ADN

Le rendement, après 3 essais, a montré que la méthode utilisant le kit QIAamp DNA mini kit, décrite par Jardi et al [37] donne moins d'ADN que la méthode au phénol chloroforme, décrite par Vauloup-Fellous et al [38]. Ceci a justifié l'utilisation de la méthode au phénol chloroforme pour l'extraction et l'élution des échantillons de l'ensemble des patients.

2. Fréquences

Au cours de notre étude nous avons obtenu une séroprévalence de 11,71%. Cette séroprévalence n'a pas changé depuis 2 décennies car elle est similaire à celle trouvée par J. Miehakanda et al [40] chez les donneurs de sang du centre de transfusion sanguine de Brazzaville entre 1986 et 1987(11,6%). Elira-Dockekias A. et al [41] ont trouvé en 2002 une séroprévalence de 7,20%. Par ailleurs, dans les autres pays d'Afrique les études sont divergentes à ce sujet, au Cameroun, Mbanya DN et al [42] ont trouvé une séroprévalence du VHB de 10,7% alors que Batina [43] a trouvé 4,7% en République Démocratique du Congo.

Notre séroprévalence est toute fois proche de celle fixée par l'OMS qui place le Congo dans la zone de forte endémie, dont la prévalence est supérieure à 8% [2].

3. Structure de la population

3.1. Sexe et âge

La population étudiée est constituée de 85% des sujets de sexe masculin pour 15% de sexe féminin. Cette proportion est similaire à celle retrouvée par Batina et al [43] soit 75% de sexe masculin. Cependant, cela ne veut pas dire que le sexe masculin est prédominant chez l'ensemble des porteurs de l'Ag HBs. Ceci s'explique par le fait que la population des donneurs de sang est constituée en grande partie des hommes, soit 83,05% pour notre étude et 91,17% pour Miehakanda et al [40]. Par ailleurs, dans une population autre que les donneurs de sang, la différence entre les deux sexes n'est pas significative car Makuwa et al [44] ont trouvé un sex-ratio de 0,83 dans une population hospitalisée à Brazzaville.

La majorité des sujets avaient un âge compris entre 25 et 34 ans, soit 35%, suivi de la tranche de 35 et 44ans avec un âge moyen de 35,40 #177; 9,60ans. Il n'y a pas eu de différence significative entre les résultats obtenus (p>0,05). L'âge moyen est similaire à l'âge trouvé par Batina et al [43], soit 35 #177; 1,24 ans.

Notre étude a concerné la population des donneurs de sang et le don de sang est autorisé à partir de 18 ans jusqu' à 60 ans. Il est donc peu probable que l'âge soit un facteur susceptible d'influencer la qualité des résultats.

3.2. Antécédents

Aucun antécédent n'a été retrouvé chez 75% de la population étudiée. Ceci s'explique par le fait que l'interrogatoire réalisé au cours du recrutement des donneurs de sang, portant sur les antécédents, les facteurs de risque d'infection à VHB, permet d'écarter les sujets à risque. Par ailleurs, nous avons trouvé 2 sujets avec les antécédents de transfusion sanguine ; cependant dans les 2 cas, la transfusion remontait à plus de 30 ans (31 ans pour un sujet et 36 ans pour l'autre).

Aucun sujet n'a reçu le vaccin contre le VHB, ceci témoigne de la faible couverture vaccinale encore remarquable au Congo. Miehakanda et al [40] ont évoqué une couverture vaccinale de 4,2% chez les sujets à risque à Brazzaville.

4. Paramètres biologiques

4.1. L'ADN total

Dans notre étude, l'extraction de l'ADN a été réalisée à partir d'un spot comportant, d'une part 30 ìl de sang total et d'autre part 30 ìl de plasma. L'extraction des cartes de référence (sujet témoin non connu VHB positif et sujet connu VHB+) a montré une sensibilité supérieure de l'extraction au phénol chloroforme après traitement par la protéinase K, par rapport par le kit Qiagen. La détection semble inchangée quelque soit le mode de conservation et de transport (conservation à température ambiante ou à -20°C).

Jardi et al [37] ont effectué cette extraction à partir du papier buvard, en utilisant la méthode par le kit Qiagen. D'autres ont effectué l'extraction de l'ADN à partir du papier buvard, mais dans le but de rechercher d'autres infections virales. Comme c'est le cas de Vauloup-Felloup et al [38], dans la recherche du Cytomégalovirus. Il s'agissait d'une étude comparative entre la méthode au Phénol chloroforme, le kit Qiagen et l'extraction par la chaleur. Les résultats sont en faveur de la méthode au Phénol Chloroforme.

Fischer A. et al ont également utilisé cette méthode dans la recherche du VIH.

Nos patients ont été choisis pour leur positivité de l'Ag HBs et la charge virale étant imprévisible chez ces patients, nous avons donc retenu les conditions d'extraction les plus sensibles, soit une extraction classique au phénol- chloroforme à partir d'un spot du papier buvard.

4.2. PCR du VHB

Les analyses des échantillons de sang total et de plasma ont révélé une étroite corrélation entre les résultats de l'ADN viral, car nous avons obtenu les mêmes résultats lorsqu'il s'agit du plasma. Par ailleurs, pour le sang total, nous avons observé la présence de quelques inhibiteurs de la PCR, mais la différence n'est pas significative.

La présence des inhibiteurs de la PCR du VHB est faible quelques soit le mode de conservation et quelques soit le type de prélèvement, car dans les 4 groupes la différence n'est pas significative. Cette constatation indique que le tampon d'élution de l'ADN du VHB sur du papier buvard, est pur, et ne présente pas de pertes importantes mesurables au cours d'élution.

La conservation à température ambiante n'a pas d'incidence sur les niveaux d'ADN du VHB ou l'intégrité d'ADN, car les résultats sont similaires à ceux des échantillons qui ont été conservés à -20°C. Cette constatation nous fait penser que la conservation à température ambiante présente plus d'avantages en ce sens qu'elle ne nécessite pas un équipement frigorifique important. Il faut surtout s'assurer que le prélèvement est bien sec et isolé pour éviter toute contamination.

Le type de prélèvement semble n'est pas avoir de conséquences, car dans notre étude, le rendement d'ADN viral est similaire que ce soit le plasma ou le sang total. Cette constatation nous fait remarquer que même une goutte épaisse peut permettre d'extraire de l'ADN du VHB et donc permettre de poser le Diagnostique moléculaire de l'infection à VHB.

L'absence de disparité dans les groupes (tous les groupes 40% des sujets VHB positif) nous fait penser que la méthode d'extraction utilisée est fiable. Cependant, la sensibilité de notre méthode n'a pas été évaluée, car une comparaison avec une technique de routine avec les échantillons de sang non séché n'a pas été possible au cours de notre étude. En revanche, Vaulaup-Fellout et al [38] ont trouvé une sensibilité de l'ordre de 10-3, en comparant la méthode d'extraction à partir du papier buvard par le phénol chloroforme, après traitement par la protéinase K et l'extraction des échantillons de sang total non séché.

Dans tous les groupes, nous avons eu 40% de sujets VHB positif sur l'ensemble des 20 sujets AgHBs positif. Ceci peut s'expliquer par le fait de la présence de l'AgHBs ne signifie pas toujours la présence de l'ADN viral, d'où une recherche de l'Ag HBe serait intéressante. Cependant, l'hypothèse des variants non amplifiés par la PCR est à évoquer.

Notre étude a porté sur la population des donneurs de sang, qui sont tous asymptomatiques. L'évolutivité antérieure de l'infection et des éventuels retentissements hépatiques qu'elle aurait pu avoir n'ont pas été évalué. Par conséquent, nous pensons que les sujets ADN positif sont repartis en 2 groupes :

Le premier groupe, des porteurs sains, chez lesquels on trouve une réplication virale résiduelle. Ces sujets sont soumis aux risques théoriques de réactivation, de surinfection par le VHD ou le VHC. Cependant Pol et al [23] ont démontré que ces risques sont très faibles en l'absence d'immunodépression.

Le deuxième groupe, des sujets ayant une réplication intermittente, vus en phase de latence clinique et qui peuvent avoir des lésions histologiques.

En pratique, il faut surveiller ces sujets, au moins de façon annuelle, pour distinguer les différents cas de figure. Pol et al [23] ont proposé un dosage des transaminases, un dépistage du CHC par le dosage de l'alpha foeto-protéine, l'échographie hépatique et l'utilisation des tests non invasifs de fibrose hépatique tels que le fibroscan, le Fibrotest et l'Actitest.

Cette technologie de biologie moléculaire avancée, de quantification d'ADN du VHB n'est pas disponible dans tous les pays en développement, et souvent, ces analyses sont effectuées dans les centres de référence, situés dans les pays développés et impliquent une série de problèmes, principalement en ce qui concerne la stabilité des acides nucléiques, le traitement, et les conditions de transport. L'utilisation des échantillons de sang séché a été considérée comme une alternative. La collecte de sang sur papier buvard nécessite une petite quantité de l'échantillon ; elle est peu invasive et produit un échantillon qui est peu coûteux à expédier, et ne nécessite pas de traitement spécial ou des conditions de conservation particulières.

Cependant, les conditions de transport d'un pays à l'autre, sans risque de contamination doivent être bien précisées dans une étude plus importante. Fischer A. et al [45], ont proposé des conditions de transport des échantillons de sang séché sur papier buvard dans le diagnostic de l'infection à VIH : chaque papier buvard doit être bien sec et protégé (pochette plastique ou film cellophane) afin d'éviter tout contact entre les échantillons lors du transport. Un système d'acheminement au laboratoire doit être mis en place. Des partenariats avec les Postes et les services de courrier express doivent être envisagés.