5.6. Dosage de l'ADN total
L'ADN total a été dosé en utilisant le
Kit Quant-iT DNA Assay (Terner Biosystems, Sunnyvale Californie, USA) selon le
protocole suivant : 10 ul d'extrait d'ADN et 1ul pour chacun des 8 points
de la gamme étalon ont été ajouté à 200 ul
de la solution de travail dans un puits d'une plaque de micro-titration. La
plaque est ensuite centrifugée brièvement et l'évaluation
de la quantité de l'ADN total s'est faite sur le STRATAGENE Mx 3000p.
Cette évaluation est basée sur le principe de la quantification
absolue par étalonnage avec un standard : les cinétiques
sont mesurées pour différentes concentrations des
échantillons. On en déduit une courbe du Ct en fonction de la
quantité d'ADN et une mesure du coefficient d'efficacité E (qui
doit être le plus proche de 2). La courbe d'étalonnage ainsi
constituée permet de déduire la concentration à partir de
la mesure du Ct.
Pour l'analyse statistique, 4 intervalles ont
été définies en fonction de la quantité de l'ADN
total en ng/ul, avec un pas de 2 :] 5-7] ; ]7-9] ;
]9-11] et ]11-13].
5.6.1. Polymerase chain reaction du VHB
La PCR du VHB a été réalisé par le
COBAS® Taq Man® HBV test (Roche, France)
utilisant le nécessaire « Acide nucléique viral high
Pure system » pour la préparation manuelle des
échantillons et l'analyseur COBAS Taq man 48 pour la détection et
l'amplification automatisée. Il s'agit d'une technique de PCR en temps
réel utilisant les amorces complémentaires spécifiques du
VHB et la détection par sondes oligonucléotidiques doubles ou
clivées, à marquage fluorescent, qui permettent la quantification
du produit cible VHB amplifié (amplicons) et de l'ADN du standard de
quantification VHB, qui est traité, amplifié et
détecté simultanément avec l'échantillon. Les
résultats ont été interprétés à
l'aide du logiciel AMPLILINK version 3.2.
5.6.2. Critères de jugement
Il s'agit des paramètres évalués dans le
but de vérifier l'hypothèse de recherche selon laquelle, pour
éluer et extraire l'ADN du papier buvard, la conservation et le
transport à température ambiante des échantillons
séchés ont plus d'avantages que la conservation et le transport
à - 20°C d'une part et le plasma séché a plus
d'avantages que le sang total séché d'autre part.
Ces critères sont :
- La quantité de l'ADN total élué, elle a
été évaluée en ng/ul
- La charge virale, obtenue après PCR du VHB, elle
a permis de confirmer que l'ADN total élué contient l'ADN du
VHB.
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