àƒ??°valuation du diagnostic par PCR directe et PCR-élisa sur les ITS des trypanosomes pathogàƒÂ¨nes du bétail

Deuxième partie : Etude expérimentale

Chapitre 1 : Présentation du cadre d'étude

Nos travaux se sont déroulés au Centre International de Recherche Développement sur l'Elevage en zone Subhumide (CIRDES) de Bobo-Dioulasso. Bobo-Dioulasso est la deuxième ville du Burkina Faso et est le chef lieu de la province de Houet située au sud ouest du pays. Cette ville est dans la zone subhumide avec un climat de type soudanien. On y trouve une végétation favorable au développement des glossines qui sont les principaux vecteurs de la trypanosomose animale.

Le CIRDES est une institution sous-régionale qui compte six pays membres : le Bénin, le Burkina Faso, la Côte d'ivoire, le Mali, le Niger et le Togo. Il a pour mandat de mener des activités de recherche-développement pour améliorer la santé des animaux domestiques et accroître leur productivité, en vue de satisfaire aux besoins croissants des populations, notamment en lait et en viande. Le centre s'investit à atteindre ses objectifs en accordant une importance particulière aux maladies à transmission vectorielle, à savoir la trypanosomose animale et la cowdriose, à la conservation des ressources génétiques animales, à la préservation de l'environnement et enfin à la formation des cadres. Ces activités se déroulent aux seins de trois unités de recherches et une cellule de formation :

Ø l'unité de recherche sur la production animale (URPAN) ;

Ø l'unité de recherche sur l'élevage et l'environnement (UREEN) ;

Ø l'unité de recherche sur les bases biologiques de la lutte intégrée

(URBIO) ;

Ø la cellule de communication et de formation (CCFOR).

L'URBIO, unité héritière de presque l'ensemble des activités du CRTA, constitue la pièce maîtresse du centre. C'est au sein de cette unité que nous avons entrepris nos travaux durant 9 mois, d'août 2004 en mai 2005.

Figure 12 : Localisation du CIRDES matérialisé par son logo sur la carte du Burkina

Faso

Chapitre 2 : Matériel et Méthodes

1. Matériel

1-1. Matériel de laboratoire

Pour les besoin du diagnostic par PCR, le CIRDES est équipé d'un laboratoire où l'on retrouve en plus des autres salles, une salle de préparation du mélange réactionnel, une salle d'amplification de l'ADN, une salle d'électrophorèse et une salle de visualisation du gel. Le matériel nécessaire à la PCR y est retrouvé :

· Des pipettes à volume variable (10 ul à 1000 ul), des pipettes multicanaux, des tubes eppendorf et des embouts jetables ; 

· un vortex et des microcentrifugeuses ;

· des balances, pH mètre, bain maries, et diverses verreries de laboratoires ;

· des hottes aspirantes ;

· des thermocycleurs (M J Research Inc, PTC 200^TM, M J Research Inc, PTC 500^TM machine à gradient Biometra® ) ;

· des cuves à électrophorèse et un four micro-onde de 900 Watts micrologic® ;

· une caméra à lampe UV couplée à un moniteur muni d'une imprimante.

Lors de la révélation par ELISA, l'on dispose en plus des matériels ci dessus, des microplaques ELISA (Maxisorp®), un incubateur et un spectrophotomètre (lecteur de plaques ELISA) Labsystem Multiskan® MCC/340.

1-2. Matériel biologique

1-2-1. Souches de trypanosomes témoins (ADN purifiés)

Pour la PCR, les témoins positifs sont constitués des ADN purifiés des différentes souches de trypanosomes pathogènes (T. vivax, T. congolense type savane, T. congolense type forêt et T. brucei) (annexe 1). Pour la mise au point de la PCR ELISA, les tests de spécificité et de sensibilité des sondes nucléiques sont d'abord réalisés avec ces échantillons d'ADN de référence.

1-2-2. Echantillons de terrain

1-2-2-1 Couche de globules blancs du sang des bovins (Buffy Coat)

Sur le terrain, des prélèvements de sang sont effectués chez les animaux suspectés de trypanosomose. Un animal est suspect lorsque son hématocrite est inférieur ou égal à 25 % ou lorsqu'il présente les signes cliniques. Le sang est prélevé dans des tubes à hématocrite héparinés. Après centrifugation différentielle (Murray et al., 1977), le buffy coat est collecté dans des tubes eppendorf^TM (de 0,5 ml ou 1,5 ml) contenant 30 ul d'eau distillée. Ces tubes portent une étiquette mentionnant le numéro de l'animal et la date du prélèvement. Une fiche indiquant les résultats de la parasitologie accompagne également ces échantillons.

1-2-2-2. Organes de mouches

Les mouches sont capturées dans les zones infestées de glossines, à l'aide de pièges monoconiques ou biconiques. Au laboratoire, ces mouches sont disséquées sous loupe binoculaire pour la récolte des organes qui sont le proboscis, les glandes salivaires et l'intestin moyen. Ces organes sont introduits dans des tubes eppendorf^TM contenant 30 ul d'eau distillée pour les proboscis et les glandes salivaires et 50 ul pour les intestins moyens. Ces tubes sont bien étiquetés avec mention de la date, d'un numéro et du nom de l'organe.

Au total, 425 échantillons de terrain, dont 311 buffy coats de bovins et 114 organes de mouches (71 proboscis, 11 glandes salivaires et 32 intestins moyens) ont été analysés en PCR classique et en PCR directe amplifiant les espaceurs internes transcrits de l'ADNr. La mise au point de la PCR ELISA a été faite avec d'une part des échantillons d'ADN de référence et d'autre part avec des échantillons de terrain positifs à la PCR utilisant le couple d'amorces Tryp 4R et Tryp 4S.

1-2-2-3. Fragment cible : les ITS des trypanosomes

Dans la PCR multispécifique, les segments à amplifier sont les espaceurs internes transcrits (Internal Transcribed Spacer : ITS) de l'ADN ribosomal (ADNr) des trypanosomes. L'ADN ribosomal est une séquence d'ADN codant pour l'ARN ribosomal (qui représente 80 % de l'ARN) et les segments de l'ADN séparant les différents gènes d'ADN ribosomaux. C'est généralement un locus étendu et complexe composé d'un grand nombre d'unités de répétition séparées l'une de l'autre par un espaceur interne transcrit. Chez les Kinetoplastidae en général et en particulier chez les trypanosomes, l'unité de transcription de l'ADNr est composée à gauche des gènes 18S et à droite des gènes 28S avec au milieu l'ITS1 et l'ITS2 séparés par le gène 5.8S (absent chez les procaryotes) .

Figure 13 : Schéma d'une unité de transcription de l'ADNr

La particularité de cette portion du génome tient à la haute conservation des gènes 18S et 5.8S parmi les Kinetoplastidae et à la stabilité intra spécifique de l'ITS1. Les ITS sont alors des régions transcrites non codantes séparant les composantes individuelles des unités d'ADN ribosomaux. Ils sont spécifiques d'une espèce de trypanosome et présentent une forte variabilité interspécifique. A partir d'un unique couple d'amorces, les ITS1 seront amplifiés et la taille des produits obtenus permettra de distinguer les différentes espèces de trypanosomes (fig. 14) (Desquesnes et al., 2001).

Figure 14 : Schémas des ITS1 des principaux trypanosomes pathogènes

1-3. Réactifs et solutions de travail

1-3-1. Pour la PCR directe

1-3-1-1. Nucléotides (dNTP)

Ce sont les quatre désoxynucléotides triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Ils sont en large excès molaire dans le mélange réactionnel ou <<master mix>>. Ils sont disponibles de manière individuelle à une concentration de 200 uM. La reconstitution des dNTP pour avoir la solution de travail, se fait en prenant 90 ul d'eau distillée auxquels on ajoute 2,5 ul de chacun des 4 nucléotides.

1-3-1-2. Oligonucléotides (amorces)

Certaines indications président au choix du couple d'amorces pour la réaction PCR. Ainsi, les amorces doivent être rigoureusement spécifiques à la séquence d'ADN encadrant la région cible à amplifier. Les amorces ne doivent ni s'hybrider entre elles, ni s'autohybrider, d'où l'importance de la vérification des amorces pour leur complémentarité. La longueur d'une amorce doit être comprise entre 18 et 30 nucléotides et la composition en bases GC entre 45 et 60 %. Les amorces composant un couple doivent avoir des températures de fusion (Tm) voisines ou égales et leur taille doit être égale ou voisine avec à peu près le même pourcentage GC.

Pour la PCR monospécifique, des amorces ont été dessinées (Masiga et al., 1992) pour les principales espèces de trypanosomes pathogènes du bétail. Nous avons utilisé lors de nos travaux les couples d'amorces inscrits au tableau de l'annexe 2.

L'amplification des ITS des trypanosomes par PCR, est faite à l'aide du couple d'amorces Tryp 4R (Reverse) et Tryp 4S (Sens) (Annexe 3). Ces amorces présentent les caractéristiques de s'hybrider avec une homologie de 100% à l'ADN des trypanosomes pathogènes du bétail (Desquesnes et al. 2001).

Les séquences des amorces choisies sont envoyées à un laboratoire (Eurogentec) chargé de les synthétiser. Elles sont livrées sous forme lyophilisée avec des références comme la Tm, la quantité, le nombre de moles, la densité optique (DO). Ces amorces sont reconstituées pour avoir une solution de stock (à 500 uM), à partir de laquelle on réalise une dilution avec du Tris EDTA pour obtenir une solution de travail à 200 uM.

1-3-1-3. Tampon de la PCR

Le tampon habituellement utilisé est une solution commerciale (PCR Buffer, Quiagen®) composée de Tris à 10 mM, 1,5 mM de MgCl₂ et 50 mM de KCl. Il constitue le 1/10^e du volume individuel final pour chaque réaction.

Le Tris sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l'activité de la Taq polymérase. L'ion Mg²⁺ est un cofacteur essentiel de la Taq polymérase. Ce cation bivalent interagit également avec les charges négatives de la chaîne d'ADN, limitant ainsi les forces de répulsion entre brin d'ADN et favorisant donc la stabilité de l'hybridation. Plus la concentration en MgCl₂ est importante, plus l'hybridation est facilitée que celle ci soit spécifique ou non. Une trop forte concentration peut alors conduire à une augmentation des signaux non spécifiques. Enfin les ions K⁺ sont également des cations monovalents capables d'interagir avec les liaisons hydrogène de l'ADN. Cette interaction va « piéger » les liaisons H₂ faibles présentes dans les zones de mésappariements et ainsi défavoriser les hybridations non spécifiques.

1-3-1-4. Taq polymérase

On utilisait autrefois le fragment Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli pour la réaction PCR. Mais cette enzyme présente un inconvénient majeur du fait qu'on doit la renouveler à chaque cycle d'amplification (l'enzyme étant détruite à haute température lors de la dénaturation). De nos jours, on utilise la Taq polymérase qui est une enzyme provenant d'une bactérie thermophile : Thermus aquaticus. La Taq polymérase présente en effet l'avantage de faire plusieurs cycles d'amplification à la fois. Le tampon et la Taq polymérase (à 5 U/ ul) proviennent du même fournisseur qui est Quiagen®.

1-3-1-5. Diméthylsulfoxyde (DMSO)

Le DMSO aide à dépelotonner l'ADN et à le rendre ainsi plus accessible aux amorces. Il n'est pas utilisé dans le protocole d'amplification des ADN satellites des trypanosomes. Par contre le DMSO à 5% s'avère nécessaire au protocole de PCR sur les ITS des trypanosomes. D'après des comparaisons faites entre le protocole ITS avec le DMSO et celui dépourvu de ce dernier et sans modifier les autres paramètres, il en ressort que les meilleurs résultats avec une sensibilité plus élevée ont été obtenus avec le protocole pourvu du DMSO à 5% du volume du mélange réactionnel (Guèye, 2003).

1-3-2. Pour la révélation par ELISA

1-3-2-1. dNTP et Digoxigénine

Pour la PCR-ELISA, les dNTP sont marqués avec de la digoxigénine, sous forme de Digoxigénine-11-2' desoxyuridine-5' Triphosphate (DIG-dUTP) qui est incorporé aux dNTP. Il s'agit d'un mélange de dNTP connu sous le nom de DIG-labeling mix, qui contient le dATP, le dCTP, le dGTP à une molarité de 2 mM ; le dTTP mélangé au DIG-dUTP avec respectivement 1,9 mM et 0,1mM. Ces dNTP sont dilués dans un tampon identique à celui de la PCR classique.

1-3-2-2. Anticorps anti-digoxigénine conjugués à la peroxydase

(Anti-Dig-Pod)

La détection des produits PCR contenant les dNTP marqués à la digoxigénine se fait à l'aide des anticorps anti-digoxigénine conjugués à la peroxydase connus sous l'appellation d'anti-DIG-POD. La révélation de cette réaction digoxigénine-anti-DIG-POD se fait par l'ajout d'un substrat chromogène [ABTS® ou TMB substrate péroxydase + Péroxidase Solution B (H₂O₂)], qui donne une coloration verte pour un échantillon positif.

Ces anticorps sous forme lyophilisée sont d'abord reconstitués dans 250ul d'eau distillée dans un tube. Cette solution, sans être agitée, est laissée à la température ambiante pendant 15 minutes, puis diluée au 1/100^e avec le tampon de dilution du conjugué.

1-3-2-3. Sondes marquées à la biotine et solution d'hybridation

Pour la mise au point de la PCR-ELISA, des sondes ont été dessinées à partir des ITS des principaux trypanosomes pathogènes du bétail (T. vivax, T. congolense type savane, T. congolense type forêt, et T. brucei). Des travaux antérieurs sur la recherche des sondes ont été réalisés au CIRDES. Le support de travail pour dessiner les sondes est le logiciel bioinformatique (DNAsis) correspondant à l'alignement (en utilisant le BLAST^1(*)) des échantillons d'une espèce et de la séquence disponible dans la banque de donnée Genbank. Comme pour les amorces, plusieurs conditions sont à respecter lors du choix des sondes :

d'abord le dessin des sondes doit se faire à l'intérieur des zones intra taxon ;

la sonde ne doit pas s'autohybrider, c'est à dire que les trois bases à l'extrémité 3' ne doivent pas s'hybrider sur une autre partie de la sonde ;

les bases extrêmes ne doivent pas être complémentaires, en raison d'un appariement possible ;

les ITS étant des séquences polymorphes, on y trouve de nombreux microsatellites (par exemple CACACA) et des séquences répétées (comme CCCCC), lors de l'élaboration des sondes, ces zones sont à éviter à cause de leur capacité d'hybridation non spécifique. Autrement dit, la différence d'une séquence à l'autre, peut être d'une répétition et cela engendre une mauvaise hybridation ;

le pourcentage GC^1(*) doit être supérieur à 60 %, afin d'assurer une hybridation plus stable ;

l'homologie entre la sonde spécifique d'une espèce et les ITS des autres espèces doit être inférieure à 80 % ;

la taille des sondes doit être comprise entre 20 et 30 bases.

enfin, un dernier contrôle qui consiste à l'alignement des 7 bases en position 3' de la sonde d'une espèce donnée avec les différents ITS d'autres espèces a été réalisé à l'aide toujours du logiciel DNAsis. Les sondes présentant un alignement incomplet ou présentant un alignement total mais dont l'homologie ne se prolonge pas, sont retenues candidates pour le test ELISA.

Ainsi, pour les 4 espèces de trypanosomes pathogènes, 3 sondes par espèce ont été choisies, il s'agit des sondes STV1, STV2, STV3 pour T. vivax ; STCS1, STCS2, STCS3 pour T. congolense type savane ; STCF1, STCF2, STCF3 pour T. congolense type forêt ; et STB1, STB2, STB3 pour T. brucei (Annexe 4). Ces sondes marquées à la biotine en position 5' ont été synthétisées par la société PROLIGO Primers & Probes.

La solution d'hybridation pour une sonde donnée se prépare à partir du tampon d'hybridation et de la sonde marquée à la biotine à une concentration de 7,5 pmol / ml. Le tampon d'hybridation utilisé (Masaké et al., 2002) est composé de : 6 x SSPE (Saline Sodium Phosphate-EDTA) avec 0,9 M Nacl, 60 mM NaH₂PO₄.H₂O, 6 mM EDTA ; 5 x Denhardt'solution (1 g / l de chacun des produits suivants : ficoll, polyvinyle pyrolidone et sérum d'albumine bovin ); 0,1% de N-Lauroyl sarcosine (Sodium sarcosine) ; 0,02% de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).

1-3-2-4. Streptavidine

La streptavidine est une protéine de poids moléculaire d'environ 60000 Kd, isolée à partir d'une bactérie appelée Streptomyces avidini. Elle a une haute affinité pour la biotine. C'est cette interaction streptavidine / biotine qui est mise à profit pour la fixation des produits PCR dans les plaques ELISA.

1-3-2-5. Solution de lavage et tampon de blocage

La solution de lavage est composée d'un tampon PBS avec 1 ml de Tween-20 par litre de tampon. Le tampon de blocage est aussi composé de PBS-Tween-20 à 0,5 % et du BSA à 0,2 %. Le pH des tampons doit être vérifié et corrigé au besoin avant leur utilisation.

* ¹ Le Basic Local Alignement Search Tool (BLAST) est accessible sur le site Web : http://www.nbci.nlm.nih.gov

* ¹ Le pourcentage GC est calculé à l'aide du logiciel « Freqsq » sur Infobiogen.