Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale

2. Plan d'échantillonnage

Nous avons échantillonné six arbres-mères et leurs plantules le long du gradi ent de salinité en période pluvieuse (janvier et février 2009). Les arbres-mères ont été inventoriés et cartographiés sur le transect (Figure 7 ). Dix plantules, à peu près du même %oge avec deux cotylédons plus une feuille (Figure 6), ont été échantillonnées sous le houppier de chaque arbre-mère, à une distance de 1 m autour du tronc. Dix carottages de sol (15 cm de diamètre et 20 cm de profondeur) ont été également réalisés autour du tronc pour échantillonner des racines de chaque arbre-mère. Les échantillons ont été ensachés séparément, transportés et conservés au réfrigérateur à 4°C en laboratoire.

Parallèlement, des récoltes de sporophores ont été réalisées sous le houppier des arbres- adultes une fois par semaine pendant 7 mois (aoüt 2008 à février 2009) le long du transect. Les sporophores ont été décrits, photographiés, séchés, identifiés, dénombrés au laboratoire et mis en herbier à l'Université de Lille (Laboratoire du Pr. Régis Courtecuisse).

3. Morphotypage, fréquence et conservation des ECM

En laboratoire, le système racinaire de chaque plantule a été soigneusement débarrassé de sa motte de terre à l'eau courante. Les racines latérales ont été séparées du pivot et observées dans de l'eau courante sous la loupe binoculaire et au microscope optique. Les ECM ou morphotypes (MT) ectomycorhiziens ont été différenciées par des caractères macroscopiques et microscopiques: texture et couleur du manteau fongique, présence d'anses d'anastomoses, de cordons mycéliens et de sclérotes. Les nombres d'apex mycorhizés et non mycorhizés ont été comptés sur les racines. On a déduit un pourcentage de mycorhization (nombre de racines mycorhizées/nombre total de racines observées x 100) pour chaque morphotype.

Les racines des arbres -mères ont été soigneusement séparées du sol à l'eau courante, et observées dans les mêmes conditions que pour les plantules.

Les MT et des morceaux de sporophores ont été conservés dans du CTAB (bromure d'hexadécyltriméthylammonium) (cf. annexe) pour les études moléculaires. Les morphotypes ectomycorhiziens ont été étiquetés P pour Plantule et AM pour Arbre-Mère. Les morceaux de sporophores ont été étiquetés C pour Carpophore.

4. Extraction de l'ADN

L'ADN total a été extrait des ECM ou d'un sporophore à l'aide du kit de purification d'ADN Dneasy de QIAGEN dans les conditions décrites par le fournisseur. L'extraction a été réalisée à partir d'une ECM ou d'un morceau de sporophore. L'extraction comprend plusieurs étapes:

- Prérégler une étuve à 65°C, y mettre les 2 flacons de solution d'élution AE;

- Broyer les échantillons à sec avec une pincée de sable de Fontainebleau à l'aide d'un piston en plastique dans un tube à microcentrifuger (2 ml);

- Ajouter 400ul de tampon de lyse (AP1) et 4 ul de RNase (100 mg/ml), broyer et vortexer vigoureusement (pour éliminer éventuellement la masse de tissu et avoir une suspension liquide) ;

- Incuber 10 min à 65°C puis faire 2 à 3 inversions des tubes. C'est l'étape de la lyse des cellules;

- Ajouter 130 ul de tampon de déprotéinisation (AP2), vortexer et incuber 5min dans la glace. C'est l'étape de la précipitation des solvants, des protéines et des polysaccharides;

- Centrifuger 5 min à 14000 rpm;

- Transférer le surnageant dans une colonne de filtration QIAshredder et centrifuger 2 min à 1400 0 rpm;

- Transférer soigneusement le filtrat dans un nouveau tube eppendorf de 1,5 ml sans le culot. Noter le volume de filtrat;

- Ajouter 0,5 volume de tampon AP3 et 1 volume d'éthanol absolu. Mélanger en pipettant ; - Déposer 650 ul de mélange dans une colonne Dneasy ;

- Centrifuger 1min à 8000 rpm. Jeter le filtrat et répéter avec ce qui reste de mélange; - Placer la colonne Dneasy dans un nouveau tube;

- Ajouter 500 ul de tampon de lavage (AW), centrifuger 1min à 8000 rpm et jeter le filtrat;

- Ajouter à nouveau 500 ul de tampon de lavage (AW), centrifuger 2 min à 14000 rpm et jeter le filtrat;

- Centrifuger 30 sec à 14000 rpm la colonne à vide disposé dans un nouveau tube pour bien sécher la membrane et jeter le filtrat+tube. La colonne doit être bien sèche avant de procéder à l'élution de l'ADN;

- Transférer la colonne Dneasy dans un tube eppendorf de 1,5 ml;

- Ajouter 50 ul de Tampon AE préchauffé à 65°C dans la colonne. Déposer le tampon au milieu de la colonne;

- Laisser incuber le tampon AE pendant 5 min à température ambiante;

- Centrifuger 1min à 8000 rpm;

- Répéter une fois les étapes 17, 18 et 19 dans un nouveau eppendorf (Ne pas faire pour les ECM); - Mélanger ou non les 2 filtrats;

- Conserver l'ADN à -20°C.

5. Amplification de l'ITS par la réaction de polymérase en cha»ne

Le protocole utilisé pour l'amplification de l'ITS est celui du kit PCR Master Mix PROMEGA recommandé par le fournisseur. Pour chacun des échantillons, le volume réactionnel final est de 25 ul et comprend 9,5 ul de Nuclease-Free water, 12,5 ul de PCR master Mix (cf. annexe), 1 ul de chaque amorce ITS1 (5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3') et ITS4 (5'- TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'), et 1 ul d'extrait d'ADN.

La réaction PCR a été effectuée dans une mini thermocycleur Applied Biosystems (GeneAmp PCR system 2700, version 2.07) dans les conditions suivantes: 95°C pendant 5 min (étape de dénaturation), 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30s, 55°C pendant 30s (étape de l'hybridation), 72°C pendant 1min 30s (étape de polymérisation), et 72°C pendant 7 min (polymérisation finale). Chaque série d'amplification comprend un témoin négatif sans ADN fongique afin de détecter d'éventuels contaminants dans les tampons et réactifs.

Ë la fin de la réaction, 5 ul d'amplifiat addi tionnés à 6 ul d'un tampon de charge ont été déposés sur un gel horizontal d'agarose à 2% contenant 2 gouttes de bromure d'éthidium (BET) (0,625 mg/ml). Cinq ul de marqueur de taille moléculaire 1Kb ÇSmart LadderÈ ont été déposés dans un puit. La migration s'effectue dans une cuve d'électrophorèse Max Fill (Modèle HU10, Made in UK) contenant du tampon TAE 1x (cf. annexe) sous une tension de 90 volts pendant 1h 30 min.

Le bromure d'éthydium en s'intercalant entre les bases de l'ADN permet de visualiser l'ADN sous une lampe à UV d'une station d'imagerie (ChemiDoc BIO-RAD Laboratories, Segrate, Milan). Des photos numériques ont été prises au moyen de la caméra optique reliée à un ordinateur muni du logiciel Quantity One de BIO-RAD.

6. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l'ITS

L'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) s'effectue à partir des produits purifiés obtenus après amplification par PCR. Elle consiste en une digestion des amplifiats par des enzymes de restriction pour obtenir des profils électrophorétiques.

Pour un volume réactionnel de 20 ul, 15 ul d'amplifiat sont additionnés à 0,5 ul d'enzyme (HinfI), 2 ul d'un tampon 10 X et 2,5 ul d'eau ultrapure dans des tubes eppendorf de 1,5 ml. Le mélange réactionnel a été mis à incuber à 37° C pendant 2 h.

La totalité de la digestion, additionnée à 3 ul de bleu de charge, est déposée dans un puit d'un gel horizontal d'agarose de 3% contenant 2 gouttes de bromure d'éthidium. Un mélange d'un ul de marqueur de taille (100 pb DNA ladder PROMEGA, Madison, USA) et d'un ul de bleu PROMEGA a été déposé dans un puit. La migration des fragments de restriction dans le gel s'effectue sous une intensité de 35 mA et sous une tension de 90 volts pendant 1 heure dans une

cuve d'électrophorèse contenant du tampon TAE 1X. Après migration, les gels sont visualisés et photographiés dans les mêmes conditions que précédemment.

On a déterminé la fréquence des profils de restriction ou ribotypes (nombre de ribotypes/nombre total de ribotypes observés x 100).

7. Séquençage de l'ITS

Le séquençage de l'ITS d'un représentant de chaque ribotype a été réalisé au LSTM- UMR 1 1 3 à Montpellier.

Les séquences brutes que nous avons reçues de Montpellier ont été traitées avec le logiciel Sequence Navigator. Les électrophorégrammes des séquences <<reverse>> et des séquences << front>> ont été corrigés. Les séquences (front et reverse) ont été ensuite alignées avec le logiciel Autoassembler pour obtenir des séquences consensus. Un Blast a été effectué sur le web pour comparer les séquences obtenues avec des séquences de référence présentes sur NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). On a pu ainsi identifier la composante fongique des ECM au niveau de la famille voire du genre.

Des séquences de champignons connus provenant de la base de données de GenBank sont choisies comme séquences de référence pour la construction des relations phylogénétiques. Ces séquences de référence associées aux séquences obtenues sont alignées en utilisant le logiciel ClustalX ver.2.0.10 (Thompson et al. 1997), puis l'alignement est optimisé manuellement avec le logiciel GeneDoc (Nicholas et al. 1997). L'arbre est construit par la méthode du Neighor-Joining en utilisant le logiciel de ClustalX ver.2.0.10, et l'analyse de confiance des <<bootstrap>> est réalisée avec 100 réplications (Felsenstein, 1985). Deux séquences (Sebacina incrustans et Sebacina epigaea) sont utilisées comme << outgroup >> pour enraciner l'arbre.

8. Analyse statistique

Les données ont été transformées avec la fonction Arcsin vx et traitées par la procédure de l'analyse de variance à un facteur. Les moyennes ont été comparées à l'aide du test de Fisher-LSD (p<0,05) (Gagnon et al., 1989).

RÉSULTATS ET DISCUSSION