Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale

2.2. Diversité des ECM

L'inventaire des ECM est une approche qui permet aussi d'accéder à la composition des communautés fongiques (Agerer, 1991). Basée uniquement sur des caractères morphologiques, anatomiques et histologiques, l'identification des ECM reste très aléatoire. En effet, la couleur du manteau peut changer en fonction de l'âge de la plante hôte ou de l'environnement (Thoen & Bâ, 1989; Wurzburger et al., 2001 ; Diédhiou et al., 2004). Les clés d'identification des ECM

proposées jusqu'ici se sont avérées dans l'ensemble insuffisantes pour identifier un champignon à partir d'une ECM à l'exception des ECM typiques du genre Cenococcum (Agerer, 1991).

Les caractères macroscopiques et microscopiques des ECM s'avèrent peu concluants pour remonter aux sporophores. De plus, un champignon peut former des ECM dont la morphologie change selon l'hôte ou quelquefois en fonction de l'âge de l'hôte. Des champignons différents peuvent former des ECM morphologiquement similaires. Tout compte fait, l'abondance des sporophores renseigne peu sur la fréquence des ECM. Des champignons comme Suillus fructifient abondamment et forment peu d'ECM. Ë l'inverse, Thelephora forment jusqu'à 40 % des ECM en fructifiant peu ou pas (Diédhiou et al., 2009).

Il est rarement possible d'observer des connexions entre le mycélium à la base du pied des sporophores et celui des ECM (Thoen & Bâ, 1989; Rivière et al., 2007). On suppose, souvent à juste raison, que les sporophores, fructifiant au voisinage des arbres, sont potentiellement ectomycorhiziens. Encore faut-il établir un lien formel entre sporophores et ECM car on peut aussi trouver des champignons parasites ou saprophytes à proximité des arbres à ECM. C'est le cas de quelques russules saprophytes facultatives ou parasites (p.ex. Russula parasitica) en Afrique tropicale (Buyck et al., 1996). Pourtant, le genre Russula est souvent ectomycorhizien. L'obstacle principal est l'identification de la composante fongique des ECM, qui peut être surmonté par des méthodes d'écologie moléculaire (p.ex. amplification et séquençage de l'ADNr).

2.3. Caractérisation moléculaire de la diversité fongique

Différentes techniques de biologie moléculaire (p.ex. PCR-RFLP, séquençage), basées sur l'analyse de l'ADNr, ont été développées ces dernières années pour étudier la diversité génétique des sporophores, identifier la composante fongique des ectomycorhizes et suivre la persistance des souches fongiques introduites en pépinière et en plantation (Gardes et al., 1991; Martin et al., 1991 ; Selosse et al., 1999; Diédhiou et al., 2004; Rivière et al., 2007; Sanon et al., 2009). La technique PCR est utilisée pour amplifier différentes parties du génome en ayant pour cibles l'ADN total, l'ADNr nucléaire ou l'ADNr mitochondrial. L'ADN total est analysé par des techniques comme l'AFLP (Ç Amplified Fragment Length Polymorphism È), l'ISSR (Ç Inter Simple Sequence Repeat È), la RAPD (Ç Random Amplified Polymorphism DNA È) ou les microsatellites pour accéder au polymorphisme de larges portions d'ADN (Jacobson et al., 1993 ; Redecker et al., 2001 ; Zhou et al., 2001). L'ADNr mitochondrial possède des entités qui sont en plusieurs copies indépendantes du génome nucléaire et utilisées pour des études sur la structuration des

communautés de champignons. Le gène de la grande sous-unité de l'ARNr mitochondrial (<< mtLSU rRNA È) en particulier le fragment d'environ 450 pb amplifié par les amorces ML5/ML6, est souvent utilisé en phylogénie des champignons ectomycorhiziens (Bruns et al., 1998 ; Stendell et al., 1999 ; Rivière et al., 2007). Bien que cette région soit peu évolutive au niveau de l'espèce, elle permet néanmoins de différencier sans ambigu
·té les familles voire les genres (p.ex. Russula, Amanita, Cantharellus, Thelephora, Tricholoma). De plus, il existe sur cette région une base de données de plus d'une centaine de séquences référencées dans NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). L'ADNr nucléaire existe en plusieurs copies (50 à 100 copies par cellule) et se trouve donc déjà préamplifié dans les extraits d'ADN. Il comprend des régions codantes pour les ARNr (18S, 5.8S, 25S et 5S) très conservées au niveau spécifique et des espaceurs intergéniques, soit transcrit (ITS, <<Internal Transcribed Spacer È), soit non transcrit (IGS, <<Intergenic Spacer È), moins conservés évolutivement. L'espaceur transcrit ITS (ITS1 et ITS2) conjointement amplifié avec le gène 5.8S, est un bon marqueur spécifique, mais très rarement au sein de l'espèce. L'espaceur ITS, d'environ 600 à 1000 pb, est amplifié par des amorces universelles (ITS1/ITS4), spécifiques aux champignons (p.ex. ITS1f/ITS4) ou spécifiques au Basidiomycota (p.ex. ITS1f/ITS4b) (White et al., 1990; Gardes et al., 1991). L'amplification de l'ITS est souvent couplée à l'étude du polymorphisme de longueurs des fragments de restriction (RFLP) et son utilisation en identification repose sur le séquençage nucléotidique. Il existe une importante base de données sur les séquences des ITS des champignons dans NCBI et UNITE ( http://unite.ut.ee/). Actuellement, la plupart des études d'écologie et de taxonomie moléculaires sur les champignons ectomycorhiziens sont basées sur l'analyse des régions ITS (Tedersoo et al., 2007 ; Sanon et al., 2009).

Figure 2. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité répétée de l'ADN ribosomique chez les champignons. Les flèches représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées en écologie moléculaire des champignons (Tedersoo et al., 2007).