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Etude phytochimique et activités biologiques des extraits et des huiles essentielles de Foeniculum vulgare Mill.

1. Analyse de l'activité antiradicalaire de l'huile essentielle des graines de F.vulgare

III. Etude de l'activité antioxydante des huiles essentielles et des extraits aqueux des

Figure 7: Les monolignols dérivés des acides hydroxycinnamiques et leur intégration dans la

Figure 13: chromatographe en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme (GC-

FID) 26
Figure 14: Couplage chromatographe en phase gazeuse! Spectrométrie de masse (CG ! SM)

Figure 17: Rendements moyens en huiles essentielles des graines de F.vulgare Mill. de

différentes provenances. 33
Figure 18: Rendements moyens en extraits des graines de F.vulgare Mill. de différentes

provenances 34
Figure 19: Teneurs en polyphénols totaux des extraits aqueux et des huiles essentielles des

graines de Foeniculum vulgare Mill. 37
Figure 20: Teneurs en flavonoïdes des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare

Mill. 39
Figure 21: Teneurs en tanins condensés des extraits aqueux des graines de Foeniculum

vulgare Mill. 40
Figure 22: Variation du pourcentage d'inhibition du radical libre en fonction de la

Table 1: Les principales classes des composées phénoliques (Macheix et al., 2005) 10

Table 2: Composition chimiques des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare

Mill des différentes provenances 35
Table 3: Activité antiradicalaire (CI50 en ìg.ml-1) des extraits et des huiles essentielles des

Mes sincères remerciements s'adressent à mes encadreurs Monsieur Ali FERCHICHI et Monsieur Abdelhamid KHALDI. Je vous remercie pour l'aide que vous m'avez accordée dans l'accomplissement de ce travail. Vous m'avez patiemment guidée en faisant prévoir beaucoup de gentillesse. Que vous trouvez dans ce travail l'expression de mon profond respect et ma haute reconnaissance.

J'exprime ma profonde reconnaissance à Madame Marwa KHAMMASSI pour son aide, sa directive, sa gentillesse et ses encouragements pour la réalisation de ce projet. Ses conseils ont permis à ce travail d'aboutir. Ses capacités scientifiques et ses compétences étaient mon grand support.

Je tiens à exprimer ma gratitude et mes remerciements aux membres de jury pour avoir porté un intérêt à mon travail en acceptant de le juger.

J'exprime mes plus vifs remerciements envers tous les professeurs qui m'ont apporté du soutien durant mes études.

Je remercie également tous le personnel de l'INRGREF et à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce projet.

Résumé

Foeniculum vulgare Mill. est une espèce aromatique et médicinale dotée d'activités biologiques intéressantes. Dans ce travail, une évaluation de la capacité antioxydante de cette espèce collectée de huit régions de la Tunisie, a été effectuée. Les principaux résultats ont montré que les extraits aqueux et les huiles essentielles de cette espèce possèdent des teneurs relativement appréciables en composés phénoliques. L'analyse de la composition chimique des huiles essentielles des différentes populations a montré que le methylchavicol est le composé majoritaire. L'évaluation de l'activité antiradicalaire des huiles essentielles et des extraits des graines de F. vulgarea été évaluée par la méthode de DPPH. Les résultats ont montré que l'huile essentielle des graines de Teborsek riche en polyphénols totaux est dotée d'activité antiradicalaire importante (CI50 =6,12 ìg.ml^-1).

Mots-clés : Foeniculum.vulgare Mill, huile essentielle, extrait aqueux, composés phénoliques, activité antioxydante.

Abstract

Foeniculum vulgare Mill. is an aromatic and medicinal species with interesting biological activities. In this work, the evaluation of the antioxidant capacity of this specie collected in eight regions of the Tunisia was been made. The main results showed that aqueous extracts and essential oils of this species have relatively significant levels of phenolic compounds. The analysis of the chemical composition of the essential oils of different populations showed that the methyl chavicol is the majority compound. The evaluation of the scavenging activity of essential oils and extracts of the seeds of F.vulgare was been evaluated by the DPPH. method. The results showed that the essential oil from the seeds of Teborsek rich of total polyphenol has important scavenging activity (IC50 = 6.12g.ml-1).

Keywords: Foeniculum vulgare Mill, essential oil, extracted aqueous, phenolic compounds, antioxidant activity.

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Introduction

Les plantes aromatiques et médicinales connues par leurs propriétés biologiques intéressantes sont utilisées dans divers domaines à savoir en médecine, en pharmacie, en cosmétologie et en agriculture.

Les activités biologiques des plantes aromatiques et médicinales sont connues depuis l'antiquité. Toutefois, il aura fallu attendre le début du 20ème siècle pour que les scientifiques commencent à s'y intéresser. Ces propriétés sont dues essentiellement à la fraction d'huile essentielle et aux composés phénoliques contenues dans les plantes.

Il existe aujourd'hui approximativement 3000 huiles, dont environ 300 sont réellement commercialisées, destinées principalement à l'industrie des arômes et des parfums.

Les huiles essentielles ont suscité beaucoup d'intérêt scientifique dû au fait qu'elles présentent une source d'antioxydants naturels et de molécules biologiquement actives. L'activité antioxydante des extraits de plantes a constitué la base de nombreuses applications incluant les procédés de conservation des aliments et les thérapies naturelles. En effet, plusieurs huiles essentielles extraites à partir de Sauge et de Gingembre ont montré un bon pouvoir antioxydant et d'excellentes capacités à inhiber les réactions oxydatives.

Pour ces raisons, l'étude des activités biologiques des substances issues des plantes en vue de leurs applications à la santé humaine demeure une tâche intéressante et utile.

Dans ce contexte, ce travail a pour objectif l'étude des huiles essentielles et des extraits d'une plante aromatique et médicinale collectées de différentes régions de la Tunisie : Foeniculum vulgare Mill. et l'évaluation de leur pouvoir antioxydant.

Notre travail sera donc répartit en trois chapitres, initié par une recherche bibliographique sur les huiles essentielles, les composés phénoliques, l'activité antioxydante et l'espèce Foeniculum vulgare Mill.

Dans le deuxième chapitre, nous allons décrire la méthode d'extraction et d'identification des huiles essentielles et des extraits aqueux ainsi que les protocoles expérimentaux préconisés pour évaluer leurs activités antioxydantes.

Dans le troisième chapitre, nous annoncerons les résultats obtenus ainsi que leurs discussions. Nous terminerons par une conclusion résumant les résultats de l'étude effectuée.

Chapitre 1.

I. Les plantes aromatiques et médicinales

Les plantes médicinales sont soumises à une réglementation et un enregistrement en tant que phytomédicament qui englobe, les matières végétales, les plantes, les préparations et les produits finis à base de plantes.

Parmi les exigences utilisées dans les systèmes de réglementation internationaux, on peut citer la description dans une monographie de pharmacopée avec la dénomination internationale, l'état de prescription, la revendication d'un effet thérapeutique, les ingrédients ou les substances prévues ou réglementés et les périodes d'utilisation (Dutertre, 2011).

Différentes espèces médicinales sont utilisées comme épices pour aromatiser et augmenter la durée de vie des aliments. En effet, ces espèces contiennent des huiles essentielles dotées d'activités antimicrobiennes intéressantes et peuvent servir d'agents de conservation alimentaires (Mohammadi, 2006).

Les plantes aromatiques sont utilisées dans la formulation des produits de beauté. Les huiles essentielles de la lavande (Lavandula officinalis) sont utilisées dans les préparations pour bains calmants ou relaxants (Bruneton, 1993).

Certaines plantes sont utilisées pour le traitement des troubles nerveux et des troubles liés au stress telles que Angélica archangélica et Valérian aofficialis (Messkgue, 1975 ; Iserin, 1997 ; Legrand, 1994).

D'autres, telles que l'Aunée officinale (Inula helenium), Origan (OriganumVulgare) et l'Eucalyptus (Eucalyptus globulus) ont prouvé leur efficacité dans le traitement des problèmes respiratoires et les bronchites (Iserin, 1997 ; Legrand, 1994).

Les plantes aromatiques et médicinales ont une valeur thérapeutique importante et l'intérêt de ces plantes ne cesse de grandir. Exemple : Foeniculum vulgare est utilisée pour la remède des douleurs abdominales et les graines de cette espèce sont utilisées pour la production d'un médicament pour soigner les troubles digestifs (Messkgue, 1975 ; Iserin, 1997).

II. Les huiles essentielles

Le rendement et la composition chimique des huiles essentielles varient d'une espèce à une autre. Cette variabilité peut être liée à des facteurs extrinsèques et intrinsèques.

Les conditions environnementales notamment la température, la lumière, la pluviométrie et les conditions édaphique agissent sur la composition chimique des plantes aromatiques et médicinales (Bruneton, 1999; Mohammad et al., 2009; Olle et Bender, 2010; Aprotosoaie et al.,2010). Les conditions culturales telles que les techniques de récolte, la date de semis, l'emploi d'engrais, les traitements phytosanitaires influencent également la composition et le rendement des huiles essentielles.(Barry, 2001; Lahlou, 2004; Stefanini et al., 2006; Benini, 2007; Aprotosoaie et al., 2010).

Le stade végétatif (Aprotosoaie et al., 2010) ,l'organe de la plante (Chowdhury et al., 2009), la mutation, l'hybridation, la polyploïdie (Aprotosoaie et al., 2010) et les chimiotypes (Belyagoubi, 2006) sont parmi les facteurs intrinsèques qui interviennent dans la variabilité de la composition et le rendement des huiles essentielles.

Les huiles essentielles sont des mélanges complexes de composés volatils qui appartiennent, de façon quasi exclusive, à deux groupes (Duquenois, 1982) :

Le groupe des terpènoïdes est considéré comme étant le groupe le plus important. Il comprend les monoterpènes, les sesquiterpènes et les diterpènes. Les terpènes qui sont les plus volatiles (Piochon, 2008), sont des molécules organiques de formule [C5H8] _n (Figure 4) (Kaloustian et Hadji-Minaglou, 2012). Ces substances lipophiles sont responsables de l'odeur des plantes (Hopkins, 2003).

Le groupe des composés aromatiques renferme les molécules de parfum comme la vanilline, l'eugénol, l'anéthol et l'estragol (Figure 5). Ces composés sont abondantes dans les huiles essentielles des Apiaceae (anis, fenouil, cannelle, basilic) (Hellal, 2011).

Cette méthode est très ancienne. Elle consiste à extraire les parfums à partir des fleurs par contact avec la matière grasse. Les graisses seront encombrées en essence et utilisées comme produit cosmétique sous forme de pommade (Silvant, 2015).

Cette méthode est utilisée en parfumerie. Il s'agit d'extraire l'huile essentielle par un solvant volatile (Silvant, 2015).La matière végétale et le solvant est placés dans un récipient puis chauffés. Le mélange ainsi obtenu est ensuite filtré et mélangé avec l'alcool qui s'évapore après chauffage et il ne reste que l'huile parfumée appelée absolue (Hellal, 2011).

C'est la méthode la plus ancienne, la plus utilisé et la plus rentable qui a été introduite en Europe par les Arabe entre le VIIIème et le Xème siècle (willem, 2004). Il s'agit de mettre le matériel végétal à l'intérieure d'un alambic remplie d'eau et qui est porté ensuite à ébullition (Figure 6). L'huile essentielle se sépare par différence de densité après la condensation des vapeurs hétérogènes sur une surface froide (Bruneton, 2009).

Cette méthode est récente .Elle est basée sur l'utilisation d'un fluide supercritique qui possède les propriétés des gaz et des liquides. Ce qui lui permet de pénétrer dans les matrices d'échantillon solides. Le principe de cette technique correspond à une distillation répétée du solvant extrayant un soluté de l'échantillon solide (Brisset, 2011).

Plusieurs études ont montré que les huiles essentielles sont dotées d'activités biologiques intéressantes.

Les huiles essentielles possèdent des propriétés antimicrobiennes intéressantes et luttent contre les maladies infectieuses d'origine bactérienne et fongique (De Billerbeck, 2007).L'activité antifongique des huiles essentielles peut être due à la présence des terpènes qui causent la rupture des membranes fongiques et inhibent le développement des champignons.

Les huiles essentielles permettent également la protection contre les champignons phytopathogènes et les microorganismes envahissant les denrées alimentaires (Zambonelli et al., 2004 ; Mangena et Muyima, 1999).

L'activité antioxydante des huiles essentielles est attribuée à certains alcools, éthers, cétones et aldéhydes monoterpéniques tels que le linalool, le 1,8-cinéoIe, le géranial,

le néral, le citronellal, l'isomenthone, la menthone et quelques monoterpènes comme l'á-terpinène et le ã-terpinène (Edris, 2003).

Les huiles essentielles riches en phénols ont montré une activité antivirale contre certains virus notamment l'Herpes simplex (Girard, 2010).

Les huiles essentielles possèdent une action sédative et agissent sur le système nerveux central en stimulant ou en inhibant le système sympathique ou parasympathique. Elles permettent ainsi la régulation de système nerveux périphérique. (Girard, 2010).

Les huiles essentielles possèdent également d'autres activités telles que l'activité désodorisante dans la mesure où certaines huiles essentielles peuvent être utilisées pour lutter contre les mauvaises odeurs. De très nombreuses drogues à huile essentielle (Mentha X citrata, Lippiacitriodora,...) sont réputées efficaces pour diminuer ou supprimer les spasmes gastro-intestinaux (Bruneton, 1993).

III. Les composés phénoliques

Les composés phénoliques peuvent être classés selon la complexité, le degré et les liaisons possibles du squelette de base avec d'autres molécules (Tableau 1) (Macheix et al., 2005).

Table 1: Les principales classes des composées phénoliques (Macheix et al., 2005)

? Les formes simples qui présentent des structures chimiques allant de C6 aux C15 : Acides hydroxybenzoiques, Acides hydoxycinnamiques et les flavonoïdes.

? Les formes condensées qui résultent de la condensation de certaines formes simples telles que les tanins et les lignines (Macheix et al., 2005).

Ces acides sont dérivés de l'acide benzoïques (Figure 7).Ils sont fréquents sous formes d'esters méthyliques ou glycosylés chez les gymnospermes et les angiospermes. Ils sont libérés après hydrolyse alcaline de certain molécules en particulier la lignine et certains tanins. (Macheix et al., 2005).

Figure 4: Les acides hydoxybenzoiques (Macheix et al., 2005) ? Les acides hydoxycinnamiques (phénylpropanoides)

C'est une classe très importante qui dérive de l'acide cinnamique (Figure 8). La réactivité de ces acides est liée au degré d'hydroxylation du cycle benzénique et son modification aléatoire par des réactions secondaires. On distingue deux séries isomères grâce à la présence de double liaison : cis (Z) et tans (E). (Macheix et al., 2005)

Les flavonoïdes sont des pigments naturels (Causse, 2005) responsables de la coloration des feuilles, des fleurs et les fruits. Ils sont très répandus chez les végétaux. (Roux et Catier, 2007).Ces pigments sont répartis en plusieurs familles dont les plus importantes sont les flavones et les isoflavones (Figure 9) (Causse, 2005).Ils présentent plus que 9000 structures et ont comme structure de base deux noyaux aromatiques reliés par 3 carbones. (Bruneton, 2009). Plusieurs études ont montré que les flavonoïdes permettent la réduction du taux du cholestérol (Causse, 2005).

Les tanins sont responsables de l'aspect astringent (Macheix et al., 2005).Ils sont combinés aux alcaloïdes et aux protéines dans les différentes organes de la plante. (Fraga et al., 2010). Ces composées qui confèrent des réactions de condensation avec les anthocyanes présentent un pouvoir antiseptique qui gêne le développement de certains microorganismes. On distingue chez les végétaux deux groupes de tanins :

? Les tanins hydrolysables qui sont des polyesters de glucides et d'acides phénoliques (Grundhöfer et al., 2001)

? Les tanins condensés qui sont nommés également tanins catéchiques ou proanthocyanidols. Ils ne sont pas hydrolysables. Leurs structures qui ne présentent pas de sucre se rapprochent de celle des flavonoïdes (Hurabielle et Paris, 1981).

Les lignines se déposent dans la paroi cellulaire (Hamilton Raven et al., 2000). Ils proviennent de la polymérisation de trois molécules phénoliques (Figure 10). Ces composées qui présentent des activités biologiques intéressantes (Macheix et al., 2005) assurent la résistance au compression et la rigidité des parois cellulaires et augmentent ainsi leurs imperméabilités à l'eau (Hamilton Raven et al., 2000).

Figure 7: Les monolignols dérivés des acides hydroxycinnamiques et leur intégration dans la lignine (Macheix et al., 2005)

Ce sont des substances organiques aromatiques caractérisées par une saveur amère et qui se présentent chez les végétaux aux niveaux des différents organes sous forme de cristaux blancs ou jaunâtre (Bruneton, 2009).

Plusieurs industries agroalimentaires utilisent les composés phénoliques naturels comme additifs alimentaires. Les anthocyanes sont utilisés comme colorants alimentaires dans la vinification et les tocophérols sont utilisés dans le maintien de la stabilité des huiles végétales et la prévention des produits alimentaires contre le rancissement causé par les radicaux libres (Macheix et al., 2005).

Des études ont montré que les polyphénols protègent contre les accidents cardiovasculaires et les maladies coronariennes. Ces composés naturels dotés d'activité antioxydante intéressante ont une relation importante avec la prévention des maladies inflammatoires et le traitement du cancer. Leurs efficacités varient en fonction de leurs natures, leurs concentrations, leurs vitesses d'absorption dans l'intestin grêle et de leurs dégradations par la flore intestinale. (Macheix et al., 2005).

Les polyphénols sont des molécules contenants au moins un cycle benzéniques et des groupes hydroxyles. C'est parce que ce groupe hydroxyle se lie aux protéines salivaires que les polyphénols sont astringents.

Les tannins sont responsables de l'astringence de divers fruits (peau et pépins par exemple) et les anthocyanes sont responsables de la couleur des fruits rouges.

IV. Les antioxydants

Les antioxydants sont des molécules capables d'interagir sans danger avec les radicaux libres et de mettre fin à la réaction en chaîne avant que les molécules vitales ne soient endommagées.

? Les antioxydants endogènes : Ils constituent la première ligne de défense contre les radicaux libres. Ces molécules sont, en effet, des protéines enzymatiques et de substances antioxydantes telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la

glutathion peroxydase, les molécules « piégeurs » (l'acide urique, les protéines à groupement thiols, ubiquinone...) (Pincemail et al, 1998).

? Les antioxydants naturels : Ils sont présents dans toutes les parties des plantes supérieures. On peut citer la vitamine E, les caroténoïdes et les composés phénoliques qui peuvent prévenir l'oxydation des lipoprotéines de faible densité (LDL) (Meyer et al., 1997).

? Les antioxydants synthétiques : Le butylhydroxytoluène (BHT) et le butylhydroxyanisole (BHA), sont des antioxydants phénoliques de synthèse utilisés dans l'industrie alimentaire pour la conservation des aliments. (Multon, 2002).

Il existe des antioxydants préventifs dont le rôle est d'inhiber la production des radicaux initiateurs des réactions d'oxydation. Il s'agit de substances décomposant les hydroperoxydes en alcools comme les thiols, de substances complexant les doubles liaisons les rendant moins sensibles à l'oxydation, de substances protectrices vis-à-vis des rayons ultraviolets comme les carotènes ou de substances chélatant les métaux promoteurs d'oxydation tel que le fer et le cuivre.... D'autres types d'antioxydants agissent comme donneurs d'hydrogène vis-à-vis d'un radical hydroperoxyle et interrompent les réactions en chaîne, ils sont appelés «pièges radicalaires». A cette catégorie appartiennent les tocophérols et les antioxydants phénoliques. (Marfak, 2003).

V. Foeniculum vulgare Mill.

L'espèce Foeniculum vulgare Mill.se divise en deux sous-espèces : subsp. piperitum et subsp. Vulgare (Badoc et al., 1995; Vienna et al.,2005; EFSA, 2009).La sous espèce vulgare est

présenté par 3 variétés (var.vulgare :fenouil amer ;var. dulce : fenouil doux ;var.azoricum : fenouil bulbeux )(Amimar et al., 2001; Vienna et al., 2005; Kothe, 2008).

C'est une plante vivace caractérisée par des grains amers (Diaaz-Maroto et al., 2006) . Elle est hémicryptophyte et peut atteindre 2 m de longueur. Cette plante, dont la floraison est entre juillet et septembre, est pollinisée par des insectes et disséminée par gravité.

Cette sous espèce a une odeur aromatique caractéristique. Sa tige arrondie et assez grêle. Ses feuilles en lanières divariquées sont courtes et un peu épaisse. Ses petites ombelles sont brièvement pédonculées avec des rayons inégaux et courts renfermant des fleurs jaunes (figure2). Ses fruits sont étroits (Rameau et al. ,2008).

Elle possède des graines dont leurs odeurs rassemblent à celle de l'anis.Sesgrainessont lisses etutilisées comme aromatisants dans les produits de boulangerie et dans les boissons alcoolisées (Diaaz-Maroto et al., 2006). Cette sous espèce est très répandue. Sa morphologie est spécifique avec des feuilles divisées en segments allongées et des ombelles grandes de couleur jaune vif (figure3) (Bernáth et al., 1996).

Le fenouil, Foeniculum vulgare Mill., est une espèce très aromatique d'usage culinaire et médicinale (Diaaz-Maroto et al., 2006) . Elle est consommée comme aliment ou épice. Les graines de fenouil sont utilisées traditionnellement comme collyre pour les troubles visuel les. Elles sont également utilisées pour la stimulation de la lactation et pour le traitement des problèmes digestifs. En effet, elles améliorent la sécrétion des enzymes digestives et stimule le tractus gastro-intestinal du péristaltisme au niveau de l'appareil digestif.

Les graines de fenouil contiennent de 2 à 6% d'huile essentielle. Elles contiennent aussi des acides organiques, des flavonoïdes et des polysaccarides. (Khan et Ather, 2006).

Chapitre 2.

Dans ce chapitre, nous présenterons les protocoles expérimentaux préconisés pour l'extraction et l'analyse de la composition chimique des huiles essentielles et des extraits ainsi que les techniques utilisées pour le dosage de l'activité antioxydante.

I. Matériel végétal

Des prospections effectuées, en Tunisie, durant les mois de Novembre 2014, nous ont permis de repérer huit populations de Foeniculum vulgare Mill., représentatives de l'aire de répartition de l'espèce qui s'étend de l'étage bioclimatique humide (Mjeles),sub-humide (EL Alia,Oued zarga, Téboursouk), au semi-aride (Kélibia, Zouarine, Zaghouan, Cebalet ben ammar). Nous avons tenu compte dans notre échantillonnage de l'éloignement géographique des populations et du bioclimat. La localisation géographique des populations est rapportée dans la figure 11.

Dix individus de chaque population ont été collectés. Les plantes ont été séchées à l'air libre et à l'ombre pendant une semaine et les graines ont été isolées du reste de la plante pour servir à l'extraction.

II. Préparation des extraits

L'extraction des huiles essentielles a été effectuée par hydrodistillation à l'aide d'un appareil de type Clevenger (figure12).

100 g de graines séchées ont été broyés. La poudre obtenue est soumise à une hydrodistillation dans un dispositif de type clevenger pendant trois heures. Les vapeurs chargées d'huiles en traversant un réfrigérant se condensent. L'eau et l'huile se séparent par différence de densité. Les huiles essentielles obtenues sont conservées à -4°C.

Le rendement des huiles essentielles s'exprime par le rapport entre la quantité d'huile extraite et la quantité de matière végétale utilisée pour l'extraction. Il est calculé de la manière suivante : R (%) = (MHE/MMV)^*100

III. Détermination de la composition chimique des huiles essentielles

L'analyse de la composition des huiles essentielles a été effectuée par la technique de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrophotométrie de masse (SM).

Les huiles essentielles sont analysées par chromatographie en phase gazeuse du type `SHIMADZU Séries GC-2014 system (figure 13) équipé d'un injecteur diviseur (220°C) et d'un détecteur à ionisation de flamme (280°C). La colonne capillaire en silice fondue est à phase stationnaire apolaire .Elle est de type DB5 (30 m x 0,25 mm).

La température du four est programmé de 50 jusqu'à 220°C à raison de 5°C/min. Le débit du gaz vecteur (l'azote) est de 1ml/min. Avant l'analyse, les huiles essentielles sont diluées 20 fois dans l'hexane. L'identification des différents composés a été réalisée sur la base des indices de rétention linéaires.

Figure 13: chromatographe en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme

Le couplage CG / SM a permis également l'identification des huiles essentielles. Le principe repose sur la fragmentation des composés suite à leur bombardement par un flux d'électrons et leur exposition à des champs électriques. Les ions libérés seront classés selon leur rapport masse/charge. Le chromatographe utilisé est de type Agilent 19091S-433(figure14). La phase stationnaire est formée de 5% phényl méthyl siloxane et 95% diméthylpolysiloxane. Le gaz vecteur est l'hélium, avec une pression de 7,63 psi en tête de la colonne et un débit constant de 1 ml par minute dans la colonne. L'injection de l'extrait se fait en mode split (100 :1). 2ul de l'extrait sont injectés. La température du four au moment de l'injection est constante (50°C) puis elle suit un gradient linéaire jusqu'à 300°C à raison de 2°C par minute pendant 15 minutes.

Figure 14: Couplage chromatographe en phase gazeuse/ Spectrométrie de masse (CG / SM)

IV. Dosage des composés phénoliques 1. Dosage des polyphénols totaux

Selon Dewanto et al. (2002), Le dosage des polyphénols totaux se fait par la méthode colorimétrique de Folin- Ciocalteu qui est basé sur le principe de l'oxydoréduction. Le réactif de Folin-Ciocalteu (RFC), un acide de couleur jaune, présente des polyhétérocycles acides contenant du molybdène et tungstène. En milieu alcalin, il est

réduit en présence de polyphénols, en oxyde de tungstène et de molybdène en donnant une couleur bleue.

Une prise de 125ul de l'extrait aqueux / 500 ul huile essentielle dilué est mélangée avec 500ul d'eau distillée et 125ul de réactif de Folin-Ciocalteu. Après une agitation vigoureuse du mélange suivie d'un repos de 3 minutes, une prise de 1250ul de Carbonate de sodium Na2CO3 à 7% est additionnée. Enfin le mélange obtenu est ajusté par 3ml d'eau distillée.

Après un repos de 90 minutes à l'obscurité. La lecture de l'absorbance est effectuée à une longueur d'onde de 760 nm par rapport à un blanc dont l'extrait est remplacé par le solvant d'extraction (figure15).

Une gamme étalon d'acide gallique est préparée dans les mêmes conditions que les échantillons, pour des concentrations variables de 0 à 100 mg.l^-1.Les teneurs des extraits en polyphénols totaux sont exprimés en mg d'équivalent acide gallique par gramme de matière sèche (mg EAG.g^-1MS).

Selon Dewanto et al. (2002), le dosage des flavonoïdes se fait par la méthode colorimétrique qui est basée sur la formation d'un complexe jaune entre les flavonoïdes et le chlorure d'aluminium.

Une prise de 125ul de l'extrait aqueux convenablement dilué est mélangée avec 35,5ul de NaNO2 (5 %). Après un repos de 6 minutes, 75ul de AlCl36H2O (10 %) fraîchement préparée est ajouté au mélange et 5 minutes plus tard, 250ul de NaOH (1M) sont additionnés. Finalement, le mélange est ajusté à 1250ul avec de l'eau distillée. La lecture de l'absorbance se fait à 510 nm contre un blanc dans lequel l'extrait est remplacé par le solvant d'extraction.

Une gamme étalon de catéchine est préparée dans le méthanol, dans les mêmes conditions que les échantillons, pour des concentrations allant de 0 à 100 mg.l^-1. Les teneurs des extraits en flavonoïdes sont exprimées en mg d'équivalent catéchine par gramme de matière sèche (mgEC.g^-1MS).

Selon Price et al. (1978) le dosage des tanins condensés se fait par la méthode colorimétrique basée sur la dépolymérisation des tanins condensés en présence d'acide sulfurique. Sous l'effet de la vanilline, ces tanins se transforment en anthocyanidols de couleur rouge spécifique. (Sun et al., 1998).

Un aliquote de 0.05 ml de l'extrait aqueux est additionné à 3 ml de vanilline (4 %) et 1,5 ml de HCl concentré. Après 15 min d'incubation à une température ambiante, l'absorbance est mesurée à 500 nm.

Une gamme étalon de catéchine est préparée, dans les mêmes conditions que les échantillons, pour des concentrations allant de 0 à 100 mg.l^-1. Les teneurs des extraits en tanins condensés sont exprimées en mg d'équivalent catéchine par gramme de matière sèche (mgEC.g^-1MS).

V. Etude de l'activité antioxydante: Test DPPH

Différentes techniques sont employées pour mesurer l'activité antioxydante des extraits et des huiles essentielles des plantes. Dans notre étude, on s'est basée, pour l'évaluation de cette activité, sur la mesure de l'activité antiradicalaire par la méthode du DPPH.

Le test DPPH, le radical libre synthétique 2,2-diphenyl-1-picryle-hydrazyle, est le procédé le plus utilisé dans l'évaluation de l'activité antioxydante. Le DPPH est caractérisé par coloration violette en cas d'absence de l'antioxydant. En contact d'antioxydants, la couche électronique de ce radical est saturée d'où la disparition de sa coloration violette.

Cette décoloration représente l'aptitude de l'extrait de la plante à piéger ce radical (figure 16) (Akrout et al., 2009).

L'activité antiradicalaire est mesurée selon la méthode de Hanato et al. (1988). La solution DPPH^. (0,2 mM) est obtenue en dissolvant 7.8mg de DPPH^. dans 100 ml de méthanol. 250 ul de cette solution sont additionnés à 1 ml d'extrait/huile essentielle à différentes concentrations.

Après une agitation vigoureuse du mélange, il est conservé au repos pendant 30 minutes à l'obscurité. L'absorbance est mesurée à 517 nm l'aide d'un spectrophotomètre UV visible en se référant à un témoin sans extrait.

Selon Rashid et al. (2010) L'activité antiradicalaire est estimée en pourcentage d'inhibition grâce à la formule suivante :

La courbe représentant la variation de l'absorbance en fonction de la concentration permet de déterminer la valeur de _CI50 (concentration correspondant à 50 % d'inhibition, exprimée en ug.ml^-1).

La valeur de _CI50 la plus faible correspond à l'efficacité de l'extrait la plus élevée. Le témoin positif est le BHT : 3, 5- ditertiobutyl-4-hydroxytoluène.

L'étude quantitative et qualitative des huiles essentielles extraites à partir des plantes aromatiques et médicinales permet leur valorisation afin de les cibler selon leurs rendements, leurs compositions et leurs activités pour de futures applications.

Dans le présent travail, Le traitement statistique des données est réalisé à l'aide du logiciel SPSS 18 (par la méthode ANOVA).La comparaison des moyennes a été effectuée par le test de comparaison multiple de Newman-Keuls au seuil de 5% (la différence est significative pour une valeur de p<0,05).

Chapitre 3.

L'extraction des huiles essentielles à partir des graines de Foeniculum vulgare Mill. de huit populations de la Tunisie a permis d'obtenir différents rendements illustrés dans la figure 17.

Figure 17: Rendements moyens en huiles essentielles des graines de F.vulgare Mill. de
différentes provenances.

L'analyse statistique a montré que le rendement moyen en huile essentielle des graines de Foeniculum vulgare Mill.de la région de Téboursouk appartenant à l'étage bioclimatique subhumide se distingue significativement des autres régions avec un rendement de 4,29%.

Les huiles essentielles de la population de Mjeles de l'étage bioclimatique humide présente le rendement le plus faible (2,31%). Ce rendement est significativement différent des rendements enregistrés pour les sites appartenant à l'étage bioclimatique semi-aride (Kélibia, Zouarine, Zaghouan, Cebalet ben ammar).

Des études menées par Munoz-Bortomeu et al (2006) ont montré que le rendement en huile essentielle varie en fonction de l'étage bioclimatique. Les conditions d'un climat aride favorisent la biosynthèse des huiles essentielles qu'un climat humide.

Le rendement en huile essentielle des graines de Foeniculum vulgare Mill.de la Turquie rapporté par l'étude de Özcan et Chalchat (2004) est plus important (6,01%) que celui que nous avons enregistré chez les populations collectées dans les différentes régions de la Tunisie. Cependant, Roby et al. (2013) ont montré que des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare Mill de l'Egypte se caractérisent par un rendement faible (1,95%).

2. Rendements en extraits aqueux

L'examen des résultats illustrés dans la figure 18 montre que les rendements moyens des extraits des graines de F.vulgare Mill. des populations de Mjelis (humide) et Cebelet ben Ammar (semi-aride) sont significativement différent des autres régions avec des pourcentage 20,98% et 20,15 % respectivement.

Figure 18: Rendements moyens en extraits des graines de F.vulgare Mill. de différentes

Les extraits de la population d'Oued zarga de l'étage bioclimatique semi-aride présente le rendement le plus faible (12,7%).

Les rendements moyens des extraits aqueux des populations de Zaghouan, Zouarine et Téboursouk sont proches du rendement de l'extrait aqueux de F.vulgare de la Turquie (16,20%) (Oktay et al. 2003).

3. Analyse de la composition chimique des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare Mill.

L'analyse de la composition chimique des huiles essentielles des graines de F.vulgare par CG -FID et GC/MS (Tableau 3), vise essentiellement la détection de variations dans la teneur et la nature des composés

Table 2: Composition chimiques des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare
Mill des différentes provenances

Distribution en pourcentages des composés chimiques des huiles essentielles des graines de F.vulgare (%)

Composés chimiques	RT
Composés chimiques	RT	Zwerine	Mjeliss	Oued zarga	Sabelet ben ammar	Teboursek	Elalya	Zaghouen	Klibia
Tricyclene	7700	-	1,91	1,14	-	0,7	-	-	0,47
á-tujene	7808	2,14	14,16	12,24	8,28	4,82	17,8	3,03	11,1
á-Pinene	8075	-	1,99	2,19	-	1,92	4,24	0,88	1,65
Sabinene	9100	-	-	-	0,24	-	-	-	-
â-Pinene	9550	0,18	0,79	0,7	0,88	0,33	1,69	1,24	-
â-Myrcene	9633	0,68	1,81	2,15	13,16	1,99	1,31	1,31	1,88
á-Phellandrene	10200	1,24	-	1,93	-	3,7	-	-	-
A.3-Carene	10408	-	2,33	0,46	-	2,88	-	5,39	-
p-Cymene	10942	0,14	-	-	-	-	-	-	-
Para cymene	10958	-		3,36	0,26	12,98	-	1,95	-
l-Limonene	11117	21,63	16,75	21,21	19,09	9,97	18,46	30,58	36,7
â-Phellandrene	11308	-	-	-	-	-	-	-	-
cis-Ocimene	11400	-	-	-	-	1,26	1,78	-	-
Fenchone	13558	3,76	1,59	1,9	5,99	5,07	3,96	5,26	-
á-Fenchone	13583	-	-	-	-	-	-	-	-
Methylchavicol(estragole)	18358	49,55	51,87	35,93	42,61	47,33	46,19	45,46	43,8
Fenchylacetate exo	19925	-	0,8	-	-	-	0,13	-	-
Fenchylacetate	19333	-	-	-	-	-	-	-	-
á-Copaene	26217	0,29	-	-	0,46		0,78	-	-
E-anethol	34758	15,13	2,85	14,57	5,99	4,46	1,46	1,24	2,79
Total		94.738	96.85	97.787	96.95	97.4	97.783	96.32	96.72

La composition chimique des huiles a été identifiée en se basant sur les valeurs de leurs indices de rétention (RI) et par comparaison de leurs spectres de masse avec ceux rapportés dans la littérature.

Les huiles essentielles ont été identifiées de 94,73% à 97,78%. Elles ont pour composé majoritaire le methylchavicol.

La population de Mjelis de l'étage bioclimatique humide renferme le pourcentage le plus élevé en methylchavicol (estragole) avec une teneur de 51,87% suivi du l-Limonene (16,75%).

Les huiles essentielles des graines de Zouarine, Zaghouan et Kélibia appartenant à l'étage bioclimatique semi-aride se caractérisent par des taux plus élevés en l-Limonene que les autres sites.

Les variations, rencontrées dans la composition chimique du point de vue qualitatif et quantitatif de nos populations peuvent être dues à certains facteurs notamment la location géographique, l'étage bioclimatique ou même à des facteurs génétiques.

Napoli et al (2010) rapporte que l'huile essentielle extraite des graines de F.vulgare Mill. de la région de « Val di Noto » de l'Italie se caractérise par le même chémotype que notre espèce. En effet, la composition de cette huile essentielle est riche en estragole (71,1%). D'autres constituants avec des teneurs plus faibles sont présents : Le fenchone (14,3%) et le limonene (4,3%).

Cependant d'autres compositions de F. vulgare Mill. ont été rapportées. En Inde, l'huile essentielle extraite des graines de cette espèce se caractérise par le chémotype trans-anéthol (70, 1%) (Singh et al., 2006).

II. Teneurs en polyphénols totaux, flavonoïdes et tanins 1. Polyphénols totaux

Les résultats de dosage des polyphénols totaux par la méthode de Folin-Ciocalteu des extraits aqueux et des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare Mill. collectées de huit régions de la Tunisie sont représentés dans la figure 19.

Figure 19: Teneurs en polyphénols totaux des extraits aqueux et des huiles essentielles des
graines de Foeniculum vulgare Mill.

Les résultats obtenus ont montré que les teneurs en polyphénols totaux des huiles essentielles et des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare Mill varient considérablement d'une région à une autre.

Les huiles essentielles de la population de Téboursouk de l'étage bioclimatique subhumide sont riches en polyphénols totaux. Elles se distinguent significativement des autres populations avec une teneur de 88,55 mg EAG/g HE. Cependant, les huiles essentielles des graines collectées de la région d'El Alia a présenté la teneur la plus faible (12,6mg EAG/g HE). Cette teneur est significativement différente des teneurs enregistrées pour les sites appartenant à l'étage bioclimatique semi-aride (Zouarine et Zaghouen).

La comparaison de nos résultats avec les travaux de Moghaddama et al. (2015) sur une espèce médicinale de la famille des apiaceaes «Cuminum cyminum L.» a montré la supériorité des résultats enregistrés pour le site de Téboursouk qui est deux fois plus riches en polyphénols totaux. Cette étude a montré des teneurs similaires en ces biomolécules (40 mgEAG/gHE) avec les teneurs enregistrées dans le site d'Oued zarga.

Les teneurs des extraits aqueux de Foeniculum vulgare Mill. en polyphénols totaux de la région de Mjelis se distinguent significativement des autres régions avec une teneur de 93,42mg EAG/g MS.

Les extraits aqueux de la population de Cebalet ben ammar de l'étage bioclimatique semi-aride présente la teneur la plus faible (12,6mg EAG/g MS). Cette teneur est significativement différente des teneurs enregistrées pour les sites de Zouarine et Zaghouen bien qu'ils appartiennent au même étage bioclimatique.

Dua et al., (2013) ont rapporté que les teneurs en polyphénols totaux des extraits aqueux de Foeniculum vulgare Mill.de l'Inde renferme 16,506 mg EAG/g MS. Ces résultats sont en accord avec les teneurs qu'on a trouvé pour les sites d'El Alia, Téboursouk et Cebalet ben ammar.

L'analyse de la variabilité des teneurs des polyphénols des huiles essentielles et des extraits aqueux entre les populations montre des différences significatives surtout pour les extraits. Cette variation peut être peut être due aux conditions climatiques et à la localisation géographique (Falleh et al., 2008).

On peut également attribuer cette variation au fait que la méthode de Folin-Ciocalteu permet une évaluation brute des composés phénoliques présents dans les extraits végétaux pouvant donner des concentrations phénoliques apparentes élevées. D'ailleurs, les divers composés phénoliques répondent différemment dans cette analyse, selon le nombre de groupes phénoliques qu'ils possèdent (Cook and Samman, 1996).

2. Les flavonoïdes

L'évaluation des teneurs en flavonoïdes est effectuée par des dosages spectrophotométrique. Les résultats sont exprimés en milligramme catéchine par gramme de matière végétal sec.

Figure 20: Teneurs en flavonoïdes des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare

Les résultats des teneurs en flavonoïdes présentés dans la figure 20 montent que les extraits aqueux, révèlent une variation entre les populations qui semblent être corrélée à leur appartenance aux différents étages bioclimatiques. En effet, les teneurs des extraits de Foeniculum vulgare Mill. en flavonoïdes de la région de Téboursouk (subhumide) et kélibia (semi-aride) se distinguent significativement des autres régions avec des teneurs de 43,52 mgEC.g^-1 MS et 43,45 mgEC.g^-1 MS respectivement.

Les extraits de la population de Mjelis présente la teneur la plus faible (13,07mgEC.g^-1MS). Cette teneur est significativement différente des teneurs enregistrées pour les sites (Cebalet ben ammar, Zouarine et Zaghouan).

Les extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare Mill. collectées de différentes provenances de la Tunisie exhibe des teneurs plus élevées en flavonoïdes par rapport à celles obtenues chez la même espèce de l'Inde (9,325 #177; 1.25 mg EC/g MS) (Dua et al., 2013).

L'analyse des résultats de quantification des tanins condensés des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare Mill. (figure 21) montre que les teneurs enregistrées pour les différentes populations sont beaucoup moins importants que celles en flavonoïdes.

Figure 21: Teneurs en tanins condensés des extraits aqueux des graines de Foeniculum

Les teneurs en tanins des extraits aqueux d'Oued zarga (subhumide) sont les plus importantes (5,37 mg EC/ g MS) et se distinguent significativement des autres sites. Cependant, les résultats obtenus ont montré que le site de Téboursouk du même étage bioclimatique est la plus faible (0,955 mg EC/ g MS).

Les extraits aqueux des graines collectées d'El Alia et Cebalet ben ammar présentent des teneurs similaires bien qu'ils appartiennent à des étages bioclimatiques différents.

Les travaux menés par Lasonie et al, (2007) sur Foeniculum vulgare Mill. de l'Algérie ont montré également que les extraits aqueux contiennent des faibles teneurs en tanins.

En général, la production des composés phénoliques qui sont des métabolites secondaires peuvent être influencée par les localisations géographiques et par les changements climatiques.

Les teneurs en ces composés varient en fonction de plusieurs conditions notamment la méthode d'extraction et la durée d'extraction.

III. Etude de l'activité antioxydante des huiles essentielles et des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare Mill.

L'activité antioxydante des huiles essentielles et des extraits aqueux des graines de Foeniculum vulgare Mill. est évaluée par la méthode de DPPH.

Les courbes des pourcentages d'inhibition du radical libre en fonction des concentration des extraits ou des huiles nous ont permis de déterminer les concentrations d'inhibition à 50 % (CI50) . Le tableau 2 représente les valeurs des _CI50 obtenues.

Table 3: Activité antiradicalaire _(CI50 en ìg.ml-1) des extraits et des huiles essentielles des
graines de Foeniculum vulgare Mill. des différentes provenances

Les résultats représentés sont les moyennes de trois répétitions. Les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes selon le test de comparaison multiple de Newman-Keuls au seuil de 5%.

Les analyses statistiques ont montré que les valeurs des _CI50 des extraits et des huiles essentielles de Foeniculum vulgare Mill. des différentes provenances sont significativement différentes.

L'extrait aqueux de la population de Zaghouen de l'étage bioclimatique semi-aride présente la plus importante valeur de _CI50 (165,36 ìg.ml^-1) correspondant à la capacité antiradicalaire la plus faible. Cependant, la population de Téboursouk de l'étage bioclimatique subhumide exhibe la capacité antiradicalaire la plus importante avec une valeur de _CI50 la plus faible

Les travaux menés par Parejo et al. (2004) sur les extraits aqueux de F. vulgare Mill. de l'Espagne ont montré une valeur de CI50 égale à 16,42 ìg.ml^-1.Ces extraits exhibent une activité antiradicalaire moins importante que celle de Téboursouk.

Les travaux de Chatterjee et al. (2012) sur les extraits aqueux de F.vulgare Mill. de Rajasthan sont proche de nos résultats pour la population de Cebalet ben ammar avec une valeur de 30 ìg.ml^-1.

Les résultats obtenus ont montré que la plus faible capacité antiradicalaire des huiles essentielles F. vulgare Mill est enregistrée pour la population de Mjeless qui présente la plus grande valeur de CI50 (145,28 ìg.ml^-1).

Les valeurs des CI50 des huiles essentielles de F.vulgare Mill. montrent que la population de Téboursouk exhibe l'activité antiradicalaire la plus importante (CI50 = 6,12ìg.ml^-1) suivi de l'huile essentielle de Zaghouan (CI50 = 8,75ìg.ml^-1).

Les travaux de Bouguerra (2012) sur les huiles essentielles de F. vulgare Mill. de l'Algérie montrent une faible activité antiradicalaire par rapport à nos résultats avec une valeur de CI50 très grande (752,65#177;32,5ìg.ml^-1). Cependant, les travaux d'Anwar et al. (2009) sur F. vulgare Mill. de Pakistan sont proche de nos résultats pour la population de Sabelit ben ammar avec une valeur de 32,32 ìg.ml^-1.

1. Analyse de l'activité antiradicalaire de l'huile essentielle des graines de F.vulgare de Téboursouk

L'évaluation du pouvoir antioxydant par la méthode DPPH de l'huile essentielle de Téboursouk a permis de tracer la courbe représentée dans la figure 22.

Figure 22: Variation du pourcentage d'inhibition du radical libre en fonction de la
concentration d'huile essentielle F. vulgare Mill.

Cette courbe montre que l'huile essentielle des graines de F. vulgare est un bon capteur des radicaux libres.

A partir de cette courbe, on a pu déterminer graphiquement la valeur de _CI50, celle-ci exprime la concentration de l'échantillon exigée pour réduire le DPPH^. en solution de 50 %. Pour mettre en évidence le pouvoir antiradicalaire de cette huile, son _CI50 (6,12 ug.ml^-1) a été comparée avec celle du standard de référence, le BHT (CI50 = 12,8 ug.ml^-1).

La forte activité antiradicalaire de l'huile essentielle de Téboursouk peut être liée à sa richesse en composés phénoliques notamment en polyphénols totaux (88,55 mg EAG/g HE). En effet, plusieurs études ont démontré l'existence d'une relation étroite entre le contenu en polyphénols du matériel végétal et sa capacité antioxydante (Burda et Oleszek, 2001 ; Vinson et al., 1995 ).

Conclusion

Les plantes aromatiques et médicinales riches en principes actifs trouvent des applications dans de nombreux domaines notamment dans le domaine alimentaire et médical.

La tendance actuelle à chercher des produits naturels, a entraîné un regain d'intérêt des scientifiques pour les substances issues des plantes médicinales.

Dans ce cadre, le présent travail a été consacré à l'extraction et l'identification chimique des huiles essentielles et des extraits aqueux d'une espèce spontanée de la Tunisie, Foeniculum vulgare Mill. ainsi que l'étude de leurs activités antioxydantes.

La détermination des rendements d'extraction en huiles essentielles ont montré que l'huile essentielle des graines de Foeniculum vulgare Mill.de la région de Teboursek appartenant à l'étage bioclimatique subhumide se caractérise par un rendement moyen (4,29%) plus élevé que les autres régions.

L'analyse de la composition chimique des huiles essentielles des graines de Foeniculum vulgare Mill. a montré que les huiles collectées des huit régions sont principalement riches en méthylchavicol (estragol). La composition à estragol caractérise également le fenouil sauvage de l'Italie alors que celle à E-anéthol caractérise Foeniculum vulgare Mill.de l'Inde.

Les résultats de la quantification des composés phénoliques indiquent queles huiles essentielles de la population de Teboursek de l'étage bioclimatique sub-humide révèlent un meilleur taux de polyphénols totaux (88,55 mg EAG/g HE) tandis que la population de Mjeless située à l'humide, arbore des taux élevés en polyphénols totaux (93,42 mg EAG/g MS) au niveau des extrait aqueux.

L'évaluation de l'activité antioxydante des extraits aqueux et des huiles essentielles par la méthode de DPPH a montré que l'huile essentielle des graines de F. vulgare de la population de Teboursek exhibe l'activité antiradicalaire la plus importante (CI50 = 6,12 ìg.ml^-1) .Cette activité est plus forte que celle de BHT (CI50 = 12,8 ìg.ml^-1)

Les résultats obtenus méritent donc d'être compléter en vue d'une éventuelle utilisation des huiles essentielles en médecine et en alimentaire.

? Evaluer l'activité antioxydante par d'autres méthodes telles que le blanchissement de la ?-carotène, la mesure du pouvoir réducteur.

? Identification par HPLC et caractérisation par RMN des principales molécules antioxydantes de F. vulgare Mill.

? La recherche d'autres activités biologiques particulièrement anti-inflammatoire et anti-tumorale.

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