I-2-2 Identification au CLHP des produits obtenus
Les analyses quantitatives et qualitatives des composés
phénoliques durant les réactions de bioconversion sont
contrôlées par CLHP. Pour les phénols
récupérés, une procédure d'extraction
liquide-liquide utilisant le solvant : acétate d'éthyle est
appliquée aux échantillons. Il a été
rapporté que l'acétate d'éthyle (AE) est le meilleur
solvant convenant
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Résultats et Discussion
pour une extraction des monomères phénoliques
(Allouche et al., 2004 a). Pour l'évaluation de la
réaction enzymatique avec les différents substrats,
l'acétate d'éthyle (v/v) est sélectionné pour
l'extraction des composés phénoliques simples à partir des
échantillons. Les chromatogrammes de CLHP des margines brutes, la
fraction organique et la fraction résiduelle avant et après
l'hydrolyse sont montrés sur la Fig. 21. Le profile de CLHP des margines
brutes fraîches montre que l'oleuropéine et l'hydroxytyrosol sont
les majeurs composés et ils sont présents à 66,5% et 2%,
respectivement. Le tyrosol est aussi détecté mais sa
concentration est très faible, en comparaison avec les autres
phénols. Les trois composés phénoliques présent
dans les margines en forte concentration sont l'oleuropéine,
l'hydroxytyrosol, et le tyrosol. Ces trois composés sont associés
structurellement. En effet, l'hydroxytyrosol et le tyrosol ont des structures
identiques à l'exception de l'hydroxytyrosol qui possède un
groupement hydroxyle en position méta. L'oleuropéine est
un ester qui consiste de l'hydroxytyrosol et l'acide élénolique.
L'oleuropéine est le majeur composé phénolique dans le
fruit d'olive, qui peut présenter jusqu'à 14 % de l'extrait sec
du fruit, l'hydrxytyrosol est le majeur composé phénolique
d'huile d'olive (Jemai et al., 2009). Pour les fruits d'olive mature,
la concentration de l'oleuropéine décroît et celle de
l'hydroxytyrosol, le produit d'hydrolyse de l'oleuropéine croît
(Jemai et al., 2009). Par ailleurs, l'hydroxytyrosol a
été synthétisé enzymatiquement utilisant une
tyrosinase fongique (Espin et al., 2001). Cette procédure
biologique est environnementale et elle est adaptée au procès
industriel. La base de cette étude est que la large quantité de
l'hydroxytyrosol et les phénols monomériques peuvent se trouver
dans les margines après son traitement hydrolytique par un procès
enzymatique convenable.
La comparaison des différents rendements de production
de l'hydroxytyrosol en considérant les substrats utilisés est
résumée dans le Tableau 10. Ce résultat et le profil de
CLHP indiquent que la concentration de l'hydroxytyrosol augmente après
le traitement hydrolytique de différents échantillons. Comme
c'est indiqué dans les chromatogrammes de CLHP (Fig. 21), les margines
hydrolysées montrent une concentration élevée en
hydroxytyrosol (0,56 g/l) en la comparant avec le control (0,05) et les
margines acidifiées (0,18). Aussi, ces profiles montrent l'augmentation
des concentrations en tyrosol (Ty), l'acide p-coumarique (PC) et
l'acide caféique (CA) après l'hydrolyse des margines brutes et de
la fraction résiduelle. Concernant l'utilisation de la fraction
phénolique comme substrat pour la biotransformation nous observons une
mineure augmentation de la concentration d'hydroxytyrosol (0,15 g/l). En outre,
les résultats présentés dans le Tableau 10 notent que la
bioconversion enzymatique a augmenté la concentration en HT environ 37,5
et 11 fois, en présence de la fraction épuisée et
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Résultats et Discussion
le margine brut respectivement. En utilisant la fraction
épuisée comme substrat; 0,75 g/l d'hydroxytyrosol est produit,
suggérant que l'hydrolyse enzymatique peut être une technologie
très prometteuse qui peut être utilisée pour augmenter la
concentration d'hydroxytyrosol de margine épuisé obtenu
après une première série d'extraction par solvant de
margine. L'utilisation de margine brut pour la biotransformation enzymatique
pour libérer la concentration maximale d' hydroxytyrosol pourrait
être aussi très rationaliste. Nos résultats confirment que
la 3-glucosidase et l'estérase sont le principal facteur de
libération de l'hydroxytyrosol à partir de l'oleuropéine
tandis que d'un autre étude a démontré que la
bioconversion enzymatique de ce composé en utilisant la 3-glucosidase
recombinante et hyperthermophile de l'archaeon Sulfolobus solfactaricus
exprimé dans Escherichia coli (Briante et al.,
2000). Ici, il convient de noter qu'en vertu des conditions utilisées
dans la biotransformation dans cette étude, l' hydroxytyrosol a
été obtenue à partir de oléuropéine et
d'autres molécules complexes présentes dans le margine, qui sont
moins extractible par le solvant d'acétate d'éthyle. En fait, le
margine contient généralement en plus de l'oleuropéine,
d'autres molécules phénoliques glucosylés, comme le
ligstroside et le démethyl-oleuropéine que, lorsque ils sont
hydrolysées donnent naissance à des formes d'hydroxytyrosol et
plusieurs acide élénolique (Mazzeia et al., 2009).
L'amélioration de la bioconversion du substrat en hydroxytyrosol est
probablement due à l'action de 3-glucosidase, estérase et
d'autres enzymes.
Résultats et Discussion
Temps (min) Temps (min)
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Temps (min) Temps (min)
Temps (min) Temps (min)
Figure 21 : Les chromatogrammes de HPLC (UV 280
nm) de la fraction phénolique (extrait à l'AE) (a), fraction
phénolique hydrolysée (b), fraction épuisée (c),
fraction épuisée hydrolysée (d), margine brute
fraîche hydrolysé (e) et acidifié (pH 2) OW (f). Tyrosol:
Ty; Hydroxytyrosol: HT; Acide para-coumarique: PC; Acide caféique: CA;
Oleuropein: OE.
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