Evaluation du risque hypercholestérolémique chez les membres des familles de diabétiques. Cas de centre diabétologique Boyambi en RDC

III.2 METHODES.

III.2.1 Dosage du cholestérol total.

Le cholestérol est déterminé selon les réactions suivantes : Principe :

Cholestérol estérase

Cholestérol estérifié + H2O Cholestérol + acides gras

Cholestérol + O2	Cholestérol oxydase		Cholestérol +O2

Peroxydase

2H 2O2 + 4-aminophenazone + phénol

quinonéimine + 4H2O

On mesure au photomètre l'intensité de la coloration de la molécule formée, le quinonéimine, qui est directement proportionnelle à la quantité de cholestérol présente.

Mode opératoire :

Préparation des réactifs : reprendre le contenu d'un flacon de réactif R2 par le volume correspondant contenu du flacon de réactif R1. Bien mélanger et attendre 15 minutes avant de travailler. Stabilité : 21 jours à + 4° C ;

Réalisation du test :

- Longueur d'onde : 546nm.

- Température : 37 ⁰C, 30°C ou 25°C.

- Cuvette (trajet optique) : 1 cm.

- Calibration de zéro du spectrophotomètre : Blanc réactif.

TABLEAU VII: Résumé du mode opératoire de dosage du cholestérol total.

	Blanc réactif		Echantillon	Eau distillée déminéralisée
10ul	-		Etalon (200mg/dl)
-	10ul		Réactif de travail
1000ul	1000ul

Bien mélanger et incuber pendant 10 minutes à 37⁰C. Lire l'absorbance de l'échantillon ou de l'étalon contre le blanc réactif à 546nm. Cette réaction est stable pendant une heure.

Calcul de la concentration du cholestérol total : C. Ech. ~ ~~ ~

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

Tableau VIII : Valeurs attendues.

Cholestérolémie		Evaluation du risque		< 2 g/l < 200 mg/dl < 5,18 mmol/l
Risque faible, en particulier si :		Cholestérol #177; HDL < 0,60 g/l < 60 mg/dl 1,55 mmol/l

III.2.2 Dosage du HDL-Cholestérol.

Principe :

Les chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité( VLDL) et de faible densité(LDL) contenus dans l'échantillon sont précipité par addition d'acide phosphotungstique en présence d'ions magnésium. Le surnageant obtenu contient les lipoprotéines de haute densité(HDL) dont le cholestérol est dosé comme vu pour le cas de cholestérol total.

Mode opératoire :

Préparation des réactifs :

Réactif R1 et Standard HDL-cholestérol R4 sont prts à l'emploi. Réalisation du test :

- Longueur d'onde : 500nm.

- Température : 37 ⁰C, 30°C ou 25°C.

- Cuvette (trajet optique) : 1 cm.

- Calibration de zéro du spectrophotomètre : Blanc réactif.

Tableau IX : Procédure de précipitation.

	Macro-méthode		Semi micro-méthode	Echantillon
50011l	20011l		HDL précipitant R1
100011l	-		Diluted Precipitant
-	50011l

Bien mélanger et incuber pendant 10 minutes à la température ambiante. Puis, centrifuger pendant 10 minutes à 4000 TPM. Reprendre le surnageant limpide qui est stable pendant deux heures pour déterminer le HDL-cholestérol avec la solution de travail du cholestérol total et le HDL- standard de 50mg/dl.

Tableau X : Mode opératoire pour le dosage du HDL-cholestérol.

	Blanc réactif	Etalon		Echantillon	Eau distillée déminéralisée
10011l	-	-		Etalon R4 (50mg/dl)
-	10011l	-		Surnageant
-	-	10011l		Solution de travail (Cholestérol total)
100011l	100011l	1000 11l

Bien mélanger et incuber pendant 5 minutes à 37°C. Lire l'absorbance de l'échantillon ou de l'étalon contre le blanc réactif à 500nm. Cette réaction est stable pendant une heure.

Calcul D. 0 echantillonul de la concentration du HDL-cholestérol : C. Ech. = x Conc. etalon.

D. 0 etalon

Tableau XI : Valeurs attendues.

HDL-cholestérolémie	Valeurs basses		Valeurs hautes	mg/dl
< 40	= 60		mmol/l
< 1,04	= 1,55