Memoire Online - Recherche de nouvelles souches fongiques productrices d' antibiotiques à partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de Aà¯n Fezza.

Recherche de nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques à partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de Aïn Fezza.

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En vue du risque augmenté jour après jour des bactéries résistantes aux antibiotiques, nous nous sommes intéressés dans notre travail à la recherche de nouveaux produits naturels antibactériens d'origine les champignons des grottes de Aïn Fezza.

Afin d'atteindre notre objectif, on a procédé à des prélèvements d'échantillons de sol de trois grottes (Ghar Sokhrane, Ghar Ouled Djaâdi et Ghar Beni Aâd), ainsi que des concrétions sédimentaires. Ces prélèvements effectués entre le mois de novembre et mars (2004-2005), ont été suivis par des isolements sélectifs des champignons.

Les isolats retenus sont ceux qui appartiennent au genre «Penicillium » et qu'ils sont du nombre de 152 souches. La source principale de ces isolats était les échantillons du sol du prélèvement du mois de décembre du Ghar Sokhrane et le point de prélèvement P₂(situé à 185 mde l'entrée du Ghar Beni Aâd).

Parallèlement des souches de «Penicillium », on a révélé la présence d'une souche observée pour la première fois dans notre laboratoire. Cette souche était isolée seulement des échantillons du point de prélèvement P₂de Ghar Beni Aâd (sol et concrétions sédimentaire). D'après l'identification réalisée par le Muséum National d'Histoire Naturelle de France, la souche appartient à l'espèce « Beauveria felina ».

Le test d'antibiose de 80 souches de «Penicillium » a été effectué, seul 38 présentent une activité contre les bactéries-cibles utilisées, le criblage secondaire de 14 entre eux a révélé l'exhibition de 7 souches d'une activité inhibitrice contre aux moins une bactérie-cible. La souche appartenant à l'espèce « Beauveria felina » a présenté aussi une activité intéressante contre la bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa.

La culture en milieu liquide de cette souche, nous a permis d'étudier la production des substances antibactériennes dans le surnageant, le mycélium aérien et enfin le mycélium du substrat. Concernant le surnageant, l'activité antibactérienne étudiée durant les trois mois d'incubation n'était pas exprimé, cependant l'activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) effectuée après l'extraction par des solvants de polarité différentes était très intéressantes dans le cas de l'extraction par l'éthanol par rapport à l'extraction par l'éther de pétrole éthylique.

Bacterial resistance to the actual antibiotic is mostly in dangerous progress, why we have interest to research new natural antibacterial product that Ain Fezza's grottos fungi contains.

To attempt our objective, samples were taken from the soil of three grottos (Ghar Sokhrane, Ghar Ouled Djaâdi and Ghar Beni Aâd), and from there stalactite.

This sampling was been taken place between November and March, continued by selective isolation of these fungi.

The restrains of this operation were one of the «Penicillium » genera, with a number of 152 strains. The principal sources of these restrains were from the Ghar Sokhrane's samples which are taken place in December, and P₂point situated at 185 m from the entrance of Ghar Beni Aâd.

With the «Penicillium » strains, we were isolated one never seen in our laboratory, which was from samples of P₂point.

Muséum National d'Histoire Naturelle de France was identify this strain as « Beauveria felina » species.

Antibacterial activity's test has been effectuated over 80 strains. Only 38 of there have an activity against bacteria. The secondary screening of 14 from them revealed that 7 were an antibacterial activity. Moreover, « Beauveria felina »'s strain showed a good antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa.

Submerged culture for this strain permit to investigate the production of antibacterial substances in linger, aerial mycelium and submerged mycelium.

For three months, the study of linger's antibacterial activity did not be express, but after extraction with a different polarity solvents , it was more interesting for aerial mycelium and submerged mycelium by using ethanol compared with petrol ethylic ether .

Tableau 9 : Activité antibactérienne des extraits étheriques et éthanoliques du mycélium (aérien et substrat).

Figure 7 : Activité antibactérienne de la souche 29S₂ dans le deuxième criblage_.

Figure 10 : Activité antibactérienne de la souche 23B « Beauveria felina » contre la bactérie-cible Enterobacter cloacea (5).

1- les Champignons :...............................................................2

1-1- Généralité:........................................................................................2

1-2- Caractéristiques générales :...............................................................2

1-3 - Classification :..................................................................................3

1-4- Écologie des champignons :................................................................4

1-5-les principaux producteurs d'antibiotique :..........................................5

2- La grotte:.............................................................................6

2-1- l'homme préhistorique :.....................................................................6

2-2- L'homme musulman :........................................................................6

2-3- L'homme Algérien :...........................................................................8

2-4- Les historiens : ..................................................................................8

2-5- Un préhistorien :..............................................................................9

2-6-Un spéléologue : .................................................................................9

2-7- Un biospéléologue : .........................................................................9

2-8- Un microbiologiste :.........................................................................11

2-9- Un botaniste : ..................................................................................11

2-10- Un mycologue : ..............................................................................12

3-De nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques:.....................................................................14

1- Le site d'étude :..................................................................15

2-1- Isolement et identification :...............................................................16

2-2- Test d'antibiose :..............................................................................19

2-3- Production des substances antibactériennes :.....................................21

1- Description des stations de prélèvement : ............................24

2- Isolement et dénombrement :..............................................26

3- La souche 23 B :..................................................................27

3-1- Origine d'isolement :........................................................................27

3-2- Identification :.................................................................................27

3-3- Identification de l'espèce :................................................................32

4- Test d'antibiose :................................................................33

4-1- Les souches de Penicillium :..............................................................33

4-2- Beauveria felina :..............................................................................38

5-1- Activité antibactérienne du surnageant :............................................38

5-2- Activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) :.................40

INTRODUCTION

Les infections bactériennes étaient depuis l'antiquité la cause principale des mortalités (choléra, peste, tuberculose....) ; mais depuis 1928 le monde a changé, enfin on a une arme contre ces bactéries, un antibiotique sécrété par Penicillium notatum nommé la pénicilline.

On croyait, que le problème de ces infections était résolu jusqu'au 1947, dont les premiers cas de la résistance acquise au traitement à la pénicilline d'infections aux staphylocoques furent remarqués. Ces phénomènes de résistance ne firent pas grande impression à l'époque (LOMBARD, 2005).

En 1999, aux USA, le premier cas de résistance totale aux 12 grandes familles d'antibiotiques est remarqué. La situation est particulièrement grave dans les hôpitaux nord-américains, où, selon la Food and Drug Administration, 20% des cas d'infections nosocomiales, sont dus à des bactéries multi-résistantes (LEEB, 2004).

Alors, les scientifiques ne cessent de chercher des armes plus puissantes, utilisant ainsi différentes méthodes ; l'isolement des souches fongiques à partir de différents milieux naturels allant des sommets montagneux aux profondeurs des océans. Cependant, l'un des milieux naturels négligés dans ce combat était les grottes.

Ces grottes constituent pour certain, si on dit pas la plupart, l'abri des créatures et des monstres, le cible des chasseurs d'Or, et mêmes pour les biologistes ce milieu était un laboratoire d'étude de l'évolution des espèces et le facteur d'adaptation.

Or, ils ont négligé ce que peut donner ce milieu à l'humanité et plus spécifiquement à la santé humaine. En partant de l'histoire des « ÕÍÇÈ Ç áßå », et les phénomènes d'antagonistes qui peuvent être intenses par l'effet des conditions extrêmes de ce milieu, on a une grande chance de trouver les champignons les plus producteurs d'antibiotiques.

Alors, pour isoler ce type de champignon, notre programme de travail a consisté à :

1- Choisir le site de prélèvement, les stations, ainsi les points de prélèvement.

2- Effectuer des prélèvements à partir du sol et des concrétions sédimentaires.

4- Réaliser le test d'antibiose des souches fongiques sélectionnées sur une gamme de bactéries-cible par utilisation de différente méthode.

6- Essai d'étudier la production des substances antibactériennes par la souche fongique la plus puissante.

CHAPITRE I

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1- les Champignons :

1-1- Généralité:

Les Champignons, encore appelés "Fungi" (contraction du latin "funus", funéraille, et d'ago", produire) ou mycètes (du grec mukês, champignon), sont aujourd'hui érigés en règne autonome, au même titre que les Procaryotes (Archéobactéries, bactéries, Cyanobactéries), les Protistes, les Végétaux et les Animaux. Leur nombre est évalué à ce jour à environ 80.000 espèces (PURVES et al, 1994 ; BOIRON, 2005).

1-2- Caractéristiques générales :

- Thallophytes : ils ne possèdent ni feuilles, ni tiges, ni racines. Leur appareil végétatif, ou thalle, est constitué d cellules allongées qui peuvent se présenter de deux façons :

* Cloisonnées et articulées entre elles, et sont alors appelées hyphes (c'est le cas le plus fréquent);

* Pas de cloison les séparant les unes des autres. On parle alors de structure coenocytique et de siphon.

- Ils peuvent être pluricellulaire ou unicellulaire (levure). Les filaments ou (hyphes) s'associent pour former le mycélium, ces hyphes restent généralement indifférenciés et inorganisées. Seuls quelques groupes fongiques sont capables de produire certaines structures différenciées de leurs filaments végétatifs (vésicules, chlamydospores, boucles, des corémies ou « synnémas », ou des sclérotes). - Se reproduisent par des spores, selon un mode asexué et/ou sexué. - Hétérotrophes : la nutrition carbonée est dépendante de la présence de matières organiques préformées, ce qui conditionne, suivant les circonstances, leur vie saprophytique, parasitaire ou symbiotique.

- Ils exploitent pour cela leur environnement immédiat, absorbant les matières organiques de trois façons différentes:

* Les champignons saprophytes exploitent la matière organique morte ou en décomposition (feuilles mortes, débris végétaux ou animaux, excréments).

* Les champignons parasites exploitent la matière organique vivante, qu'il s'agisse de végétaux, d'animaux (y compris les hommes).

* D'autres champignons préfèrent la symbiose, association avec un végétal autotrophe, chacun des deux organismes tirant profit de cette association. La symbiose permet parfois de créer des êtres nouveaux, comme les lichens.

1-3 - Classification :

Les champignons ont fait l'objet de classifications complexes (BARNETT et BARRY, 1972 ; BOTTON et al, 1990 ; BOUCHETet al, 1999 ; BOIRON, 2005) :

Division 1 : GYMNOMYCOTA (cellule dépourvu de paroi. présence de myxamibes et de plasmodes).

Division 2 : MASTIGOMYCOTA (présence de spore mobile). Division 3 : AMASTIGOMYCOTA (pas de cellule mobile).

a- ZYGOMYCOTINA : Elle est présentée essentiellement par les zygomycètes, elles comprennent environ 200 espèces, rassemblent des champignons saprophytes, ainsi que des champignons parasites d'insectes (Entomophthorales), de Nématodes et d'Amibes (Zoopagales), et de plantes.

- Reproduction asexuée le plus souvent par sporocystospore. - Reproduction sexué par fusion de gamétocyste.

b- ASCOMYCOTINA ou ASCOMYCÈTE : Les Ascomycètes comprennent environ 15.000 espèces, auxquelles il faut ajouter un nombre à peu près équivalent d'espèces lichénisantes. Ils sont caractérisés par :

- Reproduction sexué par formation de spore méiotique (ascospores) dans des asques.

c- BASIDIOMYCOTINA ou BASIDIOMYCÈTES : Il existe environ 20.000 espèces, sont les champignons que l'on peut considérer comme les plus perfectionnés. ils sont caractérisés par : - Un mycélium cloisonné ou unicellulaire (levure).

- Reproduction sexué par formation de méiospore (basidiospore) dans des basides.

Encore appelés Adélomycètes, les Deutéromycètes ne constituent pas un groupe naturel, mais d'un ensemble artificiel regroupant environ 15.000 espèces (plus du quart des champignons actuellement connus).

- Ne présentant jamais, ou très exceptionnellement, de forme de reproduction sexuée. - La plupart présentent, néanmoins, des affinités d'Ascomycètes. - Ils se reproduisent uniquement par voie végétative au moyen de spores asexuées (conidie) ou par simple fragmentation du mycélium (arthroconidie).

- Les Hyphomycètes : Champignons filamenteux, stériles (Agonomycétales) ou produisant leurs spores directement sur les hyphes ou sur des conidiophores simple ou agrégés (Moniliales).

- Les Coelomycètes : Conidies produites dans des pycnides (Sphaeropsidiales) ou dans des acervules (Mélanconiales).

1-4- Écologie des champignons :
Les champignons ont développé des adaptations très diverses, de telle sorte qu'on les trouve dans pratiquement tous les milieux du monde. Les plus répandues sont les Penicillium et les Aspergillus. On les trouve sous tous les climats et sous toutes les latitudes (FLORENT, 1993 ; TACHENON, 1999).

Quelques espèces sont adaptées à la sécheresse, d'autres vivent au contraire dans l'eau (eaux douces, océans, ou eaux usées). Certaines supportent bien des pressions osmotiques élevées (dans les milieux très salés, ou très sucrés, par exemple) et arrivent à contaminer les salaisons, le miel, ou les confitures. Des champignons aimant la chaleur se trouvent dans les composts (à 70-75 ^oC) Mais on trouve aussi des champignons dans les toundras arctiques ; en haute montagne, l'hygrophore printanier se récolte à la fonte des neiges (2 ^oC) ; et certains champignons peuvent encore pousser dans les chambres réfrigérées (Sporotrichum carnis) peut altérer des viandes pourtant conservées à - 5 ^oC.

Dans des conditions défavorables (froid ou chaleur intense, manque d'eau), ce sont des spores particulières qui constituent les formes de résistance (pouvant régénérer un mycélium plusieurs dizaines d'années après sa formation). Étant donné leur mode de nutrition, les champignons peuvent, à la différence des autres végétaux, pousser dans une obscurité complète (grotte). Ils peuvent aussi vivrent à des profondeur de 3200 m dans le sol (LOCQUIN, 1984 ; TACHENON, 1999).

1-5-les principaux producteurs d'antibiotique :

Depuis, la quête de nouveaux antibiotiques se poursuit de plus belle. Quelque 10 000 antibiotiques d'origine naturelle sont connus à ce jour, Dont la majorité sont issues de « simples » micro-organismes, tel que les champignons. Tous ne sont pas employés, les effets toxiques de certains d'entre eux empêchent leur utilisation en médecine humaine et vétérinaire. (GAUTHIER, 1993 ; LOMBARD, 2005).

Il s'en suit que très peu d'antibiotique provient des champignons appartenant aux Basidiomycotina ; par contre environ (20 %) provient des champignons imparfaits Deutromycotina (Penicillium, Cephalosporium et Aspergillus). (TURNER, 1975 ; DEMAIN, 1981 ; BERDY, 1985 ; BRETON et al 1989 ; BOUCHET et al, 1999).

En revanche, le développement de deux seulement de ces antibiotiques (la pénicilline G et la céphalosporine), notamment par le biais de leurs dérivés d'hémisynthèse, a été tel qu'ils représentent aujourd'hui environ 60 % du marché mondial des antibiotiques (FLORENT, 1993).

*Penicillium : Ce champignon ubiquiste connus dans l'histoire des antibiotiques par l'espèce Penicillium notatum n'est que la forme conidienne imparfaite de champignons du genre Eurotium (BOUCHET et al ; 1999).

2- LA GROTTE :

La grotte pour l'homme signifie beaucoup ; qu'il soit un préhistorique, un musulman, un algérien (citoyen simple ou un révolutionnaire), un préhistorien, un historien, un spéléologue, un biospéléologue, un microbiologiste, un botaniste ou un mycologue. Ce qu'elle signifie alors ?

2-1- l'homme préhistorique :

Il y a bien fort longtemps que les grottes existent. Nos ancêtres ont les utilisées comme des abris ; d'abord refuges, se sont transformées en lieux d'inhumation, en centres culturels, et sont devenues le support des premières oeuvres d'art de l'humanité. La plus ancienne trace humaine dans un milieu souterrain date de 47 600 ans, dans la grotte de Bruniquel (ANONYME 1, 2001).

2-2- L'homme musulman :

Chez les musulmans, les événements les plus importants qu'a connu l'Islam ont été liés à trois grottes (Hira, Thaur et enfin sourate « El kahf ».

- Avant la révélation, elle était le refuge de Mohammed (SAW), ou il effectue ses retraites spirituelles ;

- La révélation des premiers versets du Qoran (sourate Alaq n° 96 du Qoran)

- Le premier mot révélé dans cette grotte, était une invitation de l'humanité à la science, la recherche et la connaissance de notre créateur « ALLAH » : « ÇÞÑ »

- La fin du période mecquoise et le début du période médinoise : le départ d'une nouvelle ère de l'Islam.

- Le soutient du prophète Mohammed (SAW) et son compagnon Abou Baker dans la grotte par dieu. Allah le Très Haut a dit dans sourate « El Taouba » : «

(39) ÅöáÇøó ÊóäúÕõÑõæåõ óÞóÏú äóÕóÑóåõ Çááøóåõ ÅöÐó ÂÎúÑóÌóåõ ÇáÐöíäó ßóóÑõæÇú ËóÇäöíó ÇóËúäóíúäö ÅöÐú åõãóÇ öí ÇöáúÛóÇÑö ÅöÐú íóÞõæáõ áöÕóÇÍöÈöåö áÇó ÊóÍúÒóäö Åöäøó Âááøóåó ãóÚóäóÇ óóäúÒóáó Âááøóåõ ÓóßöíäóÊóåõ Úóáóíúåö æó óíøóÏóåõ ÈöÌõäõæÏò áóãú ÊóÑóæúåóÇ æó ÌóÚóáó ßóáöãóÉó ÂáÐöíäó ßóóÑõæÇú ÇáÓøõúáóì æó ßóáöãóÉõ Çááøóåö åöíó ÂáúÚõáúíóÇ æó Çááøóåõ ÚóÒöíÒñ Íóßöíãñ (40)

c- Sourate « El kahf » : Cette sourate raconte l'histoire des hommes avec leur chien qu'ils sont refugés avec leur foi à l'unique dieu dans une grotte. Allah le Très Haut a dit : «

ÇöáúÍóãúÏõ áöáøóåö ÇáøóÐöí óóäúÒóáó Úóáóì ÚóÈúÏöå ÇáúßöÊóÇÈó æó áóãú íóÌúÚóáú áóåõ ÚöæóÌðÇ (1) ÞóíøöãðÇ áöíõäúÐöÑó ÈóúÓðÇ ÔóÏöíÏðÇ ãöäú áóÏõäúåõ æó íõÈóÔøöÑó Âáúãõæãöäöíäó ÂáÐöíäóö íóÚúãóáõæäó ÂáÕøóÇáöÍóÇÊö óäøó áóåõãõ óÌúÑðÇ ÍóÓóäðÇ(2 ) ãóÇßöËöíäó öíåö óÈóÏðÇ (3) æó íõäúÐöÑó ÂáÐöíäó ÞóÇáõæÇú ÇÊøÎóÐó Âááøóåõ æóáóÏðÇ (4)ãóÇ áóåõã Èöåö ãöäõ Úöáõãò æó áÇó áÂÈóÇÆöåöãú ßóÈÑóÊú ßóáöãóÉó ÊóÎúÑõÌõ ãöäó óúæóÇåöåöã õ Åäú íøóÞõæáõæäó ÅöáÇøó ßóÐöÈðÇ(5) óáóÚóáøóßó ÈóÇÎöÚñ äøóúÓóßó Úóáóì ÁóÇËóÑöåöãõ Åöäú áøóãú íõæãöäæõÇú ÈöåóÐóÇ ÇóáúÍóÏöíËö óÓóÇð (6) ÅäøóÇ ÌóÚóáúäóÇ ãóÇ Úóáóì ÂáÂÑúöÖ öÒíäóÉð áóåóÇ öáäóÈúáõæóåõãõ íøõåõãõ ÍúÓóäõ ÚóãóáÇð (7) æó ÅäøóÇ áóÌóÇÚöáõæäó ãóÇ ÚóáóíúåóÇ ÕóÚöíÏðÇ ÌõÑõÒðÇ (8)Âãú ÍóÓöÈúÊó äøó ÕúÍóÇÈó Çóáúßóåúö æó ÇáÑóÞöíãö ßóÇäõæÇú ãöäó ÂíóÇÊöäóÇ ÚóÌóÈðÇ (9) ÅÐó Âæóì ÇóáúöÊúíóÉõ Åöáóì Çóáúßóåúö óÞóÇáõæÇú ÑóÈøóäóÇ Áó Ç ÊöäóÇ ãöä áøóÏõäúßó ÑóÍúãóÉð æó åóíøöÆú áóäóÇ ãöäó ÂãúÑöäóÇ ÑóÔóÏðÇ (10) óÖóÑóÈúäóÇ Úóáóì Áó ÇÐó Çäöåöãú öí Çáßóåúö Óöäöíäó ÚóÏóÏðÇ (11) Ëõãøó ÈóÚóËúäóÇåõãú áöäóÚúáóãó íøõ ÇáúÍöÒúÈóíúäö ÍúÕóì áöãóÇ áóÈöËõæÇú ãóÏðÇ (12) äøóÍúäõ äóÞõÕøõ Úóáóíúßó äóÈóåõã ÈöÇáÍóÞøö Åäøóåõãú öÊúíóÉñ ÇãóäõæÇ ÈöÑóÈøöåöãú æó ÒöÏúäóÇåõãú åõÏðì (13) æó ÑóÈóØúäóÇ Úóáóì ÞõáõæÈöåöãõ öÅÐú ÞóÇãõæÇú óÞóÇáõæÇú ÑóÈøõäóÇ ÑóÈøõ ÇáÓøóãóÇæóÇÊö æó ÇáÂÑúÖö áóäú äóÏúÚõæóÇú ãöäú Ïõæäöåö ÅöáóåðÇ áøóÞóÏú ÞõáúäóÇ ÅöÐðÇ ÔóØóØðÇ (14) åóÄõáÇóÁö ÞóæúãõäóÇ ÇöÊøóÎóÐõæÇú ãöäú Ïõæäöåö Áó ÂáöåóÉð áøóæúáÇó íóÇÊõæäó Úóáóíúåöã ÈöÓõáúØóÇäò Èóíøöäò óãóäó ÂÙúáóãõ ãöãøóäö ÇöúÊóÑóì Úóáóì Âááøóåö ßóÐöÈðÇ(15) æó öÅÐö ÇöÚúÊóÒóáúÊõãõæåõãú æó ãóÇ íóÚúÈõÏõæäó ÅöáÇøó Âááøóåó óúæõ Çú Åöáóì Çóáúßóåúö íóäúÔõÑú áóßõãú ÑóÈøõßõãú ãöäú ÑóÍúãóÊöåö æó íõåóíøöÆú áóßõãú ãöäú ÂãúÑößõãú ãøóÑúöÞðÇ (16) æó ÊóÑóì ÂáÔøóãúÓó ÅöÐóÇ ØóáóÚóÊú ÊøóÒøóÇæóÑõ Úóäú ßóåúöåöãú ÐóÇÊó Çáíóãöíäö æó ÅöÐóÇ ÛóÑóÈóÊú ÊóÞúÑöÖõåõãú ÐóÇÊó ÂáÔøöãóÇáö æó åõãú öí óÌúæóÉò ãöäúåõ Ðóáößó ãöäú ÂíóÇÊö Çöááøóåö ãóäú íøóåúÏö Çöááøóåõ óåõæó ÂáãõåúÊóÏö æó ãóäú íõÖúáöáú óáóäú ÊóÌöÏó ãøõÑúÔöÏðÇ(17). áóåõ æóáöíøðÇ

Plus tard, les grottes ont représenté pour beaucoup de savants et Imam la Mosquée où il est bon de s'y rendre afin de se retirer de ce monde matérialiste et donner ainsi à leur âme sa nourriture spirituelle.

2-3- L'homme Algérien :

*Les enfumades et les emmurements des grottes pendant la colonisation française de l'Algérie.

2-4- Les historiens :

Elle signifie la rédaction de la célèbre Muqadima d'Ibn Khaldoun, dont elle était réalisée dans une des grottes de l'ouest algérien (la grotte de Sidi Khaled). La Muqadima est le témoin du déclin de la civilisation musulmane et le début de la colonisation de l'Afrique par les espagnols et les européens.

Cette Muqadima qu'elle a fait d'Ibn Khaldoun selon Arnold Toynbee : « il a conçu et formulé une philosophie de l'Histoire qui est sans doute le plus grand travail qui ait jamais été créé par aucun esprit dans aucun temps et dans aucun pays »

2-5- Un préhistorien :

Pour l'homme préhistorien l'intérêt de l'étude des sites préhistoriques et paléontologiques des grottes a été montré après la découverte des spécimens d'Ursus speleus en 1774, par l'Allemand Esper, dans une grotte de Westphalie

C'est en effet dans les dépôts d'alluvions dans les grottes que la contemporanéité de l'homme et d'espèces disparues est établie par Édouard Lartet, au 19^e siècle, et qu'ont été instaurées la chronologie et la classification des industries du paléolithique ( ANONYME 1, 2001 )

Pour le spéléologue, les grottes constituent son terrain d'étude. Pour cela il recouvre de nombreux domaines scientifiques dont la finalité est la connaissance de ce milieu spécifique, le monde souterrain.

La grotte pour eux est un système apparaît quand un courant d'eau chargé de gaz carbonique creuse une roche calcaire fissurée, le plus souvent par des contraintes (tectonique des plaques par exemple). Cette dissolution du calcaire forme les grottes. Le bicarbonate de calcium Ca (HCO3)2 est un composant en équilibre : quand la température de l'eau ou la pression partielle de l'oxyde de carbone CO2 diminuent l'équilibre chimique évolue dans le sens de la précipitation « la formation de concrétions » (DUBOIS et GRELLET, 1997).

Pour le géologue, les concrétions sédimentaires renseignent sur les climats et les séismes anciens (DUBOIS et GRELLET, 1997).

Pour un biospéléologue ; les grottes, et la vie qui s'est développée dans ce milieu très particulier, ont reçu un intérêt grandissant depuis quelques décennies pour des recherches faunistiques, génétique et physiologique. Cette recherche (la biospéléologie) est un domaine scientifique a connue la lumière grâce à la découverte d'une espèce cavernicole Thyphlocirolana moraguesi en 1904 par E.G.Racovitza (GRAUR, 2001).

Les recherches faites avant celles du savant roumain n'attribuaient au milieu souterrain que peu de chances d'existence de la vie. Partant de la découverte du cavernicole dans la grotte de Cueva del Drach, il a cherché avec son collègue R. Jeannel à démontrer, et il l'a réussi d'une façon brillante, que la faune des cavernes est beaucoup plus riche et variée que l'on pensait et que son étude peut aboutir à des résultats intéressantes (GRAUR, 2001).

En 1986, une découverte remarquable a été retenu l'attention : un réseau souterrain étanche de 240m et à 25m de profondeur en Roumanie, partiellement noyé, abritant une faune d'invertébrés isolés depuis plusieurs millions d'années, comprenant 46 espèces dont 28 nouvelles, vivant dans une atmosphère pauvre en oxygène (POMEROL et RENARD, 1997).

Les animaux cavernicoles sont classés en trois catégories : les troglophiles, espèces fréquentes dans les grottes ; les trogloxènes, hôtes occasionnelles des cavernes ; les troglobies, espèces permanents des cavernes (JEANNEL, 1937 ; TERCAFS, 1997).

Sur les parois stalagmitées vivent de nombreuses espèces troglobies appartenant surtout aux insectes. Ils présentent des caractères morphologiques en rapport avec leur adaptation à ce milieu .Tous sont aveugles, dépigmentés, de taille plus grande que les espèces similaires du domaine épigé ; leurs formes sont grêles, les membres démesurément allongés (JEANNEL, 1937; TERCAFS, 1997).

Les troglobies aquatiques ; se trouvent dans les systèmes aquifères endogènes ; on ne les rencontre que dans les systèmes hydrographiques d'une certaine importance. Les crustacés sont les plus représenté (des crevettes aveugles) ; les vertébrées dont le protée le cavernicole le plus anciennement décrit (1768) ; des poissons aveugles (JEANNEL, 1937; TERCAFS, 1997) (Fig. 1).

Les guanobies constituent un autre groupe d'animaux cavernicole (insectes, acariens, vers, mollusque...etc.) qu'ils ne présentent aucun caractère d'adaptation au milieu souterrain : tous sont pigmentés, ailés, pourvus d'yeux (JEANNEL, 1937).

2-8- Un microbiologiste :

Pour un microbiologiste l'étude de la microflore des cavernes a plusieurs voies :

a- Recherche des peuplements permanents des sédiments de grottes et étudier leurs activités métaboliques ; comme il a dit Caumartin (1959) « Un sédiment de grotte est abondamment et originalement peuplé ; il n'est jamais stérile ; les sondages effectués dans des masses sédimentaires importantes ont montré qu'il est illusoire d'espérer atteindre une zone rigoureusement stérile », et il a ajouté « des organismes inférieurs, non photosynthétisants et non hétérotrophes, ferrobactériales et thiobactériales par exemple, peuvent parfaitement tirer d'un milieu minéral carbonaté ou sulfuré bien équilibré, l'énergie nécessaire à leur métabolisme ».

b- Isolement de la flore bactérienne des cavernes (sol, eau et air) et l'étude de l'origine de cette flore. D'après Mason-Williams et Benson-Evans, (1967) « la composition de la flore bactérienne de l'air des cavernes est liée aux facteurs externe comme les excréments animales, les vêtements et les torrents »

c- L'analyse microbiologique des cavernes afin d'évaluer l'effet des microorganismes sur la détérioration des dessins d'homme préhistorique (ARROYO et al, 1997).

2-9- Un botaniste :

Maheu (1906) a constaté, en examinant la flore des cavernes, qu'elle est restreinte. Elle l'est d'autant plus qu'on s'éloigne davantage des conditions normales de la surface

L'ordre de décroissance de la flore à partir de la surface du sol est identique à la classification de la série végétal ce sont d'abord les Phanérogames qui disparaissent, les Cryptogames vasculaires ensuite, puis les Muscinées. Le facteur le plus important qui influence sur cette flore est la lumière (MAHEU, 1906 ; MASON-WILLIAMS et BENSON-EVANS, 1967). Sous ce rapport, elle peut se diviser en quatre zones :

Ces deux zones, mieux éclairées, sont abondamment pourvues de végétaux, notamment de Mousses.

c- Zone du fond des gouffres (obscurité partielle) : Elle montre un certain nombre d'espèces généralement modifiées ;

d- Zone des galeries (obscurité absolue) : Elle n'est habitée que par certaines Algues pauvre en chlorophylle.

2-10- Un mycologue :

Tandis que depuis fort longtemps la faune des cavernes était étudiée ; la flore souterraine était par contre à peu prés délaissée (VALVASOR, 1689). C'est la fin du 16^iémesiècle qu' a connu la première étude sérieuse des champignons cavernicoles ; Scopoli (1760) les décrivit et fus frappé par leurs déformations : « elle prend la forme de Lithophytes et des coraux du fond de la mer ».

Depuis cette époque, les recherches se sont multipliées ; la curiosité des mycologues fut mise en éveil par les champignons nombreuses, déformées, d'aspect et de structure bizarres, qui peuplent les parois souterraines des galeries de mines. C'est de cette époque que datent les célèbres travaux de Bulliard (1791), Humboldt (1793) et de Bolton (1795) qui fourmillent déjà d'observations intéressantes (MAHEU, 1906).

Par ailleurs plusieurs chercheurs (De Candolle, Charneaux, Fries, Roumeguére) ont été occupés par l'étude des champignons cavernicoles en les comparant aux espèces de la surface (MAHEU, 1906).

Une étude systématique des espèces souterraines par Maheu (1906) a classé les espèces récoltée dans deux embranchement Ascomycètes et Basidiomycètes et dont certaines d'entre eux sont classé actuellement parmi les Deutéromycètes.

*Ascomycètes : Ces champignons sont représentés par des espèces peu variées.

- Isaria guignardi : Espèce a été trouvée en parasite sur un insecte « Quedius mesomelinus » récolté à l'obscurité totale dans les catacombes de Paris, sous la rue de la Tombe-Issoire. (Fig 2).

- Hypocrea : Ce genre présente un dimorphisme (ATKINSTON, 1891) dont sa forme conidienne Trichoderma est la plus répondue dans les cavités souterraines par rapport a l'autre forme ; une espèce de ce même genre rapprochant à Hypocrea rufa a été trouvée dans les mines de Loire et dont sa forme conidienne Trichoderma viride se trouve dans la plupart des mines ou cavernes.

*Basidiomycètes : Ils sont plus nombreux que les Actinomycètes et parmi eux ce sont les espèces porées qui dominent ; dont Polyporus sulfureus est une des plus répandues.

Dans les classifications actuelles, certains genres ont été classés autrement comme le cas du « Isaria », dont elle est classée d'après (BARNETT et BARRY, 1972) parmi les Deutéromycètes.

Hypocrea/ Trichoderma appartient aux Sous-embranchement des Ascomycètes, Ordre des Hypocreales, Famille des Hypocreaceae (CHAVERRI et SAMUELS, 2004).

Plus des travaux de Maheu ; d'autre recherches ont été réalisées afin d'étudier les champignons cavernicoles :

Went (1969) a trouvé régulièrement l'espèce Cephalosporium lamellaecola dans les extrémités des stalactites. Ses hyphes prennent une part active à la croissance épitaxique des cristaux de calcite.

Fig. 2. Isaria guignardi sur Quedius mesomelinus. 1. Touffes mycéliennes sur la partie dorsale de l'animal. 2. Localisation des filaments fertiles et mycéliens. 3. Eléments coremiés portant les conidiophores. Gr. 800 diam. 4. Constitution des hyphes aux points d'insertion sur la cuticule du Coléoptère. Gr. 800 diam. 5. Une des touffes supérieures. Gr. 20 diam (MAHEU, 1906).

L'analyse et l'étude des moisissures responsable de la biodétérioration des dessins préhistoriques des cavernes (CANEVA et SALVADORI, 1988 ; ARROYO et al, 1997).

3- De nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques :

L'obtention de nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques d'après Bouchet et al (1999) nécessite :

- Un grand échantillonnage à partir d'un milieu naturel : l'air, sol, d'eau douce ou salée, provenant des contrées les plus diversifiées, allant des sommets montagneux aux profondeur des océans.

- Les études de criblage primaire « screening » en utilisant des souches cibles (bactérie ou champignons) ; parfois on passe à un deuxième criblage.

- Isolement, purification et identification des molécules actives par le biais des différentes techniques de la chimie extractive.

CHAPITRE II

MATERIELS ET METHODES

1- LE SITE D'ETUDE :

Le village Aïn Fezza, le lieu de nos prélèvements, se situe à 12 Km à l'est du centre ville de Tlemcen, à altitude 860 m par rapport au niveau de mer. Son ancien nom Ifri désigne sa nature montagneux et qui englobe plusieurs grottes et cours d'eau.

*Station 1 « Ghar Sokhrane » : Grotte nom explorée, elle était utilisée comme un refuge des combattants de libération pendant la colonisation française dont son ouverture était explosée durant cette période. Actuellement, l'accès à cette grotte est devenu difficile à cause de cet incident.

Cette grotte est liée à l'histoire d'un combattant de libération qu'était jeté dans cette grotte, après qu'il était torturé par l'armé française, après 12 jours de jeûne et de gaz toxique envoyé par l'armé, il était sorti avec un état stable.

*Station 2 « Ghar d'Ouled Djaâdi » : Elle était exploitée auparavant pour l'utilisation humaine (l'élevage des bétails, stockage des fourrages). Elle a une longueur qui dépasse 20 m et une largeur 5 m et une profondeur géologique 3 m.

*Station 3 « Ghar Beni Aâd » : La plus grande grotte visitable en monde, elle est caractérisé par une longueur de 700 m, et une profondeur qui dépasse 18 m, situé à 7 Km du sud-est du chef-lieu de la commune de Aïn Fezza.

Cette grotte s'insère dans un relief montagneux chahuté avec un affleurement rocheux très net. De l'intérieur, c'est une importante cavité creusée dans la roche calcaire du massif de Tlemcen et qui s'incruste dans un ensemble de jurassique supérieur (dolomie) donnant ainsi une gamme de formes karstiques.

Elle existe depuis 65000 ans, elle a été découverte par les berbères une ou deux années avant Jésus Christ. Pendant la guerre de libération algérienne, elle a servi comme un refuge des combattants qui accédaient non pas par l'ouverture principale mais par une faille qui fut bombardée par la suite. Durant les années 70, elle était l'attraction principale des touristes où la fréquentation a atteint 4500 v/an en 1971 (ANONYME 3, 2006).

Fig. 3. Situation des stations de prélèvements. 1. Ghar Sokhrane. 2. Ghar d'Ouled Djaâdi. Grottes. Ghar Beni Aâd.

2- MATERIELS ET METHODES :

2-1- Isolement et identification :

2-1-1- Echantillonnage :

On a réalisé au niveau de chaque station, 1 à 3 points de prélèvements « P » au moyen de 10 échantillons par point. Ces prélèvements effectués entre le mois de Novembre et Mars (2004-2005) ont été pris à partir du sol et des concrétions sédimentaires.

Ceux du sol, ont été effectués par des spatules stériles ; et ceux des concrétions sédimentaires, par frottement à la surface avec des écouvillons stériles.

2-1-2- Examen direct :

Cet examen a été réalisé a l'oeil nue au moment du prélèvement, afin de détecter la présence du mycélium au niveau des points de prélèvement, ainsi d'autre caractéristiques (la flore, la faune...etc.).

2-1-3- Isolement et sélection des souches :

a- Milieu de culture :

Afin d'inhiber la croissance des bactéries, ainsi ralentir la croissance de certains champignons envahissantes on a utilisé des milieux additionnés d' Acide lactique, Rose Bengal, Amphotericine B et Ampicilline.

La préparation de ces milieux a été effectuée en référant à Ramirez (1982), Botton et al (1990) et Khelil (1997).

b- La mise en culture :

On a additionné 5 g de chaque échantillon de sol à 45 ml d'eau physiologie homogénéisé ensuite, pendant 30 mn à l'aide d'un agitateur magnétique, puis dilué de 10 en 10 ( 10^-2 à 10^-3 ).

Les solutions mères des échantillons des concrétions sédimentaires, ont été préparées par l'imprégnation des écouvillons dans 7 ml d'eau physiologie, agitées ensuite, pendant 30 mn à l'aide d'un Vortex.

On a étalé 1 ml des suspensions sur les milieux d'isolements précédemment coulés en boites de Pétri. L'incubation a été effectuée à 25°C pendant 7 à 15 jours.

c- Purification et conservation :

Les souches isolées ont été purifiées par repiquage successif sur le même milieu d'isolement. Les souches pures ont été repiquées sur le même milieu coulé en pente dans des tubes à vis, puis conservés à 4°C.

2-1-4- Identification :

a- Identification préliminaire :

Les souches pures ont été caractérisées par, leurs aspects culturaux et morphologiques.

· Les caractéristiques culturaux : Ils ont été déterminés par le diamètre des colonies, la couleur, la forme et la sécrétion des pigments diffusible.

· Les caractéristiques morphologiques : Ils ont été déterminés par la technique de microculture; qui consiste à cultiver les moisissures sur des lames menées de petits carrés de PDA_a solidifié et les couvrir par des lamelles, ensuite les conditionner dans une chambre stérile et humide et les incuber à 25°C pendant 3 à 5 jours. Après l'incubation, on effectue les observations des lames grâce à un microscope de type Zeiss au grossissement × 10, × 40 et × 100.

b- Identification de l'espèce :

Afin d'identifier l'espèce de certaines souches importantes dans notre travail, on a utilisé deux techniques :

* Technique1 : C'est la technique de « Single Spore » décrit par Ramirez (1982).

Cette méthode est basée sur la relation entre l'a_wdu milieu de culture et la température d'incubation. Elle consiste à l'inoculation des spores de cultures jeunes dans des tubes à hémolyse contenant une suspension à base de 0,2 % d'Agar et 0,05 ml de Tween 80. La culture, ensuite, se fait sur quatre milieux de cultures différents.

Les ensemencements ont été effectués comme indiquée dans le schéma ci dessous :

Après 14 jours d'incubation, les caractéristiques culturaux du souche à identifier sur différents milieux ont été comparées aux guide de Ramirez (1982) afin d'apprécier l'espèce qu'elle appartienne.

* Technique 2 : Cette technique était utilisée pour certaines souches afin de donner plus d'information sur leurs caractéristiques culturaux suivant la composition du milieu de culture et le temps d'incubation. Pour la réaliser, on a utilisé deux méthodes :

- Culture en boite de Pétri : Elle consiste à l'inoculation des spores de cultures jeunes dans des tubes à hémolyse contenant une suspension à base de 0,2 % d'Agar et 0,05 ml de Tween 80. La culture, ensuite, se fait sur sept milieux de culture :

* YESA (Yeast Extract Starch Agar): Ce milieu était préparé dans notre laboratoire à base de deux milieux de culture YEA et YSA. Il n'a aucune référence bibliographique, c'est le résultat de notre travail.

Les ensemencements ont été effectués par un seul point. Après 14 jours d'incubation à 25°C, on a noté les caractéristiques culturaux sur chaque milieu de culture.

-Culture en récipient : L'étude des caractéristiques culturaux a été suivie sur le milieu YSA (250 ml du milieu dans un récipient de 2 litre) pendant 30 jours à température fixe 25°c.

- Identification de l'espèce : Elle était réalisée à l'aide du « Muséum National d'Histoire Naturelle. France ».

2-2- Test d'antibiose :

2-2-1- Microorganisme cible :

Dans notre travail, on a utilisé comme microorganisme cible neuf souches bactériennes dont trois provient du laboratoire « Antibiotiques, Antifongique : Physico-chimie, Synthèse et Activité biologique » (Tlemcen).

Cependant, que les autres souches provient du laboratoire « Produits Naturels » (Tlemcen).

2-2-2- Préparation de l'inoculum bactérien :

La préparation d'un lot de « Semences d'essai » des souches bactériennes a été réalisée sur Gélose nutritive en tubes inclinés et conservés à 4°C. Vingt quatre heures avant le test d'antibiose, on a effectué des précultures en Bouillon nutritif à partir des souches bactériennes conservées. Ces précultures ont été incubées à 37°C.

Lors des essais, ces précultures sert à la préparation des suspensions bactériennes dans l'eau physiologie et ajustées, ensuite, à l'aide d'un Spectrophotomètre de type (JEN WAY, 6405 UV/Vis), à 1×10⁸ bactéries /ml par mesure de la transmission optique à 640 nm (DE BILLERBECK, 2000).

2-2-3- La réalisation du test :

Le test d'antibiose dépend des résultats d'isolement et d'identification des champignons, qu'ils nous ont posés de faire deux méthodes selon les souches isolées :

La méthode consiste à inoculer les champignons dans un récipient contenant 100 ml du milieu YSA. Après 20 jours d'incubation à 25°C, les filaments aérien ont été récolté et homogénéisé dans 50 ml d'eau distillé stérile. Trois disques de papier filtre ont été imprégnés de cette suspension et déposé, ensuite, sur le milieu Mueller Hinton ensemencé préalablement par une suspension bactérienne (Pseudomonas aeruginosa (2) ). Après incubation à 37°C pendant 24 heures la lecture était effectuée comme la première méthode.

2-3- Production des substances antibactériennes :

Cette partie a été effectuée pour une seule souche fongique sélectionnée en fonction des résultats précédents (isolement, identification et test d'antibiose).

Afin de tester la production des antibiotiques de cette souche, qu'ils soient des antibiotiques exogènes ou endogènes, on a utilisé le milieu de culture YESL_a (Yeast Extract Starch Liquid acidifié) et la méthode suivante :

Tout d'abord, on a désinfecté le récipient du culture qui est de volume 4 l ; on a placé, ensuite, les supports en verre (pipette pasteur) de manière qu'il forme un support du mycélium, puis on a désinfecté l'ensemble (le récipient et les supports) et enfin on a versé 2000 ml du milieu de culture YESL_a.

A ce moment, on a préparé notre inoculum en utilisant la technique de support cellulosique de spores décrit par De Biller Beck (2000).

On a coupé un fil de coton commercialisée en 10 morceaux de 60 cm de long, on les a placés ensuite, dans une boite en verre et on les a stérilisés à l'autoclave pendant 20 mn.

Après la stérilisation, 30 ml de la suspension fongique ajustée à (1×10⁸spore/ml) en utilisant la cellule de Thomas a été versée dans la boite de Pétri, ensuite l'ensemble a subit un séchage pendant deux heure sous hotte à flux laminaire de type (Cytostar 13164).

En denier lieu, les supports de spores ont été placés dans le récipient de manière qu'ils soient immergés. L'incubation a été effectuée à température ambiante.

Cette méthode était réussite après plusieurs essais, en améliorant à chaque fois la technique par l'analyse des résultats de chaque essai. En plus, elle était réalisée avant l'identification de l'espèce de cette souche par le « Muséum National d'Histoire Naturelle. France ».

2-3-1- Activité antibactérienne du surnageant :

Elle a été réalisée par la méthode de disque imprégné du surnageant décrite dans le criblage primaire, en utilisant comme bactéries cibles (les neuf) bactéries citées précédemment et le milieu de culture Mueller Hinton.

2-3-2- Activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) :

Après trois mois d'incubation, le mycélium total a subi des extractions par les solvants organiques polaire et apolaire (éthanol et éther de pétrole éthylique), afin de tester l'activité antibactérienne du mycélium aérien et celle du substrat.

· Extraction par l'éthanol : Cette méthode a été décrite par Ravindra et al (2004).

· Extraction par l'éther de pétrole éthylique : Cette méthode a été inspirée de la méthode décrite par Ravindra et al (2004).

· Le test d'antibiose : On a solubilisé tout d'abord les résidus par 5 ml du même solvant d'extraction ensuite, on a réalisé ce test en utilisant les neufs bactéries-cible et la méthode de disque imprégné. Le control négative (l'éther de pétrole éthylique et l'éthanol).

CHAPITRE III

RESULTATS ET INTERPRETATIONS

1- Description des stations de prélèvement :

Le tableau 1 et la figure 4 illustrent les caractéristiques de chaque station (la faune, la flore, la mycoflore, la profondeur et la surface des points de prélèvement).

Le choix des points de prélèvements de la station 3 était effectué en fonction de l'origine du sol tapissant. On a retenue dans nos prélèvements seulement ceux qui ont un sol tapissant endogène (propre à la grotte).

Station	Point de prélèvement « P_x »	profondeur	Surface Lar/lon	Faune	Flore	mycoflore
Station 1	P	10 m	3m/ 10m	Insectes et chauve-souris	Les algues (l'entrée)	-
Station 2	P	10 m	5m/ 20m	Porc-épic	-Des arbres (l'entrée). -Détritus végétaux et fourrages (l'intérieur)	-
Station 3	P₁	76 m	10m/ 10m	-	-	-
	P₂	185 m		-		Tapis mycélien foncé en Décembre et atténué en Mars
	P₃	280 m		-		-
	P₄	60 m		Pigeons		-

* Les points de prélèvements (P₁, P₂, P₃, P₄) ont été situés en empruntant le chemin aménagé à l'intérieur de la grotte. P₁à gauche du chemin supérieur. P₂, P₃ et P₄à droite du chemin inférieur.

Fig.4. Les stations de prélèvement. A, B et C. Station 1 (Ghar Sokhrane). D. Point de prélèvement P₂de la station 3 (Ghar Beni Aâd). E. Un échantillon du point de prélèvement P₂de la station 3. F. Station 2 (entrée).

2- Isolement et dénombrement :

Afin d'atteindre notre objectif (l'isolement des champignons producteurs d'antibiotiques), on a limité notre étude sur le genre Penicillium.

Après l'étude des caractéristiques culturaux et morphologiques des souches isolées, 152 souches de Penicillium ont été sélectionnées (Tableau 2).

Mois de prélèvement	Station	Point de prélèvement	Type de substrat et dilution	Nombre de souche
Novembre	Station 1	P	Sol (10^-1)	15
	Station 2			3
Décembre	Station 1	P	Sol (10^-1)	37
	Station 3	P₁		4
		P₂		25
		P₃		7
Mars	Station 3	P₂	Sol (10^-1)	15
			Concrétion	30
		P₃	Concrétion	12
		P₄	Sol (10^-1)	0
			Concrétion	3

D'après le tableau, on a constaté que le nombre de souche de « Penicillium » isolé du sol était plus élevé au niveau du station 1 ; 15 isolat en Novembre et 37 isolat en Décembre . Cependant le nombre le plus faible est celui du station 2 (3 isolat).

Concernant la station 3, le nombre de souche de « Penicillium » le plus élevé était isolé à partir des échantillons de sol du point de prélèvement P₂ dont on a isolé 25 souches en mois de Décembre et 15 souches en mois de Mars.

Les résultats d'isolement de « Penicillium » aux niveau du P₄a révélé l'absence total d'isolats.

A propos des souches de « Penicillium » isolées des concrétions sédimentaires, on a remarqué que le nombre le plus élevé était à partir des échantillons du point de prélèvement P₂(30 isolats) suivie par P₃(12 isolats) et en dernier lieu P₄(3 isolats).

En résumé, on a constaté que la station 1 et le point de prélèvement P₂de la station 3 ont été la source principale de nos isolats de « Penicillium ».

3- La souche 23 B :

Au cour de la sélection des souches de « Penicillium », on était attiré par une des souches isolées qu'on l'avait vue pour la première fois dans notre laboratoire, la souche 23 B, alors on a essayé de l'identifier en étudiant les caractéristiques culturaux (Technique 2) et morphologiques (Technique de microculture).

3-1- Origine d'isolement :

La présence de cette souche dans nos isolements a été répétée dans plusieurs échantillons avec les deux types de substrats (sol et concrétion), pour les deux prélèvement (Décembre et Mars) et en utilisant différents milieux d'isolement.

Les résultats d'isolements de cette souche ont révélées sa présence seulement au niveau du point de prélèvement P₂de la station 3 (Tableau 3).

3-2- Identification :

L'observation microscopique des lames (Fig. 5), nous a permis d'observer au grossissement × 100:

* Les hyphes aériens s'allonge et se condense, alors les conidiophores sont érigés en faisceaux.

* Les cellules conidiogenese (1 à 2 cellule) sont portées par une cellule légèrement enflée.

En étudiant les caractéristiques culturaux, on a remarqué que la coloration et le diamètre du colonie, la couleur des hyphes aériens, leur largeur et leur longueur diffère d'un milieu à l'autre (Tableau 4 et Fig. 6).

En plus, on a constaté que cette souche a donné une croissance importante sur milieu YESA par rapport aux autres milieux de culture.

Le milieu de culture	Diamètre du colonie (mm)	Couleur du substrat	Couleur des hyphes aériens	Autre caractéristique
ISP₂	25	Rose	Rose	Des hyphes aériens agrégés mince et très condensés
YEA	35	Beige	Blanche	Des hyphes aériens agrégés très minces, la longueur 6mm, arrangées en cercle.
MEA	70	Marron	Blanche	Des hyphes aériens agrégés très courts
MYEA	42	Marron	Blanche	Des hyphes aériens agrégés condensé au centre du colonie
AFPA	22	Marron	Marron	Des hyphes aériens agrégés non observé
YSA	35	Beige	Blanche	Des hyphes aériens agrégés dressés, recouvert la colonie, longueur 7mm
YSEA	40	Beige	Blanche	colonie recouverte d'hyphes aériens agrégés embranchés, ont une largeur1mm, une longueur 10mm

La culture en récipient, nous a permis de suivre les caractéristiques de la souche 23B durant un mois (Fig. 6).

- Après une semaine de l'ensemencement, les hyphes aériens ont une longueur de 8 mm, ensuite ils donnent des embranchements 1 à 3 d'un seul point.

- Après un mois, les hyphes aériens agrégés ont dépassé 55 mm de longueur.

- on a révélé aussi la sécrétion d'exsudat et l'absence d'une odeur caractéristique.

3-3- Identification de l'espèce :

Après cette étude réalisé dans notre laboratoire « Produits naturelles », on est passé à un autre laboratoire afin d'identifier l'espèce de cette souche « Muséum National d'Histoire Naturelle. France ».

L'espèce est alors « Beauveria felina » (Decandolle : Fries) J.W Carmichael (autrefois Isaria felina). La Lettre du muséum.

Cette lettre a été accompagnée par un article qui décrit les caractéristiques de cette espèce.

Notre recherche bibliographique, a révélé que cette espèce appartient à la famille des « Stilbaceae », caractérisée par l'association des conidiophores en un synnemata , ordre des « Moniliales », classe des « Hyphomycetes », groupe « Deuteromycotina », Division 3 des champignons « Amastigomycota »(Barnett et Barry, 1972 ).

4- Test d'antibiose :

4-1- Les souches de Penicillium :

Afin de réaliser le test d'antibiose des souches de Penicillium on a utilisé la méthode 1.

4-1-1- Criblage primaire :

Parmi 152 souches isolées, on a réalisé le criblage primaire sur seulement 80 souches.

Les résultats de ce criblage ont montrées que 38 souches présentent une activité contre une des trois bactéries-cible (Escherichia coli (1), Pseudomonas aeruginosa (2) et Staphylococcus aureus (3)). Le tableau 5 représente les résultats du criblage.

Bactéries -cible	Zone d'inhibition	Nombre de souches
*Escherichia coli* (1)	Groupe (1)	7
	Groupe (2)	4
	Groupe (3)	1
*Pseudomonas aeruginosa* (2)	Groupe (1)	6
	Groupe (2)	14
	Groupe (3)	2
*Staphylococcus aureus* (3)	Groupe (1)	2
	Groupe (2)	3
	Groupe (3)	0

*Les diamètres des zone d'inhibition sont englobés dans des groupes :groupe (1)de 6 mm à 10 mm ; groupe (2) de 10 mm à 14 mm ; le groupe (3) de 14 mm à 16 mm .

D'après le tableau, on a constaté que la plupart des souches de Penicillium testées ont exercées une activité inhibitrice entre 11 mm et 14 mm dont 14 souches uniquement dans le cas du bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa.

Le nombre des souches du groupe (1) était moins important par rapport au groupe (2).

D'après ce même tableau, on a remarqué que certaines souches ont présenté une activité importante « le groupe (3) » dont la zone d'inhibition était entre 14 mm et 16 mm. Pour cette raison, on a essayé de présenter l'origine d'isolement de ces souches (Tableau 6).

Souche	Station	Point de prélèvement	Le type de substrat	Le mois de prélèvement	La zone d'inhibition et bactérie cible
31S₂	Station 1	P	Sol	Décembre	15 mm Pseudomonas aeruginosa
27G₁	Station 3	P₂	Sol	Décembre	16mm Pseudomonas aeruginosa
6G₁	Station 3	P₂	Sol	Décembre	16mm Escherichia coli

D'après le tableau, on a remarqué que les souches du groupe (3) proviennent tous des prélèvements du sol du mois de Décembre, et dont l'origine du prélèvement était différent : la souche 31S₂ provient du station 1 et les deux autres souches 27G₁et 12 G₁proviennent du point de prélèvement P₂de la station 3.

4-1-2- Criblage secondaire :

Nous avons retenu pour ce test 14 souches de Penicillium révélant une activité antibactérienne plus ou moins important par rapport aux autres souches testées dans le premier criblage.

Les résultats du deuxième criblage ont montré que seules 7 souches ont présenté une activité antibactérienne contre aux moins une bactérie-cible.

Les résultats du premier et du deuxième criblage de ces souches sont illustrés dans le tableau 7.

Souche	Criblage primaire			Criblage secondaire
Souche	1	2	3	1'	2	3	4	5	6	7	8	9
18S₁	8	/	/	-	-	8	-	-	-	-	-	-
29S₂	/	14	/	-	-	-	-	-	-	8	15	20
14G₁	/	/	11	-	9	8	-	-	-	-	11	18
27G₁	/	16	/	-	-	-	-	-	-	-	14	16
32G₁	/	13	/	-	-	11	-	-	-	-	11	-
34G₁	/	14	/	9	-	8	7	7	-	-	10	8
40G₁	/	10	/	-	-	-	-	-	-	-	8	14

1 : Escherichia coli ; 2 : Pseudomonas aeruginosa ; 3 : Staphylococcus aureus ; 1' : Escherichia coli ; 4 : Citrobacter freundï ; 5: Enterobacter cloacea ; 6 : Klebsiella pneumoneae ; 7 : Listeria monocytogenes; 8 : Proteus mirabilis ; 9 : Salmonella typhi.

* Les chiffres indiquent le diamètre des zones d'inhibition exprimées en mm y compris celui du disque.

D'après les résultats du deuxième criblage (Tableau 7 et Fig. 7), on a constaté que la plupart des souches testées ont exercées une activité inhibitrice contre les deux bactéries-cible Salmonella typhi et Proteus mirabilis.

Dans le cas du bactérie-cible Salmonella typhi, l'activité antibactérienne la plus importante était observée chez la souche 29S₂(20 mm), suivie par 14G₁, 27G₁, 40G₁et en dernier lieu 34G₁. Les souches 32G₁et 18S₁ n'ont exhibées aucune activité contre cette bactérie-cible.

La zone d'inhibition provoquée par la souche 29S₂contre la bactérie-cible Proteus mirabilis (15 mm) était aussi la plus importante par rapport aux autres souches de Penicillium testées dont 27G₁avec une zone d'inhibition (14 mm), suivie par 14G₁(11 mm), 32G1 (11 mm), 34G1(10 mm) et en dernier lieu 40G₁(8 mm). L'activité antibactérienne du 18S₁n'était pas exprimée.

Cependant, l'activité antibactérienne contre les autres bactéries- cible Escherichia coli (1'), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundï, Enterobacter cloacea, Klebsiella pneumoneae et Listeria monocytogenes était faible (7 mm à 9 mm) ou non exprimée. Seul l'activité antibactérienne de la souche 32G1 contre Staphylococcus aureus qu'elle était remarquable (11 mm).

En comparant ces résultats à ceux du premier criblage, on a remarqué que les zones d'inhibitions obtenues durant le deuxième criblage étaient nettement inférieur a ceux obtenues en criblage primaire.

A titre d'exemple, les zones d'inhibitions des souches de Penicillium contre la bactérie- cible Pseudomonas aeruginosa en premier criblage étaient entre 10 mm et 16 mm, tandis qu'en deuxième criblage la plupart des zones d'inhibitions des mêmes souches ont été non exprimées.

En résumé, le premier et le deuxième criblage nous ont permis à révéler une activité antibactérienne plus ou moins important chez la plupart des souches dont certaines d'entre eux ont présentées une activité importante autant en premier criblage qu'en deuxième (la souche 27G₁) ; tandis que d'autre ont révélées une activité importante dans le criblage primaire et une activité faible ou négligeable en deuxième criblage.

4-1-3- Identification de la souche 27G1 :

Du fait de l'importance de l'activité antibactérienne de la souche 27G₁, il nous a paru utile d'identifier l'espèce de cette souche en utilisant La technique « 1».

Cette technique, nous a permis de rapprocher la souche à l'espèce ....(Tableau 8 et Fig. 10)

Les souches	Milieux de culture et température d'incubation
	CDA 25°C	CYA		G25N 25°C	MEA 25°C
		37°C	4°C
27G₁	40 mm		30 mm

Fig. 7. L'activité antibactérienne de la souche 29S₂ dans le deuxième criblage_.A. Contre la bactérie-cible Proteus mirabilis (8). B. Contre la bactérie-cible Salmonella typhi (9).

Fig. 8. Aspect cultural de la souche 27 G₁.A. Sur le milieu CYA (4°C). B. Sur le milieu CDA (25°C).

4-2- Beauveria felina :

Le test d'antibiose de la souche 23 B identifiée précédemment comme l'espèce Beauveria felina, a été effectué selon la méthode 2.

Après 20 jours d'incubation de cette souche, 330 mg de filaments ont été récoltés et homogénéisés dans 50 ml d'eau distillée stérile. Le test d'antibiose de cette suspension contre la bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa a révélé une zone d'inhibition d'une valeur de 14mm.

5- PRODUCTION DES substances antibactérienneS:

Plus des résultats d'isolements et d'identification intéressante de la souche 23B, nous avons montré dans le test d'antibiose que les filament aériens agrégés (ou synnemata) de cette souche ont exhibés une activité antibactérienne importante contre la bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa.

De ce fait, on a essayé dans cette partie d'étudier en même temps l'activité antibactérienne du surnageant et celle du mycélium avec ses deux formes (aérien agrégés et substrat) en utilisant la culture en milieu liquide (Fig. 9).

5-1- Activité antibactérienne du surnageant :

L'étude de l'activité antibactérienne du surnageant contre les neuf bactéries- cible au cours de trois mois d'incubation, n'a révélée aucune activité notable.

Fig.9. Beauveria felina sur milieu liquide. A. Vue général. B.1. Les hyphes aériens agrégés.2. Le mycélium du substrat.

5-2- Activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) :

Les résultats d'activités antibactériennes du mycélium (aérien et substrat) après les opérations d'extractions sont illustrées dans le tableau 9.

Tableau 9 : L'activité antibactérienne des extraits étheriques et éthanoliques du mycélium (aérien et substrat).

Solvant d'extraction	Substance test	Bactérie -cible
Solvant d'extraction	Substance test	1'	2	3	4	5	6	7	8	9
Ethanol	Mycélium aérien	13	14	15	11	14	12	13	12	12
	Mycélium du substrat	12	-	10	11	12	8	8	13	13
	Contrôle négative	7	7	10	8	9	7	7	9	8
Ether de pétrole éthylique	Mycélium aérien	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	Mycélium du substrat	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	Contrôle négative	8	-	9	7	8	9	-	7	7

1' : Escherichia coli ; 2 : Pseudomonas aeruginosa ; 3 : Staphylococcus aureus ; 4 : Citrobacter freundï ; 5 : Enterobacter cloacea ; 6 : Klebsiella pneumoneae ; 7 : Listeria monocytogenes; 8 : Proteus mirabilis ; 9 : Salmonella typhi.

* Les chiffres indiquent le diamètre des zones d'inhibition exprimées en mm y compris celui du disque.

Le tableau 9 et la figure 10 montrent que l'extrait étherique du mycélium qu'il soit aérien ou du substrat n'a présenté aucune activité antibactérienne contre les bactéries-cible .

Cependant les extraits éthanoliques des filaments aériens et du substrat ont révélés une activité antibactérienne importante contre la majorité des bactéries-cibles.

Par ailleurs, l'extrait éthanolique du mycélium aérien (synnemata) a présenté un pouvoir antibactérien plus important par rapport à celui du substrat surtout dans le cas du bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa dont la zone d'inhibition de l'extrait du mycélium aérien était 14 mm, cependant celui du mycélium du substrat n'a présenté aucune activité.

En résumé, l'étude de l'activité antibactérienne de la souche 23B appartenant à l'espèce Beauveria felina a montré que les extraits éthanoliques du mycélium avec ses deux formes (aérien et substrat) ont exercées une activité antibactérienne contre la majorité des bactéries-cibles.

Fig. 10. L'activité antibactérienne de la souche 23B « Beauveria felina » contre la bactérie-cible Enterobacter cloacea (5).

- Les filaments aériens agrégés : C. L'extrait éthanolyque. D. L'extrait étherique.

- Les filaments du substrat : E. L'extrait éthanolyque. F. L'extrait étherique.

CHAPITRE IV

DISCUSSION GENERALE

La résistance des bactéries aux antibiotiques, a imposée beaucoup de chercheurs dans le monde entier d'utiliser toutes les méthodes dans l'espoir de minimiser le danger de ces bactéries, dont l'une de ces méthodes était l'isolement de nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques à partir des milieux naturels.

Notre travail, basé sur la recherche de ce type de souche fongique à partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de Ain Fezza a pu rattacher les isolats ont deux groupes. Le premier était la cible de notre recherche, dès le début, représenté alors par les souches du genre Penicillium. Tandis que le deuxième, sa présence dans notre étude était liée beaucoup plus au hasard que d'autre chose, représentée alors par les souches de l'espèce Beauveria felina.

A partir des résultats d'isolement et d'identification des souches de Penicillium, on a constaté que la plupart des 152 isolats proviennent des échantillons du sol de la station 1 et les échantillons du sol et des concrétions sédimentaires du point de prélèvement P₂ situé à 185 m de l'entrée de la station 3.

D'un autre côté, la station 2 et les points de prélèvements P₁,P₃et P₄ situés respectivement à 60 m, 280 m et 76 m de l'entrée de la station 3, ont donné une fraction infime d'isolats de Penicillium.

Par ailleurs, tout être vivant a besoin de se nourrir, de boire et de respirer. Ces trois exigences ont contribué à la distribution des êtres vivants dans notre planète, y compris les champignons.

La matière nutritive, l'eau et l'air sont aussi sous la dépendance d'autres facteurs qui peuvent agir directement ou indirectement sur la répartition des champignons souterrains. Prenons la matière nutritive.

Dans notre travail, la richesse de certaines stations et points de prélèvement en matière nutritive est peut être attribué à plusieurs facteurs, telle que la lumière. Selon Jeannel (1937) :« Aux entrées des grottes, la lumière du jour pénètre plus ou moins loin ; dans les parties profondes du domaine souterrain l'obscurité est totale, éliminant toute possibilité, pour les plantes à chlorophylles, de croître. ». L'absence de ces plantes, ou généralement les organismes photosynthétiques, dans ce domaine surtout dans les endroits plus profonds influence sur sa richesse en matière organique végétale et animale ; or on sait, que ces organismes sont les principaux producteurs de la matière dans la chaîne alimentaire.

Revenons à nos stations de prélèvement, si on prend la station 1, on trouve que les algues vertes gagnent une surface importante de l'entrée (Fig. 4.B). Ces algues sont une bonne source alimentaire pour l'abondance des champignons du genre « Penicillium » dans les échantillons des dix mètres premiers du sol de cette station. Mais on peut pas attribuer cette abondance seulement à la présence des organismes photosynthétiques. Pourquoi ?

La station 2, est aussi caractérisée par une végétation plus importante à l'entrée (les arbres fruitiers), or la fraction infime de nos isolats de Penicillium provient des échantillons du sol de cette station. La question qui peut se poser, est ce que le type de végétation a une influence sur ces résultats (arbres fruitiers ou algues vertes) ?

Cependant, le point de prélèvement « P₂ » a donné une fraction importante d' isolats de « Penicillium », bien qu'il soit situé à 185 m de l'entrée de la station 3 (obscurité total) où on a presque aucune chance d'existence d'organismes photosynthétiques.

De ce fait, la présence de la matière organique végétale sous l'influence de la lumière solaire peut jouer un rôle dans l'abondance des champignons du genre « Penicillium » dans ces stations, mais peut être ce n'est pas le plus important.

Outre, cette source de matière nutritive, d'autres peuvent intervenir de façon plus importante dans l'abondance du « Penicillium ». Prenons les animaux, ils constituent par leurs cadavres et leurs excréments une bonne source de la matière organique. L'eau joue un rôle aussi important qu'on peut l'imaginer ; par ses mouvements superficiels et souterrains, elle entraîne des détritus végétaux et des organismes en petite taille.

Selon Tercafs (1997) : « La biomasse totale existant dans les milieux souterrains est généralement faible. Presque toute l'énergie disponible provient de deux sources extérieures. Un premier apport, très important, est constitué de détritus végétaux et d'organismes de petite taille entraînés par les eaux souterraines (eaux de percolation et eaux libres). Le second apport provient de l'entrée régulière d'organismes actifs (trogloxènes) " non consommateurs " qui viennent peupler l'écosystème. L'exemple le plus frappant est celui des chauves-souris qui vont se nourrir au-dehors, mais dont le guano libéré dans les grottes est le point de départ d'une faune inféodée considérable».

En ce qui concerne nos stations de prélèvement, on a remarqué d'après le tableau 1 qu'il y avait une différence entre les sources d'énergie des stations de prélèvement et même entre ceux des points de prélèvement de la même station.

Si on prend la station 1, on remarque que les sources d'énergies sont peut être assurées en grande partie par les animaux observés aux cours de nos prélèvement (chauve-souris et insectes) plus les eaux pluviales pénétrées à travers l'entrée de cette station.

En rapportant ces observations aux résultats d'isolement des souches de « Penicillium », on peut dire que la présence de la matière nutritive représentée par ces deux types d'apports ont une grande responsabilité sur l'abondance des isolats de« Penicillium » dans les échantillons de sol de cette grotte. Mais ils ont pas peut être la grande responsabilité.

Prenons la station 2, cette station caractérisée par la présence d'une source de matière organique végétale importante, elle a aussi révélé la présence d'autres sources d'énergies considérable du point de vue quantitatif. En citant le porc-épic, détritus végétal, fourrages, activité humaine et les bestiaux, on dit que cette station a un apport énorme en matière organique et à partir de son sol on peut isoler une fraction importante de souche de « Penicillium », or c'est le contraire. Pourquoi, alors ?

Au niveau de cette station, on a remarqué que la surface mouillée par l'eau était limitée seulement à proximité de son entrée, alors que l'eau était un apport d'énergie important. Donc les résultats d'isolement de cette station peuvent être dus à l'eau.

Par ailleurs, si on prend la station 3 on remarque le même cas que la station 2, dont on a isolé une fraction très infime de souche de « Penicillium » à partir des échantillons du sol du point de prélèvement P₄, bien qu'il abrite un nombre considérable de pigeons, alors que le point de prélèvement P₂ était notre source principale d'isolats de « Penicillium » pourtant on n'a remarqué aucune trace d'animaux aux cours de nos prélèvements.

C'est peut être du à l'eau, bien que tous les point de prélèvement de cette station soient alimentés par les eaux d'infiltration. Mais, si on prend la remarque concernant la couleur du tapis mycélien du point de prélèvement P₂qu'était foncé en période sèche (décembre), et clair avec des hyphes bien visualisés après la période neigeuse (mars), on peut penser que les eaux d'infiltration ont un rôle important dans l'abondance des souches de « Penicillium », puisque les eaux d'infiltration ont été plus intense en mois de mars.

Par suite de ces résultats, on pose plusieurs questions, est ce que c'était le type de matière nutritive qui est responsable des résultats d'isolement du « Penicillium » et pas la quantité, ou bien c'était l'eau qui a la grande responsabilité ?

D'un autre côté, le type d'apport de la matière nutritive de l'extérieur des trois stations, ainsi l'eau sont peut être lié indirectement à la forme de l'entrée de chaque station. Prenons la station 1, l'ouverture très étroite de cette station, plus la verticalité des deux mètres premiers de la station (Fig. 4.B) a rendu l'accès de l'homme et des vertébrés difficile par rapport à la station 2 dont elle est caractérisé par une entrée très large et une grotte horizontale, contrairement à l'eau dont il peut pénétrer facilement dans le cas de la station 1, par rapport à l'autre station.

La station 3 considérée comme un lieu touristique intéressant, à son entrée il y a une grande porte grillée éliminant toute possibilité des vertébrés d'accès à travers. Les pigeons observés au niveau du point de prélèvement P₄ (le point de prélèvement le plus proche à l'entrée) ont été entrés par une ouverture en haut de l'entrée. La forme de l'entrée de cette station, ne peut jouer aucun rôle dans l'alimentation de nos points de prélèvement en eau.

A l'égard de la matière nutritive, les champignons des grottes ont besoin de l'eau et d'air comme tout être vivant.

A propos de ces deux éléments Jeannel a dit en 1937 « Il ne semble pas que l'air et l'eau aient une composition spéciale dans le domaine souterrain. L'eau est saturée de calcaire, comme bien des eaux superficielles ».

Dans le monde souterrain, l'eau et l'air ne semblent pas qu'ils ont une composition spéciale mais ils peuvent influencer sur l'abondance des champignons du genre « Penicillium », aussi ils peuvent être influencés par d'autres facteurs. Alors, voyons quel rôle ils peuvent jouer dans nos stations de prélèvement.

En analysant les résultats des observations sur terrain, on remarque qu'il existe une différence entre l'alimentation des trois stations en eau. L'eau alimentant les deux stations 1 et 2 était d'origine pluviale entrée par l'ouverture principale des grottes, dont il est plus remarquable dans le cas de la station 1 que l'autre station vue la forme de son entrée. Cependant, l'eau alimentant la station 3 est comme origine l'eau d'infiltration plus des sources de cours d'eaux présents au niveau des points de prélèvement P₂ et P₃.

Par suite de ces résultats, on peut dire que l'eau est suffisante au niveau de tous les sites d'étude à l'égard de la station 2.

Parallèlement à la matière organique et l'eau, les champignons ntant qu'organismes hétérotrophes ont besoin d'oxygène pour vivre. Cependant, l'approvisionnement du milieu souterraine en oxygène et comme tous les autres milieux (terrestre, aquatique,...) est sous la dépendance de l'activité des organismes photosynthétiques dégageant l'oxygène.

Alors, on peut dire que plus l'activité photosynthétique de ces organismes est plus importante, plus le milieu s'enrichit en oxygène. Or, le milieu souterrain est caractérisé par l'absence de la lumière, surtout dans les galeries les plus profondes, alors que c'est un facteur important pour l'assimilation chlorophyllienne ; ce qui a rendu ce milieu, un des milieux les plus pauvres en oxygène. Par contre, ce milieu est caractérisé par un apport énorme de gaz carbonique libéré aux cours des précipitations calciques et le ruissellement des eaux souterraines.

Selon Jeannel (1937) « On connaît un assez grand nombre de grottes à acide carbonique. Ce gaz remplit les bas-fonds et y forme des lacs gazeux où toute vie est impossible. Lorsqu'il coule en ruisseaux aériens dans les galeries souterraines, il rend l'air irrespirable pour l'homme ».

Si on prend en considération la relation proportionnelle entre l'oxygène et les organismes photosynthétiques, on peut dire que parmi nos stations de prélèvement les plus riches en oxygène étaient la station 1et la station 2 ; tandis que les plus pauvres sont les points de prélèvements de la station 3. Donc les deux stations 1 et 2 ont été des milieux favorables à l'abondance des champignons du genre Penicillium, alors que les résultats d'isolement ont été appropriés dans le cas de la station 1 et non dans le cas de la station 2.

Concernant la station 3, les résultats d'isolement des souches de Penicillium ont été remarquables. L'absence des producteurs d'oxygène, plus l'infiltration des eaux aux niveaux de tous les points de prélèvement peut les transformer en milieu très pauvre en oxygène et riche en gaz carbonique, alors que le point de prélèvement P₂ situé à 180 m de l'entrée, où la chance d'existence des organismes chlorophylliens est négligeable, a été la source principale de nos isolats de penicillium.

D'après ces résultats, on peut dire que les organismes photosynthétiques endogènes n'étaient pas le seul facteur limitant d'oxygène dans ces stations, et surtout la station 3. L'oxygène est peut être apporté aux cours des renversements des courants d'air entre la grotte et l'extérieur, dont on peut remarquer que la largeur de la grotte dans le cas de la station 3 peut la transformer en un stock d'oxygène, et surtout à proximité de l'entrée. Cependant, le point de prélèvement P₂ est très éloigné de l'entrée et même de l'autre ouverture.

Le problème ne se pose pas à la distance entre ce point de prélèvement et les deux entrées de la station puisqu' elle n'est pas énorme, l'oxygène est suffisant ; mais c'est la rétention de l'oxygène par le sol, qu'elle peut poser les problèmes ; et surtout, lorsqu'on lie ce que vient à l'influence de l'oxygène et gaz carbonique sur la microflore tellurique et son activité abordé par Dommergues (1969) :

« Le sol est formé de particules élémentaires (sable, limon, argile) assemblées en agrégats et constituant un système poreux (phase solide) dont les espaces libres sont occupés par l'atmosphère du sol (phase gazeuse) ou par de l'eau (phase liquide ou solution du sol). Les proportions relatives des phases gazeuses et liquides variant en fonction de l'humidité, il est difficile de dissocier l'étude de l'aération du sol de celle de l'humidité : en effet, lorsque le sol est gorgé d'eau, la phase gazeuse est inexistante et les échanges avec l'atmosphère libre sont très faibles. ».

D'après ce paragraphe, on peut dire que la teneur très élevé en eau du sol du point de prélèvement P₂ (Fig. 4.D et E) peut réduire sa teneur en gaz! ! !

Mais, peut être c'est vrai si les gaz du sol n'existent que dans la phase gazeuse ; or, ils n'existent pas seulement dans la phase gazeuse mais aussi dans les autres phases, phase liquide ou ils sont dissouts et à l'état adsorbé sur les particules constituant la phase solide, dont les gaz dissous joue un rôle biologique important dans la solution du sol, car la plupart des microorganismes telluriques ne sont pas en contact direct avec l'atmosphère du sol mais sont recouverts d'un film d'eau plus ou moins épais dans lequel diffusent les gaz de l'atmosphère (DOMMERGUES, 1969).

Donc, on peut penser que c'est à l'oxygène dissout qu'on peut rattacher l'abondance des souches de Penicillium dans ce point, alors que les solutions du sol sont caractérisées par une concentration en oxygène beaucoup plus faible et une concentration en gaz carbonique beaucoup plus élevée que l'atmosphère du sol avec lesquelles elles sont en contact (DOMMERGUES, 1969).

Après qu'on a discuté l'approvisionnement en oxygène de ce point de prélèvement, on y trouvé toujours devant l'impossibilité de ce point d'être un milieu convenable et même très convenable à l'abondance des champignons du genre Penicillium. La preuve le tapis mycélienne (Fig. 4.D et E).

Sans oublier les résultats d'isolement des souches de Penicillium à partir des concrétions en mois de mars, on peut attribuer ces résultats dans la majeur partie aux eaux d'infiltration, qu'elle peut apporter la matière nutritive, l'eau et l'oxygène. Et, dont Maheu (1906) a dit à propos des champignons (supérieur) trouvés sur les concrétions :

« La présence du substratum et surtout sa nature ne doit pas être sans influence sur le développement de ces champignons. Dans un grand nombre de grottes, les concrétions calcaires qui recouvrent entièrement le sol s'opposent aux efforts des mycéliums pour trouver leur nourriture. En effet, ce n'est qu'exceptionnellement que des formes naines croissent sur des stalactites qui semblent ne présenter aucune particule alimentaire ; mais dés qu'apparaissent les matières organiques : boues liquides, humus, détritus de feuilles, les champignons plus ou moins bien développés se multiplient rapidement ».

D'un autre côté, les résultats d'isolement des souches de Penicillium peut être attribué à notre travail expérimental dont les conditions de travail (milieux de culture, température d'incubation, pH...ect) ont permis peut être à la croissance de certaines en faveur d'autres.

Enfin, on doit faire la remarque sur l'interprétation et la discussion des résultats d'isolements des souches de Penicillium, c'est vrais les résultats apportées dans notre travail étaient ceux des souches sélectionnées et pas isolées ; mais si on prend les résultats, à titre exemple, de la station 1 et du point de prélèvement P₂de la station 3 le nombre réel des souches isolées étaient beaucoup plus important que celui des souches sélectionné ; cependant que le nombre réel des souches des autres stations et les points de prélèvements était le même que celui des souches sélectionné. C'est pour cette raison qu'on a dit que la station 1et le point de prélèvement P₂de la station 3 ont été caractérisés par l'abondance de nos champignons cible.

Parallèlement à l'isolement des souches de Penicillium, on a révélé la nouveauté dans notre laboratoire d'une souche présent uniquement dans les échantillons du point de prélèvement P₂ de la station 3. L'étude de ces caractéristiques morphologiques et culturales, suivie par une identification proprement dite par le Musium National d'Histoire Naturelle de France, a montré que la souche appartient à l'espèce Beauveria felina.

D'après l'article qui a accompagné la lettre du Musium National d'Histoire Naturelle de France, les caractéristiques morphologiques et culturaux de la souche 23 B ont présenté une grande similitude avec celle décrit par De Hoog (1972) en article ci-dessous.

Clavaria (?) felina DC. - Fl. fr. 6:30. 1815; per Fr. - Syst. mycol. 1: 496. 1821 = Fibrillaria felina (DC. per Fr.) Pers. - Mycol. eur. 1:53. 1822 = Isaria felina (DC. per [p. 16] Fr.) Fr. - Syst. mycol. 3: 271. 1832 = Penicillium felinum (DC. per Fr.) Biourge - Cellule 33: 102. 1923.

Isaria felina (DC. per Fr.) Fr. var. aviaria Sacc. - Michelia 2: 561. 1882.

Isaria felina (DC. per Fr.) Fr. var. domestica Speg. - An. Mus. nac. Hist. nat. B. Aires 23: 121. 1912.

Isaria felina (DC. per Fr.) Fr. var. cuniculina Ferr. - Fl. ital. crypt., Fasc. 6, Hyphales p. 152. 1910.

Isaria felina (DC. per Fr.) Fr. var. pirina El. Marchai & Et. Marchai - Bull. Soc. R. bot. Belg. S4: 134. 1921.

Isaria cretacea van Beyma - Zentbl. Bakt. ParasitKde, Abt. 2, 91: 350. 1935 = Beauveria cretacea (van Beyma) Matsushima - Microf. Solomon Isl., Papua-New Guinea p. 7. 1971.

Fig. 11. Isaria felina. a. conidial structures; b. conidiogenous cells; c. conidia.

Colonies in vitro attaining a diameter of 8-14 mm in 8 days, forming in fresh isolates a dense felt, from which several white, positively phototropic synnemata arise (Taber & Vining, 1963), up to 70 mm high and constantly 1 mm wide, terete, tomentose, usually unbranched, or occasionally branched at the apex, in old strains appearing lanose to floccose; at first white, later becoming yellowish. Reverse uncoloured or yellowish to yellow brown. Exudate rarely produced, odour absent. Submerged hyphae hyaline, smooth-walled, 1-3 um wide. Hyphae of the aerial mycelium hyaline, smooth-walled, 1-4.5 um wide, creeping, ascendent or fasciculate, bearing orthotropic conidiogenous cells, solitarily or in small groups; sometimes 1-2 conidiogenous cells are supported by a slightly swollen stalk [p. 17] cell. Conidiogenous cells not elongating, consisting of a swollen, flask shaped or curved, occasionally elongate basal part, mostly 3-8.5 x 2-2.5 um, and a short, irregular conidiiferous portion, mostly comprising 2-4 denticles; in age a short geniculate rachis may be formed. Conidia hyaline, smooth, subglobose, ellipsoidal or ovoidal, sometimes with a pointed base, (2.5-) 3-4 (-4.5) x (2-) 2.5-3 (-3.5) um. No chlamydospores were observed.

Mycelium on natural substrate forming a thin layer of hyaline hyphae, from which several white, erect synnemata arise, up to 80 mm high and constantly 0.5-1 mm wide, usually unbranched. Perfect state unknown.

Fibrillaria felina in herb. Persoon (L), Nos. 910.262.101 and 910.262.106, leg. F. Chevallier.

Isaria felina in herb. PC under No. 1534; ex herbarium Durieux de Maisonneuve, leg. L. Motelay, 1879.

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CBS 250.34, type culture of Isaria cretacea, Epsom, Great Britain, sent in 1934 by D. Hutchinson.

CBS 235.36 isolated by H. A. Diddens from pupa of Anaitis efformata, Soest, sent in 1936 by R. Tolman.

CBS 236.36 isolated from rabbit dung, Erlangen, Germany, sent in 1936 by H. Greis.

CBS 312.50 isolated from rabbit dung, sent in 1950 by K. B. Boedijn under No. BR 17/50.

CBS 313.50 isolated as culture contaminant, sent in 1950 by Lab. Microbiology, Delft.

CBS 173.71 isolated from porcupine dung, Ontario, Canada, sent in 1969 by D. Malloch under No. TRTC 45685.

En analysant les informations apportées par l'article, on a trouvé quelques différences. Prenons l'embranchement des synemmata ; le lectotype décrit en article est fréquemment non branché (usually unbranched). Ce n'est pas le cas pour notre souche (Fig. 7).

En plus, si on prend le paragraphe «Mycelium on natural substrate forming a thin layer of hyaline hyphae, from which several white, erect synnemata arise, up to 80 mm high and constantly 0.5-1 mm wide, usually unbranched. Perfect state unknown.» de l'article ci-dessus, on remarque que la souche décrite dans cette article a formé sur son milieu naturel des synnemata de grande taille (80 mm en longeur et 0.5 à 1 mm en largeur).

Dans le cas de la souche 23B, on ne peut pas trouver ses caractéristiques sur son milieu naturel (le point de prélèvement P₂ de la station 3). On a observé, seulement, un tapis mycélien dont on ne peut pas distinguer ses composants (Fig.4.D) ; sa couleur et sa forme ne peuvent nous donner aucun renseignement des champignons qui tapissent ce point de prélèvement. Est-ce que c'est Penicillium ou bien Isaria felina ou même d'autres champignons hors ces deux types et que les techniques d'isolement par suspension-dilution n'ont pas permis de les détecter.

Devant le problème posé, est ce que le tapis mycélien est celui d' Isaria felina ou pas, on essayera de discuter la différence entre le lectotype décrit en article est la souche 23 B du point de vue croissance sur le milieu naturelle.

En prenant d'abord, l'origine des souches d'Isaria felina décrit en article si dessus. Qu'est ce qu'on trouve ? On trouve que les souches ont été isolées dans la plupart des cas à partir des excréments d'animaux. En plus, ces souches ont présenté un caractère très remarquable : leurs synnemata sont phototropique,

Or, notre souche 23 B et toutes les souches qui lui ressemblent ont été isolées du sol et des concrétions sédimentaires d'un point situé à 185 m de l'entrée d'une grotte (Ghar Beni Aâd), alors l'origine est totalement diffèrent des autres souches, c'est une souche cavernicole.

Si on considère que le tapis mycélien est celui d'Isaria felina, qu'est ce qu'on peut dire ?

On peut dire, que même si le tapis mycélien est celui d'Isaria felina, les hyphes n'ont pas les mêmes caractéristiques que celle décrites par l'article. La différence observée est peut être attribuée à plusieurs facteurs, la matière nutritive, l'oxygène, l'humidité et enfin la lumière.

Si on prend le biotope des souches citées par l'article, on trouve que c'est des milieux riches en matière nutritive puisque ce sont des excréments d'animaux, carotte,...ect. Les autres facteurs n'ont pas été cités.

Contrairement, à nos souches qui sont isolées d'un milieu extrême où l'apport en matière nutritive, ainsi en oxygène pose plusieurs questions du fait des caractéristiques du point de prélèvement P₂ évoquées en haut. La lumière joue un rôle important puisque les synnemata des souches citées en article sont phototropique, alors que le biotope de la souche 23 B est caractérisé par une obscurité total.

Par ailleurs, si on considère que le tapis mycélien est pas à Isaria felina, on peut dire que les spores de cette espèce ont été conservés dans le sol et sur les stalactites, et que les caractéristiques du point de prélèvement P₂ n'ont pas permis le développement de ces spores. En effet, les moisissures sont parfois condamnées à un mode de conservation originale. Dans les parties de réseaux soumises aux courants d'air ascendantes ou descendantes, notamment à proximité des entrées, les apports organiques, à la surface des sédiments, peuvent être suffisants - l'humidité par ailleurs ne faisant que rarement défaut - pour permettre un début de développement des spores qui les accompagnent. Ce développement est réduit et on isole fréquemment, notamment dans les galeries de faible volume ouvertes aux pollutions, à coté de cours filaments mycélien vides, à parois épaisses, de grosses spores à parois épaisses également, mais rarement des sporanges. Ces grosses spores sont capables ultérieurement d'un développement normal. Le court mycélium issu de la germination, après avoir rassemblé son cytoplasme, donne des sortes d'oïdies qui sont plutôt des kystes correspondant à un stade de conservation (CAUMARTIN, 1959).

Mais le problème ne s'arrête pas, est ce que le tapis mycélien est celui d'Isaria felina ou pas, et encore est ce que Isaria felina est présent au niveau du point de prélèvement P₂ à l'état végétatif ou à l'état de spore, mais de quel facteur, elle est peut être influencé sous les deux états.

Les interactions entre les composantes de la mycoflore du sol de ce point peuvent jouer le rôle, comment ?

Selon Dommergues (1969) « Lorsque l'on inocule un sol stérile avec un microorganisme quelconque, ce dernier s'y installe sans difficulté, à condition, bien entendu, qu'il dispose d'un substrat convenable et qu'il ne soit pas gêné par des facteurs écologiques défavorables, pH excessif ou insuffisant par exemple. Par contre, si l'inoculation porte sur un sol non stérile, elle est souvent vouée à l'échec : c'est ainsi que de nombreux microorganismes pathogènes pour l'homme, les animaux ou les plantes, ne se conservent pas dans les sols biologiquement actifs. Cet échec de l'introduction d'un microorganisme étranger dans un sol non stérile s'explique par l'intervention de processus antagonistes divers, dont les principaux sont la compétition, l'antibiotisme, la prédation et le parasitisme. ».

D'après ce paragraphe, on peut dire que nos souches d'Isaria felina ont été peut être à l'état de spore, si c'est le cas, pas seulement à cause des conditions d'environnement mais les interactions peuvent jouer un rôle, surtout celles de type antagonistes.

L'un de ces interactions le plus intéressentes est la mycostase ou phénomène d'inhibition de la germination des spores fongiques en contact avec le sol, même si les conditions d'environnement sont favorable à leurs germination. Il est expliqué soit par la déficience du sol en substrat nécessaire à la germination d'où apparition d'une compétition très vive entre ces spores d'une part et les autres éléments de la microflore d'autre part, soit par la diffusion dans le sol de substances inhibitrices (mycostatiques), en particulier d'antibiotiques (DOMMERGUES, 1969).

On comprend que, si Isaria felina est présent au niveau de ce point de prélèvement à l'état de spore, elle est peut être sous l'influence des interactions antagonistes, mais si elle est à l'état végétatif, de quel type d'interaction elle est peut être soumise ?

Premièrement, on doit faire la remarque sur la différence entre le tapis mycélien et la forme végétative. Lorsqu'on a dit le tapis mycélien est celui d'Isaria felina, on a peut être négligé un peu le cas ou le tapis mycélien est formé d'une part par Penicillium, qu'on a révélé auparavant leur abondance au niveau de ce point, et d'autre part par Isaria felina et même d'autres champignons.

Si c'est le cas, on peut dire que ces composantes du tapis mycélien sont peut être sous la dépendance des interactions synergiques, qui a rendu ce point de prélèvement un milieu favorable autant pour Penicillium que pour Isaria felina malgré les points d'interrogation accompagnant les conditions d'existences au niveau de ce point.

Si ce n'est pas le cas, on peut dire que cette espèce a peut être exercé des interactions antagonistes contre les autres champignons.

Quoiqu'on parle de la différence observée entre les caractéristiques du lectotype décrit en article et celles de la souche 23 B, on ne peut pas négliger la différence entre les deux origines d'isolement. Alors, si on analyse bien les données de cet article, qu'est ce qu'on peut dire ?

Hors l'origine d'isolement, l'article n'a pas donné des informations concernant, sous quelle conditions de croissance a donné cette espèce la forme décrite en paragraphe si dessus ( la température, la luminosité et l'humidité), ainsi l'origine exacte pas seulement des excréments mais aussi des animaux, des champignons, des carottes...ect. Est-ce qu'ils ont une relation avec les grottes ?

Pourquoi on a pensé à cette relation ? Peut être parce qu'on a trouvé que l'origine d'isolements des souches d'Isaria felina de l'article ont une relation avec les grottes ; surtout, lorsqu'on parle du porc-épic dont l'habitat principal de cet animal c'est les cavités souterraines, et même quand on parle des autres origines, ils ont une relation avec le monde souterrain.

Par ailleurs, cette relation peut nous diriger vers une problématique, est ce que Isaria felina est une espèce cavernicole ou c'était les animaux cités par l'article qui ont transporté ces spores à l'intérieur de la grotte de Beni Aâd.

Avant de terminer, nous devons faire la remarque qu'en laboratoire on a isolé plusieurs souches de cette même espèce et à partir de plusieurs échantillons du point de prélèvement P₂et on a fait plusieurs essais d'isolement pour éviter les probabilités que cette espèce d'être un simple contaminant de nos cultures.

On peut ajouter que ce point de prélèvement n'est pas un endroit préférable aux touristes de la grotte, puisqu'elle n'est pas concrétionné en formes attirantes. Pourquoi on a dit ça, tout simplement pour éviter la probabilité que les souches isolées de cette espèce sont à l'origine les pieds des touristes.

Afin d' atteindre notre objectif de départ que c'était l'isolement des souches fungiques à activité antibactérienne ; on a utilisé deux méthodes, dont l'une était utilisée pour les souches de Penicillium, pendant que l'autre était utilisée pour la souche 23 B.

Concernant la première méthode les souches ont été passées par deux criblages, afin de sélectionner les souches les plus puissantes de point de vue d'activité antibactérienne. En passant par le criblage primaire, on a révélé la présence d'une activité inhibitrice chez 38 souches de Penicillium parmi 80 souches testées contre une des trois bactéries-cible.

Les souches de Penicillium les plus puissantes ont été d'origine la station 1 et le point de prélèvement P₂ de la station 3.

Le criblage secondaire a montré que parmi 14 souches de Penicillium testées seulement 7 souches qui ont révélé une activité antibactérienne contre aux moins une bactérie-cible dont la plupart ont exercée l'activité inhibitrice contre les deux bactéries-cible Salmonella typhi et Proteus mirabilis.

Par suite de ces résultats, on peut dire que les zones d'inhibitions obtenues en deuxième criblage ont été nettement inférieures à ceux obtenues en premier criblage des mêmes souches de Penicillium. Cela est peut être attribué à la méthode utilisée.

En effet, le milieu de culture peut jouer un rôle important dans les résultats d'activité antibactérienne (TAKAHASHI CTAKADA et al, 1994 ; BERNAN et al, 1994) ; dont il peut influencer par différentes voies, par sa composition, sa richesse en matière nutritive, son pH et même son état que ce soit liquide ou solide. Alors, le fait que le milieu de culture utilisé pour la production des antibiotiques par la méthode de culture en milieu liquide soit le milieu (YGS) et celui de culture en milieu solide soit (PDA _ac) peut influencer sur les résultats d'antibiose.

Selon Gaden-Junior (2000), la production des métabolites est sous l'influence de la composition des milieux de cultures, sa richesse en nutriment, plus d'autres aspects. Différentes sources de carbones et d'azotes peuvent agir sur la synthèse des enzymes impliqués dans le métabolisme primaire et secondaire. Les microorganismes sont capables d'utiliser une large variété de sources de carbones et d'azotes. Pourtant, beaucoup de voies de métabolismes secondaires sont affectées négativement par les sources favorables à la croissance (SANCHEZ et DEMAIN, 2002).

Plus la composition des milieux de culture, le pH peut influencer sur les résultats d'antibiose puisqu'il est différent. Le pH du milieu (YGS) neutre, pendant que celui du (PDA _ac) est acide.

Par ailleurs, il faut ajouter que les conditions de laboratoire peuvent influencer sur les résultats. Alors, comment ?

Les essais effectués aux cours de notre étude en laboratoire, nous ont imposé à réfléchir ce n'est pas seulement à la différence observée entre les deux méthodes mais aussi les différences observées, quelque fois, entre les résultats d'une même méthode. Et on a fini par dire que les conditions climatiques ont peut être joué un rôle important dans l'expression de l'activité antibactérienne chez les souches de Penicillium. Pourquoi ?

On a remarqué que les tests d'antibiose effectués en climat froid ont donné des résultats positifs, tandis que ceux effectués en climat chaud ont donné dans la plupart du temps des résultats négatifs. Cela est peut être attribué à la production des antibiotiques par les souches de Penicillium, peut être elle est affectée par la période sèche même en utilisant des étuves à 25°C, cela n'est pas sans inconvénient.

Ces remarques, nous font penser à l'origine d'isolement (les grottes) et les conditions de ce milieu (température, humidité...ect).

Par ailleurs, les résultats d'antibiose des souches de Penicillium que ce soit en premier criblage, qu'en deuxième ont été la preuve de la richesse des grottes et spécifiquement la station 1 et le point de prélèvement P₂ de la station 3 en producteurs d'antibiotiques. Ces sites d'études que leurs caractéristiques (la matière organique, l'humidité, l'oxygène...ect), n'ont pas fait défaut à la présence des champignons du genre Penicillium, ont favorisé la compétition entre ces champignons et les autres éléments de la microflore du sol, donc la présence des producteurs d'antibiotiques les plus puissants.

En effet, dans la nature les antibiotiques représentent un atout pour les bactéries et les moisissures qui les synthétisent. Cet atout leur permet de nuire à leurs compétiteurs pour mieux s'accaparer les substances nutritives disponibles dans leur environnement (GAUTHIER, 1993).

Enfin, nous devons faire remarquer que l'activité antibactérienne des souches testées peut être plus importante en milieu naturel que celle exhibée en laboratoire, du fait, premièrement, aux conditions extrême de nos sites d'étude, plus le choix de milieu de culture et les conditions de production des antibiotiques.

Avant de terminer, on ne peut pas oublier un autre témoignage des résultats d'antibiose des souches de Penicillium, c'était premièrement, les caractéristiques du point de prélèvements P₂.

Plus, l'histoire du combattant dans la station 1 avec les blessures et le jeûne pendant 12 jours au lieu qu'elle s'aggravait, elle s'est stabilisée. Peut être cet état était du à la présence des organismes producteurs d'antibiotiques.

A propos de la souche 23 B appartenant à l'espèce Isaria felina, le résultat d'activité antibactérienne obtenue par la méthode 2 a montré que les filaments aériens agrégés libèrent dans l'eau distillée des substances antibactériennes.

Par ailleurs, les résultats des tests de production des substances antibactériennes exogènes et endogènes ont montré une activité négligeable du surnageant, et parallèlement une activité importante de l'extrait éthanolique du mycélium (aérien et substrat).

En effet, les filaments aériens agrégés de cette espèce étaient le cible de beaucoup de chercheurs de molécules insecticides et même des molécules antifongiques (GUO et al, 2005). L'étude de l'activité antibactérienne d' isarfiline contre les bactéries-cibles (Bacillus subtilus, Escherichia coli et Staphylococcus aureus), effectuée par Guo et al (2005), a révélé l'absence d'une activité notable. Alors que peut on dire de nos résultats ?

La présence d'une activité inhibitrice de la souche 23 B contre les bactéries- cible est peut être attribuée à plusieurs facteurs ; au milieu de culture, au protocole d'extraction, aux bactéries- cible, à la souche elle-même pour des raisons peut être liées plus aux facteurs d'antagonistes (cités en haut).

Il faut ajouter que l'absence d'une activité antibactérienne notable du surnageant, ça ne veut pas dire que la souche n'a pas des substances antibactériennes exogènes ; la composition du milieu de culture, son pH, ainsi son volume peut influencer sur les résultats.

Ailleurs, les résultats d'activités antibactériennes des extraits éthanoliques et étheriques du mycélium peuvent nous faire penser à la nature hydrophile de la substance active, puisque l'activité était concentrée dans l'extrait éthanolique.

CONCLUSION

En début, la résistance des bactéries aux antibiotiques nous a incité à la recherche de nouvelles substances antibactériennes dans le monde souterrain ; or notre travail a permis non seulement d'accomplir cet objectif, mais aussi de :

- Ouvrir la porte du monde souterrain de l'Algérie et plus exceptionnellement le monde fongique.

- Isoler de nouvelles souches fongiques originales du monde souterrain de notre région, propres à notre pays.

- Traverser l'ère d'étude des déformations morphologiques de la flore et la faune souterraine vers l'ère des molécules thérapeutiques d'origine souterraines.

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Recherche de nouvelles souches fongiques productrices d' antibiotiques à partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de Aà¯n Fezza.