Memoire Online - Utilisation des produits biologiques d'origine équine en thérapeutique humaine

L'immunisation consiste à administrer, de façon répétée chez l'animal, les antigènes spécifiques aux anticorps à produire. L'administration se fait généralement par voie intraveineuse (veine jugulaire) chez les chevaux. Elle a lieu à des périodes précises de l'année dans le but d'assurer l'intégrité de l'animal.

En ce qui concerne le laboratoire Serolab en Suisse, l'immunisation est assurée par le vétérinaire et a lieu uniquement au printemps et en automne, pendant une durée de deux mois à trois mois environ. Entre ces périodes, l'animal est au repos. Dans l'objectif de produire des spécialités dirigées contres les tissus et organes humains, le laboratoire Serolab utilise une suspension d'homogénats de tissus de porc comme antigène [6].

I.1.2 Obtention du sérum

I.1.2.1 Ponction du sang

La ponction est effectuée sous anesthésie locale et est assurée par un vétérinaire. Le volume de sang récupéré dépend du poids et des données hématologiques de l'animal. Cette opération se fait de façon stérile à la ferme, puis se poursuit dans une salle blanche (une salle blanche est une pièce ou une série de pièces où la concentration de particules est maîtrisée afin de minimiser l'introduction, la génération, la rétention de particules à l'intérieur. Les paramètres tels que la température, l'humidité et la pression relative sont également maintenus à un niveau précis. (Selon la norme ISO 14644-1)) ne contenant que du matériel nécessaire au traitement du sang.

Le sérum est séparé du sang par centrifugation selon le protocole décrit précédemment [14], puis contrôlé par électrophorèse pour en déterminer certains pourcentages protéiques, et enfin recueilli dans des flacons stériles et conservé sous forme liquide à - 20°C.

Pour assurer l'innocuité des produits et la sécurité des patients, des analyses biochimiques et microbiologiques sont effectuées sur le sérum obtenu avant d'être libéré pour débuter le procédé de production des globulines.

Le sérum recueilli contient une panoplie de protéines et compte tenu des objectifs thérapeutiques de production des sérums, la nécessité d'obtention des immunoglobulines purifiées s'impose. Ainsi l'étape de purification consiste dans un premier temps, à précipiter les Ig dans le sérum obtenu en se débarrassant de l'albumine. Secondairement, au cours de cette purification, les techniques ont été adaptées pour assurer en même temps l'inactivation et/ou l'élimination virale totale.

Parmi les différents protocoles de purification des immunoglobulines étudiés dans la première partie, les laboratoires utilisent la précipitation par les sels d'ammonium, qui est la plus connue. Aussi il existe un autre protocole basé sur la précipitation par l'acide caprylique, plus utilisé et décrit par Redwan el-RM [36], comme étant plus efficace que le premier.

Le pH du sérum est ajusté à 3,3 par ajout de l'acide acétique à 1,76 N. La prochaine étape consiste à précipiter les anticorps contenus dans le sérum en présence des sels d'ammonium (sulfate d'ammonium) (fig. 10).

Ensuite la digestion des immunoglobulines précipitées, en présence de la pepsine, aboutit à l'obtention des fragments F(ab')2 et Fc (fig. 12). La filtration qui suit permet d'éliminer le fragments Fc et en ne retenant que les fragment F(ab')2 qui constituent le principe actif des sérums thérapeutiques. La filtration se fait en présence des agents de filtration qui ont pour rôle de stériliser le produit [5].

Comme dans la plupart des laboratoires de production des sérums thérapeutiques, c'est le protocole utilisé par le laboratoire Serolab en Suisse. Il est basé sur une précipitation en présence d'acide caprylique (fig. 15). L'acide caprylique est un acide gras insaturé retrouvé dans les huiles végétales et les graisses animales ou obtenus par synthèse chimique.

Le sérum initialement conservé à +4° C est réchauffé à +56° C pendant 90 minutes puis ramené à la température ambiante (20#177; 5° C). L e pH est ajusté à 5,5 par ajout d'acide acétique 1,76%. Puis l'acide caprylique est ajouté jusqu'à une concentration finale de 5% suivi de l'agitation vigoureuse pendant une heure à température ambiante. Ensuite le mélange est centrifugé à 3000 x G pendant 30 minutes pour ôter le précipité du mélange. Le surnageant est filtré à travers une membrane de 0,45 pm puis dialysé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 et stérilisé par filtration à travers une membrane de 0,22 pm. Enfin, le produit est pasteurisé à 60° C pendant 10 heures [31].

Le produit final est stérile, la teneur moyenne en protéine est généralement d'environ 20g/l, celle de l'albumine est réduite à moins de 2g/l et la concentration d'acide caprylique se retrouve à une valeur inférieure à 0,05 mmol/l.

Ce processus de production des immunoglobulines peut être facilement validé et adapté à une grande production. Un appareillage muni d'un logiciel d'exploitation programmable (fig. 16) a été créé par Riera Nadeu (Barcelone, Espagne) pour la précipitation à grande échelle en présence l'acide caprylique et intégrant un système automatique de nettoyage.

Pasteurisation

Inactivation virale

Figure 15. Représentation schématique du procédé de production des globulines (Source, [41]).

Figure 16. Appareillage muni d'un logiciel d'exploitation programmable pour une purification à grande échelle des globulines par l'acide caprylique, fait par Riera Nadeu (Barcelone, Espagne) [31].

Utilisation des produits biologiques d'origine équine en thérapeutique humaine

I.1.1.3 Modalités d'immunisation

I.1.2 Obtention du sérum

I.1.2.1 Ponction du sang