Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

3) Le motif Winged Helix du domaine K2 présente une surface ultra conservée

Nous avons utilisé le logiciel CONSURF (http://consurf.tau.ac.il/) disponible sur le web afin de déterminer s'il existe une ou plusieurs surfaces conservées durant l'évolution du domaine K2 de KIN17. A partir d'un alignement de séquences issues d'organismes différents

et de la structure de K2, CONSURF permet de visualiser grâce à un code couleur l'état de

conservation phylogénétique des surfaces de la protéine.

Nous avons vu précédemment que les domaines à motif Winged Helix capables de lier

l'ADN utilisent leur hélice H3 et leur boucle W1 pour interagir avec les acides nucléiques, et ceci quel que soit le mode de reconnaissance adopté ou le type d'ADN reconnu. Aussi, ces domaines présentent une surface fonctionnelle H3-W1 généralement très conservée qui maintient leur fonction au cours de l'évolution. De manière générale, KIN17 est une protéine remarquablement conservée chez les organismes eucaryotes et notamment au niveau de sa région N-terminale contenant le motif Winged Helix. L'analyse de la structure de K2 humaine

par le logiciel CONSURF fait apparaître que les résidus exposés de l'hélice H3 semblent peu conservés au vu de l'état de conservation général du domaine, alors que ceux qui forment la

surface de la boucle W1 et du brin S2 sont relativement bien conservés (Figure 5.12).

^H4 +

C

H1

très conservé

S1

H3

S2

S3 H2

W1

N

H2.5

pression

évolutive

^_ non conservé

90°

W1

S3

S1

^S2 H3

H2

H4

H2.5

C

N43

E48

I50

H57

T65

N59

A60

H1 N

H55

Figure 5.12 : Mise en évidence d'une surface ultra conservée du domaine K2 de KIN17. Les

vues du dessus sont dans la même orientation et mettent en évidence la surface H3-S2-W1 de K2. De la même manière, les vues du dessous correspondent à la surface H2-H2.5 (soit une rotation d'environ 90°). Les surfaces représentées à gauche sont colorées en fonction de l'état de conservation des résidus au cours de l'évolution (d'après CONSURF).

De manière intéressante, l'analyse CONSURF met également en évidence une surface ultra conservée située sur la face perpendiculaire et adjacente à la surface S2-W1. Cette surface que nous nommerons H2-H2.5 est formée par les chaînes latérales de 8 résidus qui appartiennent à l'hélice H2, à la boucle entre H2 et H3, et à l'hélice 310 H2.5. Le calcul du

potentiel électrostatique de surface avec le programme APBS montre que cette face H2-H2.5,

qui comporte 4 résidus hydrophobes (2 histidines, une isoleucine, et une alanine), est peu polaire et plutôt neutre. Ce type de surface relativement hydrophobe est tout à fait favorable à une interaction de type protéine-protéine. Que signifie d'un point de vue fonctionnel la présence d'une telle surface ultra conservée ? Le motif Winged Helix de K2 serait-il capable d'interagir avec un partenaire protéique via cette surface ?

Les domaines à motif Winged Helix sont principalement connus pour leur capacité à lier et fixer l'ADN. Cependant, il existe des exemples de motif impliqué dans des interactions

de type protéine-protéine. Jusqu'au début des années 2000, les seules interactions protéine- protéine connues des Winged Helix se limitaient à des interactions d'homodimérisation ou d'hétérodimérisation avec d'autres motifs Winged Helix (Littlefield & Nelson, 1999 ; Zheng

et al., 1999). Ces domaines, qui présentent une interface de dimérisation, sont également capables de lier l'ADN et possèdent une surface H3-W1 positive et très conservée au cours de l'évolution, ce qui n'est pas le cas de cette surface dans le domaine K2.

A ce jour, il existe à notre connaissance 2 structures de domaine Winged Helix capables de se lier à un partenaire protéique de nature différente, et qui ne lient pas l'ADN. Il s'agit du domaine C-terminal de la sous-unité RPA32 de la protéine de réplication A (Mer et

al., 2000), et du domaine RAP74 de la sous-unité TFIIF du facteur de transcription TFII (Nguyen et al., 2003). RPA32 fixe le peptide 73-88 de la protéine UNG2 via une surface négative et hydrophobe composée de résidus de l'extrémité C-terminale de H3 et des brins S2

et S3. L'interface d'interaction de RAP74 avec le peptide 944-961 de FCP1 est différente : elle implique des résidus des hélices H2 et H3 qui forment une surface positive et hydrophobe. De manière intéressante, RAP74 contient une hélice á additionnelle de 4 résidus entre H2 et H3. Cette hélice H2.5 n'est cependant pas impliquée dans l'interaction avec FCP1. Les bases moléculaires de la reconnaissance du partenaire protéique sont donc différentes chez RPA32 et RAP74. Cependant, ces 2 protéines possèdent plusieurs caractéristiques structurales communes au domaine K2 : elles présentent une surface H3-W1 peu polaire et peu conservée, et leur surface d'interaction avec leur partenaire protéique est conservée et plutôt hydrophobe, ce qui est également le cas de la surface ultra conservée de

K2 de KIN17.

La surface hydrophobe conservée du motif Winged Helix de KIN17 pourrait donc être

impliquée dans une interaction avec un partenaire protéique. Elle pourrait également servir à interagir avec un autre domaine au sein même de la protéine, et ainsi contribuer à l'organisation intramoléculaire des domaines de KIN17. De manière intéressante, le module prédit en « doigt de zinc » est très proche du motif Winged Helix dans la séquence primaire de KIN17. Ceci laisse supposer l'existence d'interactions entre ces 2 domaines.