Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

CHAPITRE 5

Relations structure-activité : quel est le rôle

du domaine K2 de KIN17 humaine ?

Comme je l'ai exposé dans le premier chapitre, la protéine KIN17 présente plusieurs

caractéristiques fonctionnelles qui suggèrent son implication dans la régulation et la maintenance du génome. Ses fonctions précises, ses partenaires biologiques, et ses modes d'action sont toujours inconnus en ce début d'année 2006. A présent, la connaissance de la structure tridimensionnelle de la région 51-160 de KIN17 humaine (domaine K2) apporte des informations supplémentaires qui pourraient nous aider à identifier une (ou plusieurs) de ses fonctions biologiques. Ceci nécessite dans un premier temps de répondre à un certain nombre

de questions : quelle est la nature du repliement du domaine K2 ? Quels sont les fonctions, les partenaires, et les mécanismes d'action des protéines qui présentent ce type de repliement ? Dans le cas où les bases moléculaires de ces modes d'action seraient connues, le domaine K2 possède-t-il les propriétés structurales nécessaires à la fonction de ces protéines structuralement homologues ? Ce paragraphe a pour objet d'apporter des éléments de réponse

à ces questions. La recherche de fonction d'une protéine par une approche purement structurale présente cependant un caractère spéculatif. Aussi, parallèlement à cette étude, une recherche des partenaires biologiques du domaine K2 a été entreprise au Laboratoire de Structure des Protéines par une approche biochimique. Ces résultats seront également présentés dans ce paragraphe dans le but d'approfondir la connaissance des relations structure-activité de la région 51-160 de KIN17 humaine.

1) Le domaine K2 de KIN17 adopte un repliement de type Winged Helix

Nous avons recherché les homologues structuraux du domaine K2 à l'aide du programme DALI disponible sur le web (Holm & Sander, 1993) afin de caractériser la nature

de son repliement. Le serveur DALI compare la structure tridimensionnelle d'une protéine cible avec chacune des structures enregistrées dans la Protein Data Bank (www.rcsb.org), puis établit un score en fonction du degré d'homologie. Dans le cas du domaine K2, des scores significatifs ont été obtenus avec des protéines qui appartiennent à une famille structurale unique : la famille des Winged Helix.

Le motif Winged Helix est une sous-classe de la superfamille des domaines « hélice- coude-hélice » de liaison à l'ADN (Pour revue : Gajiwala & Burley, 2000). Ce motif, commun aux organismes procaryotes et eucaryotes, a été découvert pour la première fois en

1993 chez le facteur de transcription eucaryote HNF-3 (Clark et al., 1993). La topologie

canonique d'un domaine Winged Helix est de la forme H1-S1-H2-T-H3-S2-W1-S3-W2 où

S1, S2, et S3 forment un feuillet â anti-parallèle situé en périphérie du motif « hélice-coude- hélice » H2-T-H3 (Figure 5.1). W1 et W2 sont deux boucles situées en région C-terminale et dont la disposition autour de l'hélice H3 évoque les ailes d'un papillon, ce qui explique le nom Winged Helix.

W1

H2

^{S2 S3 S1} N

H1

H3

C

W2

Figure 5.1 : Description de la topologie d'un motif Winged Helix canonique.

Au-delà de la présence du feuillet â, la longueur de la région contenant le coude qui relie H2 et H3 différencie les motifs Winged Helix des motifs « hélice-coude-hélice » classiques. Ainsi, cette longueur est très variable dans les Winged Helix, alors qu'elle se limite généralement au nombre de résidus qui forment le coude T dans les motifs « hélice-coude- hélice » (Brennan & Matthews, 1989). D'autre part, la topologie d'un repliement de type Winged Helix se révèle très différente d'une protéine à l'autre. Les éléments N-terminaux H1

et S1 sont fréquemment absents du motif. C'est le cas par exemple des facteurs de transcription TorI (Elantak et al., 2005) et MuR (Wojciak et al., 2001) dont la structure a été résolue par RMN en solution et où l'hélice H1 est manquante. La longueur du brin S1 dépasse rarement 4 acides aminés et dans de nombreux cas, comme dans la structure du domaine

C-terminal du facteur de transcription TFIIEâ résolue par RMN (Okuda et al., 2000), seul un résidu hydrophobe de la région reliant H1 et H2 est en contact avec les brins S2 et S3 du feuillet â. La topologie de la région contenant le coude qui relie les hélices H2 et H3 est également variable et peut comporter des éléments de structure secondaire additionnels. C'est

notamment le cas des facteurs de transcription AphA (De Silva et al., 2005) et Genesis

(Marsden et al., 1997) qui contiennent une hélice á supplémentaire dans cette région. Sur la

base de ces observations, il apparaît que le motif minimum qui caractérise un repliement de type Winged Helix est constitué du motif « hélice-coude-hélice » H2-T-H3 et de la région C- terminale contenant les 2 brins â.

Au vu de l'homologie de topologie existante entre le domaine K2 et le motif Winged Helix canonique, il apparaît que la région 51-160 de la protéine humaine KIN17 adopte un repliement de type Winged Helix. Le domaine K2 contient un tour d'hélice 310 atypique dans

la région du coude entre les hélices H2 et H3, ainsi qu'une hélice H4 supplémentaire à la

périphérie du motif. De plus, chez K2, la boucle W1 est très courte et se limite aux résidus

P85 et K86 qui forment un coude â de type I entre les brins S2 et S3. D'après l'analyse DALI,

le domaine structural le plus proche de K2 est le motif Winged Helix Zá de la protéine ADAR1 (Schwartz et al., 1999). La figure 5.2 représente dans la même orientation les structures de K2 et de ce domaine, et illustre bien la forte homologie structurale entre ces deux protéines.

C

C

N

N

Figure 5.2 : Représentation du squelette Cá des domaines K2 de KIN17 en rose et Zá de

ADAR1 en bleu (PDB : 1QBJ). L'hélice H4 de K2 n'est pas représentée.

Un alignement de séquence primaire mené sur une quarantaine de séquences de KIN17 appartenant à des espèces eucaryotes met en évidence que 9 des 13 résidus qui forment le coeur hydrophobe de K2 sont conservés (non montré). Cet alignement fait également apparaître que 8 des 15 acides aminés qui appartiennent à la région entre H2 et H3 contenant l'hélice 310 sont très conservés. Par conséquent, il est raisonnable d'affirmer que toutes les protéines KIN17 eucaryotes adoptent en région N-terminale un repliement de type

Winged Helix similaire à celui du domaine K2 de KIN17 humaine.

Lorsque la caractérisation structurale de la protéine KIN17 a été entreprise, la

prédiction bio-informatique menée par le programme SMART suggérait la présence d'un domaine FF de liaison aux peptides phosphorylés dans la région 50-150 de KIN17. De manière intéressante, la topologie canonique d'un motif FF de type H1-H2-H2.5-H3 (avec H2.5 une hélice 310) est très proche de la topologie de la région N-terminale du domaine K2 (H1-S1-H2-H2.5-H3). Ces 2 domaines sont constitués d'un tonnelet orthogonal central formé

par les hélices H1, H2, et H3. Nous avons soumis la région N-terminale de K2 au serveur DALI afin de rechercher les domaines qui présentent une homologie structurale avec cette région. Malgré l'absence du double brin â C-terminal, les résultats obtenus montrent que les domaines les plus structuralement proches de cette région de K2 sont tous des motifs Winged- Helix. L'analyse DALI ne fait apparaître aucun domaine FF comme homologue structural de cette région N-terminale de K2. La région 51-160 de KIN17 adopte donc un repliement divergent des domaines FF.