Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

Les contraintes expérimentales de distance et d'angle dièdre utilisées pour le calcul de

la structure de K2 sont issues de quatre observables RMN : l'effet Overhauser nucléaire ¹H, le couplage scalaire, le déplacement chimique, et les vitesses d'échange des protons amides.

La grande majorité des contraintes de distance est obtenue à partir des expériences 3D NOESY-HSQC éditée ¹⁵N, et ¹³C. Les pics de corrélation dipolaire ¹H-¹H sont sélectionnés

sur les spectres, puis leur volume est mesuré à l'aide du logiciel Felix (Accelrys). La démarche consiste dans un premier temps à définir des « boites » d'intégration autour de chaque pic nOe. Avant de mesurer le volume de ces boites, leur taille doit être optimisée, l'une après l'autre, afin d'éviter d'intégrer du bruit spectral ou un pic voisin, qui conduirait à des distances inter-atomiques erronées (souvent sous-estimées). Cette étape est donc cruciale dans l'optique de préparer un jeu de contraintes expérimentales de qualité. Selon la stratégie définie, l'attribution des pics nOe n'est pas nécessaire à ce stade de l'étude. Seuls les nOe inter-résidus qui traduisent la topologie des feuillets â sont attribués et convertis en

Le déplacement chimique des noyaux ¹³Cá, ¹³Câ, ¹³CO, ¹Há, et ¹⁵N peut être utilisé pour déterminer les angles et sur la base d'une prédiction empirique réalisée par le logiciel TALOS (Cornilescu et al., 1999). Ce programme recherche dans une base de données, actuellement constituée de 78 protéines, des triplets de résidus consécutifs ayant une homologie de déplacements chimiques et de type de résidu avec les triplets de la protéine étudiée. Pour chaque triplet de la protéine, les 10 tripeptides les plus proches en séquence et

en déplacements chimiques sont sélectionnés. Aussi, si les angles et des résidus centraux

de 9 de ces 10 triplets sont similaires, la prédiction est considérée comme fiable. Leur valeur

moyenne et l'écart type correspondant sont alors utilisés pour constituer les contraintes

Pour les résidus dont la prédiction TALOS n'est pas jugée satisfaisante, le jeu de données angulaires peut être complété à partir de la constante de couplage ³JHN-Há pour des valeurs inférieures à 5.5 Hz ou supérieures à 8 Hz (cf. § 2.2.2). L'intervalle des valeurs permises d'angle est alors déduit de la courbe de Karplus intégrée par les coefficients de

³JHN-Há (Hz)

contrainte sur l'angle (°)

³J > 9.0

8.0 < ³J < 9.0

5.5 < ³J < 8.0

5.0 < ³J < 5.5

³J < 5.0

-120 #177; 30

-120 #177; 40

-70 #177; 30

-60 #177; 30

Tableau 3.1 : Intervalles de contraintes sur l'angle en fonction de la constante ³JHN-Há.

Dans toute solution aqueuse, l'autodissociation de l'eau en ions H3O⁺et OH^-catalyse l'échange des protons amides avec les protons de l'eau (Englander et al., 1972). Selon ce principe, l'incubation d'une protéine dans une solution à 99% d'eau lourde va mener à la substitution progressive de la majorité des protons ¹HN par le deutérium de l'eau lourde. La cinétique de cet échange dépend d'une part, de l'accessibilité au solvant et d'autre part, de la liaison hydrogène dans laquelle un proton amide peut être impliqué en se liant à un oxygène

de carbonyle. Un proton ¹HN exposé au solvant et non engagé dans une liaison hydrogène

s'échangera très rapidement, alors que dans le cas d'un proton amide impliqué dans une liaison hydrogène, la vitesse d'échange sera d'autant plus lente que cette liaison est enfouie dans le coeur hydrophobe de la protéine. Par conséquent, une expérience de spectroscopie d'échange ¹H-²D suivie sur spectres HSQC ¹H-¹⁵N peut permettre de localiser une partie des protons amides impliqués dans une liaison hydrogène. Ces liaisons sont spécifiques de chaque structure secondaire. Aussi, la connaissance de la topologie de la protéine est utilisée

conjointement pour identifier les deux atomes impliqués dans chaque liaison. Cette donnée

structurale est finalement convertie en contraintes de distance de la manière suivante :

2.1 Å < dHN-O (i, i-4) < 2.5 Å	et	3.1 Å < dN-O (i, i-4) < 3.5 Å	dans une hélice á
2.1 Å < dHN-O (i, i-3) < 2.5 Å	et	3.1 Å < dN-O (i, i-3) < 3.5 Å	dans une hélice 310

2.1 Å < dHN-O (i, j) < 2.5 Å et 3.1 Å < dN-O (i, j) < 3.5 Å dans un feuillet â

Les contraintes structurales issues de l'interprétation des paramètres RMN ne permettent pas d'accéder directement à la structure tridimensionnelle de la protéine. Ces données expérimentales sont introduites dans des procédures de modélisation moléculaire afin

de construire des modèles à l'échelle atomique. Il s'agit de la modélisation moléculaire sous contraintes RMN, étape indispensable pour obtenir une représentation graphique de la structure 3D d'une protéine.

La méthode s'appuie sur des calculs théoriques de mécanique moléculaire et de dynamique moléculaire pour déterminer un ensemble de conformations, qui correspondent à des minima énergétiques, et qui sont en accord avec les données expérimentales RMN. Dans

le cadre de l'étude de la protéine K2, nous avons utilisé le logiciel de modélisation CNS adapté au traitement de données expérimentales obtenues par radiocristallographie ou par RMN. Les principes de mécanique et dynamique moléculaire sur lesquels repose ce logiciel seront évoqués en première partie de ce paragraphe. La seconde partie sera consacrée à la présentation du programme d'attribution automatique des pics nOe, qui fonctionne en interface avec le logiciel CNS.

3.1) Principe de la mécanique moléculaire adaptée aux systèmes biologiques

Une grande part des systèmes auxquels la modélisation moléculaire s'intéresse ont une taille bien trop importante pour pouvoir être étudiés par des méthodes classiques de mécanique quantique de type ab initio ou semi-empiriques. En effet, malgré le perpétuel développement du domaine de l'informatique et notamment de la capacité de calcul, les

équations de mécanique quantique, utilisées pour représenter la fonction d'énergie de petites

molécules, ne peuvent être résolues dans le cas de macromolécules. C'est pourquoi, les simulations de mécanique et dynamique moléculaire s'appuient sur une représentation simplifiée de la fonction d'énergie appelée « champ de force ». Selon ce principe, à chaque état conformationnel correspond une énergie potentielle empirique définie par le champ de force, et qui est fonction des interactions attractives et répulsives entre les atomes. La conformation la plus stable est alors associée à l'état pour lequel la fonction d'énergie est la plus basse. Cependant, et avec ce seul terme d'énergie potentielle, une protéine qui fait l'objet d'une simulation de mécanique moléculaire peut adopter une multitude de conformations qui correspondent à des minima énergétiques locaux. L'intégration de contraintes expérimentales dans les protocoles de modélisation moléculaire permet de restreindre l'espace conformationnel à explorer, et de favoriser des configurations qui sont en accord avec les données expérimentales. Pour prendre en compte ces données, le champ de force est alors constitué, d'un terme d'énergie potentielle empirique Epot représentant les contraintes physiques internes à la molécule entre atomes liés et non liés, et d'un terme énergétique supplémentaire Econt qui tient compte des contraintes expérimentales (2.7). C'est le cas du champ de force du programme CNS qui sera présenté succinctement dans le paragraphe 3.2.

Une fois le champ de force choisi, l'objectif de la modélisation moléculaire sous

contraintes est de déterminer les conformations associées aux surfaces d'énergie les plus basses, et satisfaisant un maximum de contraintes RMN. Pour cela, il existe de nombreux algorithmes qui se différencient par leur efficacité et leur rapidité d'exécution.

Une minimisation d'énergie, par des algorithmes dits de mécanique moléculaire, est

un processus itératif qui a pour but d'optimiser la géométrie d'une molécule à partir d'une conformation initiale. Tous les paramètres définissant la géométrie du système (degrés de libertés) sont systématiquement modifiés par petits incréments jusqu'à ce que l'énergie atteigne un minimum, ou pendant un nombre de pas fixé préalablement. Les algorithmes de minimisation les plus couramment utilisés recherchent un minimum énergétique en se basant

sur le gradient de la surface d'énergie potentielle, c'est à dire sur sa dérivée première ou

seconde par rapport aux coordonnées atomiques. Ce gradient indique la direction du

minimum, tandis que sa valeur renseigne sur la « pente » locale de la fonction d'énergie. C'est

le cas de la méthode de la plus grande pente (steepest descent ; Arkfen, 1985), efficace lorsque la conformation est proche de la structure initiale, et de la méthode de gradient conjugué Powell (Powell, 1977), utilisée dans le protocole CNS, et plus adaptée aux systèmes dont le minimum énergétique est proche.

Figure 3.11 : Illustration de l'inconvénient des algorithmes de minimisation par la représentation schématique d'une surface d'énergie potentielle. La boule grise représente l'énergie potentielle d'une conformation initiale. La minimisation de l'énergie en se basant

sur des gradients de surface ne permet de déterminer qu'un minimum local proche de la structure de départ et souvent différent du minimum global.

Même si les algorithmes de minimisation basés sur le gradient de l'énergie potentielle permettent d'optimiser rapidement la géométrie d'un édifice moléculaire, ils conduisent le plus souvent au minimum énergétique local, le plus proche de la structure de départ, et très souvent éloigné du minimum global (Figure 3.11). Par conséquent, ces méthodes de calcul ne constituent certainement pas l'outil principal pour déterminer la structure d'une protéine par modélisation sous contraintes. La solution idéale serait une méthode capable d'explorer efficacement l'espace conformationnel d'un composé, c'est-à-dire l'ensemble des conformations qui lui sont accessibles. La manière la plus simple et la plus sûre serait de générer et d'optimiser des modèles en combinant toutes les possibilités conformationnelles imaginables. Cette approche, appelée recherche systématique, est cependant difficilement envisageable dans le cas de l'étude de macromolécules, où les temps de calcul exigés constitueraient alors un facteur limitant.

La dynamique moléculaire est une des méthodes qui permet d'explorer l'espace conformationnel d'une structure complexe. Elle a pour objectif de simuler les mouvements

internes d'une molécule en fonction du temps par le calcul du déplacement de chacun des

atomes. Elle repose sur les principes de la mécanique classique Newtonienne et la trajectoire

de chaque atome est définie par la relation fondamentale de la dynamique (2.8), qui relie la force Fi s'exerçant sur chaque atome à sa masse mi, son accélération ai, et sa position ri en fonction du temps t.

^{La force F}i ^{étant
reliée à la fonction d'énergie potentielle (2.9), il est
donc possible de}

calculer à tout instant t l'accélération ai s'exerçant sur chaque atome. Plusieurs algorithmes mathématiques sont proposés pour résoudre ces équations. Parmi ceux-ci, figure celui de Verlet (Verlet, 1967) dans lequel est utilisé un développement en série de Taylor du second ordre du vecteur position. Ainsi, connaissant la position à l'instant t, il est alors possible d'obtenir les positions r(t+ät) (2.10) et les vitesses v(t+ät) (2.11) des différents atomes. Cet algorithme implique un pas d'intégration ät très court de l'ordre de la femtoseconde (10^-15s) afin de maintenir une trajectoire stable.

Dans une simulation de dynamique moléculaire, l'énergie cinétique totale d'un système de N atomes peut être reliée à la température T via la constante de Boltzman kB :

Cette équation introduit la notion de température au sein des méthodes de dynamique

moléculaire. Plus cette température est élevée, plus la vitesse communiquée aux atomes sera importante. Par l'intermédiaire d'une hausse « fictive » de température, il est alors possible de fournir au système une certaine quantité d'énergie cinétique qui lui permet de franchir les barrières d'énergie potentielle, et donc d'explorer un espace conformationnel beaucoup plus large. Si la température est suffisamment importante, une molécule est alors potentiellement capable d'adopter toutes les conformations possibles. Une simulation de dynamique

moléculaire se réalise généralement en trois temps : après avoir attribué une vitesse initiale

aléatoire aux atomes par une distribution de type Maxwell-Bolzman, une augmentation de

température est simulée afin d'atteindre rapidement une valeur finale choisie (thermalisation).

La température est alors maintenue à cette valeur constante afin de répartir l'énergie cinétique

sur toute la molécule (équilibration). Finalement, la configuration du système est enregistrée à intervalles de temps réguliers durant une phase de recueil de données (collecte).

Le recuit simulé est une méthode de dynamique moléculaire couramment utilisée pour déterminer la structure d'une protéine par modélisation sous contraintes (Figure 3.12). Le nom de ce protocole s'inspire de la technique industrielle de « recuit » qui consiste à refroidir très lentement un matériau fondu, afin de lui permettre d'organiser au mieux sa structure moléculaire.

Figure 3.12 : Illustration d'une procédure de recuit simulé par la représentation schématique

d'une surface d'énergie potentielle. La dynamique à haute température permet d'explorer l'espace conformationnel et de s'éloigner de la structure initiale (non représentée). Les structures générées sont lentement refroidies de manière à occuper les zones stables de la surface d'énergie. Une dernière étape de minimisation permet d'optimiser les conformations

La méthode du recuit simulé consiste dans un premier temps à mener une dynamique à haute température (de 100 à 1000 K) à partir d'une structure initiale aléatoire étendue préalablement minimisée. Cet apport d'énergie cinétique permet d'explorer l'espace conformationnel et de se dégager des minima locaux proches des structures initiales. Après une période d'équilibration, la température est lentement diminuée jusqu'à 100 K afin de réduire l'énergie cinétique et de contraindre le système à occuper les états de plus basse

énergie. On peut comparer schématiquement cette étape à la phase de refroidissement de la

technique industrielle de « recuit » où une diminution très lente de la température conduit à l'obtention de l'espèce moléculaire la plus stable et qui possède une énergie libre minimale. Finalement, les dernières étapes du recuit simulé consistent à minimiser puis à collecter les structures ainsi calculées. Il est cependant important de noter que cette méthode ne garantit pas l'identification du minimum énergétique global, mais s'en approchera probablement dès lors que le jeu de contraintes expérimentales est optimisé (diminution cohérente des degrés de

Le logiciel CNS (Cristallography and NMR system ; Brünger et al., 1998) est dédié à

la détermination et au raffinement de structures tridimensionnelles à partir de données expérimentales obtenues par RMN ou radiocristallographie. Il repose sur les principes de mécanique et dynamique moléculaire et notamment celui du recuit simulé.

Comme nous l'avons évoqué précédemment, pour tenir compte des contraintes expérimentales, les champs de force utilisés par le programme CNS sont composés d'un terme d'énergie potentielle empirique Epot, et d'un terme supplémentaire Econt qui permet de contrôler le respect de ces contraintes :

L'énergie potentielle empirique d'une molécule est définie par l'ensemble des

composantes qui décrivent sa géométrie. Elle est la somme de deux termes, l'un représentant

les interactions entre atomes liés Eliés et l'autre, les interactions entre atomes non liés Enon_liés :

^{La description succincte des différents termes de la
fonction E}pot ^{est réalisée à
partir}

des composantes du champ de force CHARMM (Brooks, 1983) dont dérive le champ de force

Les termes énergétiques associés aux interactions entre atomes liés permettent en

premier lieu de maintenir la géométrie covalente de la molécule. Ils rendent compte du coût énergétique de l'élongation des liaisons covalentes (r), des fluctuations, de l'angle è formé par deux liaisons covalentes, de l'angle dièdre impropre ù pour maintenir la chiralité d'un groupe d'atomes, ou bien encore de l'angle de torsion formé par un groupe de quatre atomes (n correspondant à la période de la fonction cosinus). Les trois premiers termes de la fonction Eliés sont des potentiels harmoniques centrés sur une position d'équilibre de géométrie idéale

^(r0^{,
è}0^{, et
ù}0^{). Ces valeurs de
référence dérivent de modèles
moléculaires obtenus, soit}

expérimentalement par diffraction des rayons X ou de neutrons, soit par des calculs théoriques de type ab initio. Les différentes valeurs des constantes de force kr, kè, et kù sont quant à elles obtenues à partir d'analyses vibrationnelles de molécules en phase gazeuse. Ainsi, par cette représentation de la fonction d'énergie Eliés, la géométrie moléculaire peut être considérée comme une série d'oscillateurs composés de billes et de ressorts. La somme des contributions de ce terme traduit alors les écarts des structures calculées par rapport à des géométries de référence.

^{Le terme d'énergie des interactions entre
atomes non liés E}non_liés ^{est
la somme des}

contributions correspondant aux interactions de type électrostatiques et de van der Waals entre couples d'atomes. En mécanique moléculaire, chaque atome est considéré comme une masse possédant une charge ponctuelle. Selon ce principe, l'interaction électrostatique entre deux charges partielles qi et qj distantes de rij est définie par un potentiel de type coulombien. L'intensité de l'interaction dépend notamment de la distance rij, et de la constante diélectrique

^{du milieu å}r^{. Le
paramètre å}r ^{sert à
reproduire les effets d'écran du solvant entre les charges.}

Aussi, un choix judicieux de la valeur år permet de mimer de manière implicite l'effet du solvant et de prendre en compte sa présence dans le calcul des interactions électrostatiques.

Les interactions de van der Waals traduisent l'attraction et la répulsion entre deux atomes séparés par une distance rij et constituant un dipôle. Le terme d'énergie correspondant

^{est un potentiel de Lennard-Jones qui contient une
composante attractive en 1/r}ij

électroniques des atomes les plus proches. Les coefficients Aij et Bij dépendent de la nature des atomes. Lorsque la distance rij est inférieure à la somme des rayons de van der Waals, c'est le terme répulsif qui prédomine et inversement pour une distance supérieure, c'est le terme attractif qui agit principalement.

Selon la description des termes de la fonction Enon_liée, des interactions de type électrostatiques et de van der Waals peuvent en théorie être observées entre deux atomes très éloignés en distance. La prise en compte de l'ensemble des combinaisons possibles entre paires d'atomes d'une macromolécule impliquerait un temps de calcul considérable. Pour réduire la durée de ces calculs, il est possible de limiter la portée des interactions en définissant un « seuil de coupure ». Selon ce principe, seules les interactions entre atomes séparés par une distance inférieure à ce seuil seront prises en compte par le champ de force. Aussi, pour éviter des discontinuités d'énergie induites par l'introduction de ces seuils, la fonction d'énergie Enon_liée est multipliée par une fonction d'amortissement ou de « switch » (Brünger, 1992). Ce type de fonction permet de faire tendre progressivement les énergies électrostatiques et de van der Waals vers zéro, et donc d'éviter des coupures brusques pouvant

Les contraintes expérimentales, introduites dans les protocoles de recuit simulé sous forme d'intervalles de valeurs permises, sont associées à des termes énergétiques supplémentaires dans le champ de force de CNS. Ces termes traduisent le degré de prise en compte de ces données. Le non respect d'une contrainte conduit à une pénalité énergétique, appelée violation, qui informe de l'écart entre une valeur de distance ou d'angle dièdre dans une structure calculée, et l'intervalle de valeurs autorisées correspondant.

Le logiciel CNS propose plusieurs types de fonctions potentielles pour exprimer le

terme énergétique des contraintes de distance EnOe. Dans le cadre du calcul de la structure du domaine K2, nous avons utilisé les deux fonctions suivantes :

^{où r}min ^et
rmax ^{représentent les limites de
l'intervalle de distances permises pour une contrainte}

donnée, d est la distance correspondante dans le modèle, KnOe est la constante de force, et n

est généralement égal à 2. Notons par ailleurs que le terme EnOe est systématiquement nul lorsque la valeur de distance d est encadrée par les valeurs rmin et rmax.

Lorsque la distance d mesurée dans un modèle se situe nettement en dehors de l'intervalle de valeurs permises, le potentiel carré conduit à une pénalité énergétique importante qui pénalise le système et ralentit la convergence des structures. Pour éviter que

les énergies de contraintes ne soient trop élevées, le potentiel biharmonique adoucie est utilisé lorsque l'écart entre la distance d et l'intervalle de valeurs atteint un certain seuil. L'introduction d'une asymptote à la courbe (kasym), et des constantes a et b qui assurent la continuité de potentiel, permet ainsi d'adoucir la fonction EnOe dans les cas extrêmes (2.18).

^{Le terme énergétique E}dih ^{lié aux contraintes angulaires (ou ) est
représenté par une}

fonction potentielle carrée comparable à celle définie ci-dessus et de la forme suivante :

^avecx ^{la limite minimum ou
maximum de l'intervalle de valeurs autorisées pour une}

contrainte donnée, la valeur d'angle dans le modèle, et Kdih la constante de force associée.

Le paragraphe suivant décrit les différentes étapes de la simulation de dynamique moléculaire utilisée pour calculer la structure du domaine K2 de la protéine humaine KIN17.

L'étape préalable aux calculs de dynamique moléculaire consiste à générer des structures initiales par tirage aléatoire des angles et . La topologie de la protéine est obtenue à partir d'un champ de force simplifié défini par les paramètres standard des fichiers parallhdg et topallhdg. Le fichier topallhdg décrit tous les acides aminés avec le type d'atome, de liaison, et d'angle qui les constituent, ainsi que la charge partielle et la masse des atomes. Ce fichier est utilisé par CNS pour créer le fichier de topologie PSF spécifique à la séquence du domaine K2. Les paramètres du champ de force sont définis dans le fichier parallhdg qui contient toutes les valeurs d'équilibre des liaisons et des angles de valence dièdres et impropres relatives aux différents termes énergétiques. La fonction d'énergie

^{Cette fonction exclue donc les termes
E}dièdres ^et
Eélectrostatique ^{uniquement pris en compte
dans}

le champ de force CHARMM22 utilisé pour le raffinement des structures. Par ailleurs, le terme des interactions de van der Waals est remplacé par un potentiel continu purement répulsif (Erepel) similaire à la composante répulsive du potentiel de Lennard-Jones. Ce terme

^{est associé à une constante de force
k}vd_Waals^{, et à un facteur multiplicateur
du rayon minimum}

Lors du recuit simulé, la fonction d'énergie du système est recalculée après chaque pas

de simulation à partir de la position des atomes via les équations de Newton. Les positions des protons géminés sont régulièrement échangées pendant la procédure (coordonnées et vitesses)

de manière à choisir la configuration dans laquelle l'énergie est minimum. Il en est de même pour les méthyles chiraux. Les valeurs des principaux paramètres utilisés pendant la

Recuit simulé

T° [K]

Nombre

de pas

^kvd_Walls

^krepel

^knOe

^kdih

kè

^kù

i) Minimisation

ii) Chauffage

iii) Echantillonnage

iv) Refroidissement

v) Minimisation

2000

entre 1000

et 2000

1950?100

1300

2500

1000

2500

0.003

0.003?4

0.9

0.9?0.75

0.75

10?50

200

1000

500

Tableau 3.2 : Evolution des principaux paramètres au cours du recuit simulé. Les constantes

^{de force sont exprimées en kcal.mol-1.rad-2
à l'exception de k}r ^{et k}nOe ^{exprimé en kcal.mol-1.Å-2.}

i) La première étape consiste en une minimisation de la structure initiale étendue par

ii) Le recuit simulé débute par une dynamique de type Verlet où le système est porté à une température de 2000 K. Les constantes de force relatives aux termes d'énergie des élongations de distance, des angles de valence, et des angles impropres sont maintenues à une forte valeur pendant toute la durée de la simulation afin de conserver la géométrie covalente de la protéine. A contrario, la valeur de constante de force kvd_Waals est dans un premier temps choisie faible dans le but d'autoriser les atomes à s'interpénétrer, ce qui permet d'explorer l'espace conformationnel. Aussi, le facteur krepel est fixé à 0.9 afin d'éviter le collapse de la protéine. Lors de cette première phase de chauffage, les contraintes expérimentales sont prises en compte par introduction des termes EnOe et Edih. Les contraintes de distance sont par ailleurs

^{privilégiées via une valeur de
k}nOe ^{progressivement augmentée de 10
à 50.}

iii) La troisième étape du protocole est une phase d'échantillonnage où la température oscille entre 1000 et 2000 K. La constante kvd_Waals est progressivement augmentée de

^{0.003 à 4 pour restreindre la
pénétration des atomes alors que le facteur
k}repel ^est

iv) La dernière étape de dynamique consiste en un refroidissement du système de 1950

à 100 K où les contraintes d'angles dièdres sont pleinement prises en compte via une valeur de constante de force fixée à 200.

v) La simulation s'achève par une minimisation des structures calculées par un algorithme de type Powell.

Développé récemment au Laboratoire de Structure des Protéines du CEA de Saclay (LSP), le programme d'attribution automatique des nOe est un module de gestion de scripts et logiciels dédiés à la résolution de structures tridimensionnelles de biomolécules par RMN (Savarin et al., 2001). Outre l'attribution des pics nOe, les quatre autres principales fonctions

du programme sont : la conversion des données expérimentales en contraintes, l'utilisation et

le contrôle des calculs de CNS, l'exploitation des fichiers de sortie de CNS, et l'analyse des structures. La succession de ces différentes actions constitue un cycle de calcul.

L'attribution automatique des nOe est un processus qui n'est efficace que s'il est mené

de manière itérative. De ce fait, le programme procède au début de chaque cycle à une nouvelle attribution qui dépend des modèles de plus basse énergie de l'itération précédente.

La répétition des cycles de calcul permet d'optimiser l'attribution des pics au fil des itérations, et conduit à une convergence des structures vers un repliement unique. Les paragraphes suivants sont consacrés à la description des méthodologies utilisées par le programme pour attribuer et convertir les volumes des pics nOe en contraintes de distance.

Comme nous l'avons évoqué dans le chapitre 2.1.1, le volume d'un pic de corrélation dipolaire Vij entre deux protons i et j peut être relié à la distance rij séparant les deux noyaux

^{La distance r}ij ^{constitue
alors une contrainte de distance non ambiguë. En revanche,
lorsque}

plusieurs attributions sont possibles pour un même pic, le programme d'attribution automatique considère le volume de ce pic Vx comme la somme des contributions dipolaires entre plusieurs paires de protons :

avec rx l'ensemble des distances entre paires d'atomes i et j relatif au n nombre d'attributions possibles. Selon ce principe, la contrainte de distance ambiguë r introduite par Nilges en 1995

Cette notion de contrainte ambiguë est fondamentale car elle va permettre d'intégrer au calcul

de la structure des informations nOe dont l'attribution est incertaine. La gestion des attributions ambiguës et non ambiguës est un des principes sur lequel repose la stratégie du programme d'attribution automatique.

La conversion des volumes nOe en distance nécessite de déterminer préalablement la valeur du facteur de calibration Rcal relative à chaque expérience NOESY-HSQC. La méthode classique consiste à relever le volume de plusieurs pics référents Vref qui correspondent à la corrélation de 2 protons géminés aliphatiques, ou de 2 protons aromatiques appartenant au même cycle, et dont la distance rref les séparant est connue et fixe. La valeur de Rcal peut alors être obtenue par la relation suivante :

^{avec V}moy ^{la moyenne des
volumes V}ref^{. Cette méthode manuelle
et simple permet une}

première estimation approximative de la valeur de facteur de calibration utilisée lors des premières itérations. Le programme d'attribution automatique offre la possibilité d'obtenir une calibration plus exacte à partir des premières structures repliées de la protéine. La procédure consiste à comparer les distances calculées à partir du volume nOe (r^nOe) avec ces mêmes distances mesurées dans les modèles (r^obs) (2.25). Selon ce principe, une valeur de

rapport C proche de 1 indique que la valeur de facteur de calibration Rcal utilisée est adaptée à

^{la quantification des volumes nOe. Dans le cas contraire, le
paramètre R}cal ^{doit être
réajusté}

selon que la valeur de C est inférieure ou supérieure à 1. Cette méthode est avantageuse car elle donne la possibilité d'affiner la calibration au fil des itérations.

Comme nous l'avons évoqué dans le paragraphe 2.1.1, le rapport de proportionnalité entre le volume nOe et la distance inter-atomique ¹H repose sur l'approximation d'un mouvement isotrope de la molécule étudiée (ôc moyenné). Aussi, la différence de ôc résultant

de mouvements internes de la protéine, et le phénomène de diffusion de spin, rendent la quantification du nOe approximative. Pour tenir compte de cette imprécision, les distances inter-protons sont classiquement introduites dans les protocoles de calcul CNS sous forme

avec ? représentant l'erreur sur la contrainte de distance rij. Le programme d'attribution automatique propose à l'utilisateur 3 expressions distinctes pour calculer le paramètre ? :

Ces expressions peuvent être utilisées pour définir l'erreur sur les contraintes de distance entre protons de la chaîne principale (variable ER_MODE_SQE), et sur les contraintes d'autre nature (variable ER_MODE). Dans le cas de l'étude du domaine protéique K2, l'incertitude ?

sur la distance rij séparant deux protons de la chaîne principale a été estimée à 25% de rij (ER_MODE_SQE = 1). L'amplitude des mouvements de chaîne latérale pouvant influer de manière significative sur l'intensité du nOe, l'erreur sur la distance séparant un proton de chaîne latérale avec un autre noyau est généralement plus importante et a été estimée à 12.5%

Par ailleurs, les intervalles de valeurs permises doivent tenir compte de la réalité physique du nOe. Ainsi, le programme tolère une limite maximale définie par la variable

DRMNMAX et contrôlée par le mode DRMNMAX_MODE. Le mode suppression conduit au

rejet d'une contrainte dont la limite maximale est supérieure à la valeur de DRMNMAX. Pour notre part, la valeur de DRMNMAX a été fixée à 5.3 Å, et nous avons préféré utiliser le mode truncature qui réduit systématiquement la limite maximale d'une contrainte à la valeur de DRMNMAX lorsque celle-ci est supérieure à DRMNMAX.

L'utilisation du programme d'attribution automatique du LSP nécessite dans un premier temps de préparer un certain nombre de données initiales contenant :

- Une table des déplacements chimiques des noyaux ¹H, ¹⁵N, et ¹³C de la protéine pour chaque expérience NOESY-HSQC éditée ¹⁵N, et ¹³C.

- Une liste des pics nOe de chaque expérience où sont reportés le volume de chaque pic

- Un fichier de contraintes de distances non ambiguës attribué manuellement et qui renseigne sur la topologie de la protéine (fichier ss.cons).

Le fichier de topologie, appelé ss.cons, contient des informations de distance qui renseignent sur la structure secondaire et tertiaire de la protéine. Ces éléments obtenus après analyse des paramètres structuraux RMN indiquent principalement, la topologie des feuillets

â déduite des nOe caractéristiques inter-brins, et la formation de liaisons hydrogène déduites des expériences de spectroscopie d'échange. Il est à noter que les fichiers de contraintes dièdres et de topologie ne sont pas utilisés de manière directe pour attribuer les pics nOe dans

le programme d'attribution automatique. Ces données sont converties au format CNS, et systématiquement introduites dans les protocoles de calcul CNS à chaque itération, et quelles que soient les attributions choisies. Par conséquent, un certain nombre d'informations de structure tertiaire sont dupliquées dans les fichiers de contraintes de CNS.

La première phase du processus d'attribution automatique consiste à comparer les valeurs des tables de déplacements chimiques de la protéine aux déplacements chimiques des

pics nOe afin d'établir la liste de toutes les attributions possibles de chaque pic. Pour cela, un

intervalle de tolérance est défini par l'utilisateur pour chacune des trois coordonnées des nOe.

Les gammes de tolérance classiquement testées sont : #177; 0.02 ppm dans la dimension ¹H

d'acquisition, #177; 0.25 ppm sur la fréquence de résonance de l'hétéroatome ¹⁵N ou ¹³C, et

#177; 0.04 ppm dans la dimension ¹H indirecte. Les nOe pour lesquels aucune possibilité d'attribution n'est déterminée constituent la liste des non attribués, et sont soumis à un nouveau processus d'attribution lors de l'itération suivante.

Par ailleurs, il est parfois constaté pour certains protons une légère différence entre la valeur de déplacement chimique définie dans les tables et la valeur réelle sur les spectres NOESY-HSQC. Aussi, le programme d'attribution automatique repère ces « décalages » systématiques afin que l'utilisateur puisse modifier en conséquence les tables de déplacements chimiques de la protéine en fin d'itération.

Une fois établie la liste de toutes les possibilités d'attribution relatives à chaque pic, chacune des corrélations potentielles entre 2 protons i et j est associée à une valeur de distance

dx. Le paramètre dx correspond à la distance moyenne qui sépare les 2 protons i et j dans les modèles de plus basse énergie de l'itération précédente (ou dans les structures initiales aléatoires pour la première itération). Il constitue la donnée principale utilisée par le programme pour choisir le nombre d'attributions de chaque pic. La méthode consiste à convertir chaque moyenne de distance dx, relative à une possibilité d'attribution, en une

^{Par cette définition, la contribution
I}x ^{traduit véritablement le poids
d'une attribution par}

rapport à une autre : plus la distance moyenne dx entre 2 protons est courte, et plus la contribution moyenne associée Ix sera importante. Ainsi, à l'issue de cette seconde étape, chaque possibilité d'attribution d'un pic donné est associée à un poids différent.

A ce stade du traitement des données, le programme utilise un paramètre de seuil p, compris entre 10^-4et 0.3, pour déterminer le nombre d'attributions retenues pour chaque pic :

^{les contributions I}x ^{sont
classées par ordre décroissant, puis chacune d'entre elles
est}

comparée à la précédente en commençant par la contribution la plus forte (systématiquement sélectionnée). Si pour une possibilité donnée, la valeur de son poids Ix-1 est supérieure au produit pIx, alors l'attribution est retenue et le poids Ix-2 est ensuite comparé au produit pIx-1

^{de la même manière. Dans le cas contraire, si
I}x-1 ^{< pI}x^{, alors
l'attribution est rejetée ainsi que}

toutes les autres dont la valeur de contribution Ix-n est inférieure à Ix-1. Le processus de sélection du nombre d'attributions est alors terminé. Au final, ce nombre ne peut excéder 20 attributions par pic.

Prenons l'exemple d'un pic pour lequel 5 attributions sont possibles. Dans le cas le plus simple, considérons les corrélations potentielles d'un proton A avec respectivement, un proton B, C, D, E, ou F. A chacune de ces possibilités d'attribution correspond, une distance moyenne séparant chacun des 2 protons respectifs dans les modèles précédents (dAB, dAC, dAD, dAE, et dAF), et une contribution moyenne associée (IAB, IAC, IAD, IAE, et IAF). La figure 3.13 représente l'histogramme des contributions classées par ordre décroissant.

Figure 3.13 : Principe de la sélection du nombre d'attributions d'un pic nOe en fonction du paramètre de seuil p. Les contributions sont dans un premier temps triées par ordre décroissant puis chacune d'elles est comparée à la précédente. Une possibilité d'attribution

Dans notre exemple, le poids IAB constitue la contribution la plus importante et sert donc de point de départ. La valeur de contribution IAC étant supérieure au produit pIAB, la possibilité d'attribution AC est par conséquent sélectionnée. La valeur de IAC est ensuite utilisée pour définir le seuil d'attribution suivant et conduit à la sélection de la possibilité AD car

IAD > pIAC. Chaque contribution est ainsi comparée à la précédente tant que la valeur de Ix-1 est

supérieure au produit pIx. Dans notre exemple, ce n'est plus le cas pour la possibilité AE car

^IAE ^<
pIAD^{, ce qui amène à rejeter les
attributions AE et AF. Finalement, seules les attributions}

Lors des premières itérations, l'utilisation d'une valeur faible de paramètre de seuil p

favorise les attributions multiples et par conséquent, la constitution de contraintes ambiguës.

Au fil des calculs, l'augmentation de la valeur de p permet de restreindre le nombre d'attributions possibles pour chaque pic, et donc de diminuer la quantité de contraintes ambiguës au profit des contraintes non ambiguës.

La sélection du nombre d'attributions par un paramètre de seuil présente plusieurs atouts. Le premier réside dans la capacité du programme à intégrer un maximum de possibilités d'attribution lors des premières itérations, et donc à explorer « l'espace conformationnel des nOe ». En effet, l'ajout d'attributions ambiguës à une contrainte de distance ne conduit pas à une violation énergétique tant que la véritable attribution figure dans

les différentes possibilités. La multiplication des contraintes ambiguës ne pénalise donc pas le système lors des premières itérations, mais elle contribue à une dilution de l'information, et limite la convergence des modèles. C'est pourquoi, la valeur de paramètre de seuil est incrémentée au fil des calculs afin de réduire progressivement le nombre d'attributions de chaque pic. Par ailleurs, notons ici le rôle important du fichier de topologie ss.cons qui permet d'orienter le repliement de la protéine dès les premiers calculs et par conséquent, de guider indirectement le programme vers les attributions les plus probables d'un point de vue de la structure 3D. Finalement, l'augmentation progressive du paramètre de seuil conduit à la convergence des structures générées vers un repliement unique dont les distances intra-

moléculaires ¹H correspondent le mieux à un jeu de données expérimentales nOe.

Comme nous venons de l'évoquer, la sélection du nombre d'attributions par pic est obtenue à partir de l'analyse des 10 structures de plus basse énergie de l'itération précédente

via le paramètre dx. Aussi, la distance rij relative à une possibilité d'attribution peut être très variable d'un modèle à l'autre, et notamment lors des premières itérations où la convergence des structures est faible. C'est pourquoi, le programme utilise une valeur seuil cut-off de 20 Å pour considérer une possibilité d'attribution dans un modèle. Dès lors, seules les possibilités

qui répondent à la condition rij < 20 Å dans un nombre suffisant de structures sont

sélectionnées. On parle ainsi de nombre de structures contribuant à une attribution. La valeur

de ce paramètre est progressivement augmentée au fil des calculs (de 4 à 6), ce qui contribue à

Deux modes sont proposés par le programme d'attribution automatique pour traiter les nOe relatifs aux corrélations intra-résiduelles. En mode intra, chaque possibilité de type intra- résiduel est associée à un paramètre dx de 1.0 Å, ce qui favorise considérablement ce type d'attribution par rapport aux autres possibilités via une valeur forte de Ix. En mode non-intra,

^{le paramètre d}x ^{est
utilisé comme défini dans le paragraphe précédent,
et quel que soit le type}

de corrélation. Le mode intra, utilisé pour la plupart des itérations, permet de limiter le nombre de contraintes ambiguës au profit d'attributions plus évidentes, ce qui conduit à une convergence plus rapide des structures. Ce mode favorise toutefois à outrance les attributions intra-résiduelles. Aussi, le mode non-intra est utilisé lors des 3 dernières itérations, lorsque la protéine est repliée, afin de tenir compte du repliement de la protéine de manière plus réaliste pour réaliser l'attribution automatique des pics.

Sur les spectres NOESY-HSQC éditée ¹³C, la présence d'un pic de corrélation entre 2 protons aliphatiques i et j sur un plan ¹³Ci peut être accompagnée d'un pic réciproque ou symétrique sur le plan ¹³Cj lorsque la résolution spectrale le permet. Dans le cas d'une corrélation de type inter-résiduelle, l'identification de 2 pics réciproques est un argument supplémentaire qui conforte leur attribution. Aussi, lorsque 2 pics symétriques sont repérés

par le programme, l'attribution de type « réciproque » est favorisée par rapport aux autres possibilités en recevant une valeur de paramètre dx de 1.5 Å. Après application du paramètre

de seuil, si ces 2 pics sont dotés de la même attribution, le programme supprime alors une des

Une fois établie la liste des attributions sélectionnées, le programme met à disposition

de l'utilisateur un certain nombre de filtres d'attribution dont l'objectif est d'améliorer la qualité des attributions, et donc des structures générées, en favorisant les conformations

vraisemblables. L'application de ces différents filtres conduit à une diminution du nombre

d'attributions et constitue la dernière étape avant la conversion en contraintes de distance au format CNS.

Malgré la notion d'intervalle de distances permises introduite pour tenir compte de l'incertitude de la quantification du nOe, il est possible que les distances associées aux volumes de certains pics soient démesurées par rapports aux distances correspondantes dans

les structures calculées. Ceci est notamment observé, pour des effets à longue distance, lors des premières itérations où la structure n'est encore que partiellement repliée. Aussi, l'intégration de ce type de contraintes peut conduire à des violations et pénalités énergétiques importantes. Le filtre dRMN trop grande repère et supprime ces pics trop intenses avant leur conversion en contraintes. Lors des itérations finales, l'application de ce filtre ne doit conduire qu'à rejeter un très faible nombre de pics pour lesquels la distance déduite du nOe apparaît trop courte en raison de problèmes d'homogénéité de la calibration ou de dynamique intra-moléculaire inhérents à la technique RMN.

Le filtre DIAG (pour diagonal plot) est utilisé pour éviter le calcul de conformations

qui correspondent à un repliement inexact ou incohérent d'une partie de la protéine. Il recherche et supprime les attributions longue distance dites « isolées ». En pratique, lorsque l'attribution d'un nOe est associée à la corrélation entre 2 protons appartenant à 2 résidus éloignés dans la séquence primaire, si aucun autre pic ne correspond à un contact longue distance entre protons appartenant aux mêmes résidus ou à des résidus voisins, alors l'attribution est considérée comme suspecte. Le pic est alors filtré mais l'attribution n'est pas définitivement supprimée. Au fil des itérations, le pic peut être à nouveau considéré si l'évolution du repliement fait apparaître d'autres nOe longue distance qui impliquent les mêmes régions de la protéine.

L'option SUPRES permet d'utiliser les informations de flexibilité des résidus non structurés des extrémités N- et C-terminales pour diminuer le nombre d'attributions. En effet,

ces résidus en échange conformationnel très rapide ne peuvent donner naissance à des nOe

longue distance sur les spectres de type NOESY où l'information est moyennée sur l'ensemble de l'espace conformationnel. Par conséquent, à partir d'une liste de ces résidus fournie par l'analyse du nOe hétéronucléaire ¹H-¹⁵N (cf. § 2.2.4), l'option SUPRES rejette systématiquement chaque attribution de type longue distance qui corrèle un proton de résidu quelconque avec un autre appartenant à un résidu de cette liste.

Selon le même principe, cette option supprime l'ensemble des attributions inter- résiduelles qui associent un proton de résidu quelconque avec un proton de chaîne latérale d'un résidu de la liste SUPRES_LAT. Ainsi, les filtres SUPRES et SUPRES_LAT permettent

de tenir compte de données dynamiques obtenues par RMN, et par conséquent, d'éviter le calcul de structures incohérentes avec ces paramètres.

Le fichier SUP2_ini est une liste arbitraire qui définit l'ensemble des attributions interdites pour chaque pic donné. Cette option offre à l'utilisateur la possibilité de contrôler partiellement l'attribution de certains pics nOe. Aussi, les filtres d'attribution ne sont utilisés qu'après application du paramètre de seuil p. Par conséquent, le filtre SUP2_ini ne permet pas d'influencer de manière directe l'attribution des nOe, mais conduit au rejet des pics dont une certaine attribution n'est pas souhaitée.

Les violations de distance systématiques retrouvées à chaque itération sont souvent dues à des erreurs d'attribution de résonance de la protéine, ou à l'intégration de pics qui correspondent en réalité à du bruit spectral. Aussi, les contraintes qui engendrent ce type de violations supportent une information erronée, qui peut ralentir la convergence du repliement

au fil des itérations, ou conduire à des conformations inexactes. Pour pallier ce problème, le programme d'attribution exploite les fichiers de sortie du logiciel CNS à la fin de chaque cycle, et établit la liste SUP2 des violations de distance supérieures à 0.5 Å communes à au moins 4 des 10 meilleures structures. Chaque attribution qui figure sur cette liste est alors

supprimée lors de l'itération suivante après application du paramètre de seuil. Notons par

ailleurs que la composition du fichier SUP2 est différente à chaque itération : aucune

attribution n'est supprimée définitivement et c'est à l'utilisateur que revient cette tâche.

Les ressources informatiques du Laboratoire de Structure des Protéines permettent le calcul d'un grand nombre de structures. Une sélection s'impose donc pour ne conserver que

les meilleures, du point de vue de la géométrie covalente et du respect des contraintes expérimentales. Plusieurs critères sont classiquement utilisés pour évaluer leur qualité :

Les valeurs des angles dièdres et des modèles générés doivent occuper les zones permises du diagramme de Ramachandran qui définit les régions favorables de l'espace conformationnel (Ramachandran et al., 1971). Le logiciel PROCHECK (Laskowski et al.,

1996) permet d'observer la répartition de ces couples d'angles, et facilite l'identification des structures secondaires. On considère généralement que les structures finales sont de bonne qualité lorsque moins de 1% des valeurs d'angles et occupent les régions interdites.

La fonction d'énergie est un paramètre fondamental pour valider les structures calculées. Les valeurs des différents termes énergétiques reflètent la qualité de la géométrie covalente, et renseignent sur le degré de prise en compte des contraintes expérimentales. Aussi, l'objectif de la répétition des processus itératifs n'est autre que de générer des structures dont l'énergie associée est la plus basse possible. Selon ce principe, les structures finales doivent présenter une bonne géométrie covalente, des violations de distance inférieures à 0.5 Å, et des violations d'angles dièdres inférieures à 10°, pour être considérées comme étant de bonne qualité.

La phase préliminaire du processus itératif consiste à générer 10 structures aléatoires à partir des fichiers de paramètres CNS qui définissent le champ de force et la géométrie de la protéine. L'attribution automatique de la première itération est réalisée à partir de ces structures aléatoires, et des différentes listes de déplacements chimiques et de pics nOe. Le nombre de structures contribuant à une attribution doit être supérieur à 4, et la valeur de p est fixée à 0.0001. Les facteurs de calibration sont dans un premier temps estimés à partir du volume de pics référents sur les différents spectres NOESY-HSQC. Après application des filtres d'attribution, le premier jeu de distances inter-atomiques ¹H est constitué. Les contraintes dièdres et de distance (dont les données de topologie) sont converties au format CNS, puis intégrées aux protocoles de dynamique moléculaire. Lors de la première itération,

un premier jeu de 100 structures est généré par le logiciel CNS. Le programme d'attribution prend alors en charge le traitement de ces 100 modèles. Les 20 structures de plus basse énergie sont sélectionnées, triées par ordre croissant d'énergie, puis les 10 premières font l'objet d'analyses systématiques : bilan des énergies moyennes pour chaque terme du champ

de force, analyse des angles et par le logiciel PROCHECK, et calcul des écarts quadratiques moyens sur le squelette. Le programme permet également d'obtenir une synthèse des violations de distance systématiques sur ces 10 meilleurs modèles à partir des fichiers de sortie du logiciel CNS.

Après traitement des résultats de la première itération, le programme entre dans un processus itératif de 22 cycles où se succèdent l'attribution des nOe, le calcul des modèles, et l'analyse des 10 meilleures structures (Figure 3.14). A l'issue de chaque cycle, les 10 modèles

de plus basse énergie, ainsi que la liste de leurs violations, sont utilisés pour réaliser l'attribution de l'itération suivante. Ces 10 meilleurs modèles constituent également les structures de départ des protocoles de dynamique moléculaire. Au fil des itérations, les valeurs de paramètre de seuil et de nombre de structures contribuant à une attribution sont progressivement augmentées (Figure 3.15). Il en est de même pour le nombre de structures

calculées qui est fixé à 200 à partir du treizième cycle, puis à 300 à la vingtième itération.

Figure 3.14 : Description d'un cycle itératif du programme d'attribution automatique des

nOe développé au Laboratoire de Structure des Protéines du CEA de Saclay (Savarin et al.,

Chapitre 3 : Stratégie d'étude par RMN et Modélisation Moléculaire du domaine K2

Figure 3.15 : Evolution de paramètres du programme d'attribution au fil des 22 cycles (It) du processus itératif. Les différentes annotations

correspondent au nombre de structures calculées (Ns), au nombre de structures contribuant à une attribution (Na), et au paramètre de seuil (p)

Chapitre 3 : Stratégie d'étude par RMN et Modélisation Moléculaire du domaine K2

Finalement, les 20 meilleures structures du dernier cycle sont soumises à une étape de

raffinement dans le champ de force CHARMM22 en solvant implicite. Les structures convergentes obtenues lors des dernières itérations sont utilisées pour réajuster les valeurs de facteur de calibration via le calcul du rapport C. Ces valeurs pourront être appliquées lors des processus itératifs suivants, puis à nouveau optimisées en recalculant le rapport C.

Comme nous l'avons évoqué précédemment, les violations sont dans la plupart des cas dues à des erreurs d'attribution de résonance de la protéine, ou à des inexactitudes inhérentes

à la spectroscopie de RMN (recouvrement spectral, dégénérescence du signal, bruit, dynamique interne...). L'analyse manuelle des violations en fin de chaque processus itératif

de 22 cycles est par conséquent nécessaire afin d'identifier les informations erronées en contradiction avec le repliement de la protéine. La correction progressive du jeu de données expérimentales est alors concomitante avec la baisse des énergies, la convergence des

structures, le respect du diagramme de Ramachandran, et l'élimination des violations.

Chapitre 4 : Caractérisation structurale du domaine K2 par RMN et Modélisation Moléculaire

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

2.3) Recueil des contraintes structurales