4) Conclusions
Dans le travail qui a été
présenté, nous avons abordé la première
étape de l'étude structurale de PRODH humaine en la
surexprimant chez la bactérie E. coli. Nous avons
montré que la production des protéines PRODH sauvage et
mature dans cet organisme conduit à l'unique formation de corps
d'inclusion, et ceci malgré une optimisation de quelques
paramètres d'expression et d'extraction.
Lorsque l'expression d'une protéine sous forme soluble
n'est pas possible chez E. coli, une des stratégies
alternatives d'obtention de la forme repliée communément
utilisée consiste
à renaturer la protéine in vitro
à partir de corps d'inclusion purifiés. Cette
technique, qui repose sur la renaturation de la protéine par dialyse de
l'agent dénaturant, présente cependant
un caractère tout autant incertain. Elle
nécessite ainsi de contrôler que le repliement final de la
protéine soit natif et biologiquement actif à l'issu de
la renaturation. Lorsque nous avons entrepris de produire PRODH chez E.
coli, il n'existait aucune donnée structurale connue de
proline déshydrogénase d'une espèce
eucaryote suffisamment proche qui permette de vérifier
l'efficacité d'une éventuelle renaturation in
vitro. Les données de la littérature font état de
2
tests d'activité de PRODH in vitro, dont l'un
repose sur le dosage du produit de dégradation
de la proline par l'O-aminobenzaldehyde (Johnson &
Strecker, 1962). Ces tests d'activité, qui n'étaient pas mis en
place au Laboratoire de Génétique de Rouen, nécessitent
généralement une mise au point qui d'une part, peut être
coûteuse en temps et d'autre part, demande une certaine expérience
en la matière. Par conséquent, ne disposant d'aucun moyen de
vérification
de l'efficacité d'une éventuelle renaturation,
nous n'avons pas envisagé d'obtenir la forme repliée de
PRODH par renaturation in vitro des corps d'inclusion.
A ce stade du projet, il apparaissait donc que seule
l'expression de PRODH sous forme soluble nous permette d'accéder
à l'étape supérieure de l'étude structurale. Deux
choix stratégiques différents étaient alors possibles :
changer d'organisme de production, ou intégrer une structure qui
permette un criblage à haut ou moyen débit de plusieurs
conditions d'expression chez E. coli. Nous avons opté
pour la deuxième stratégie en initiant une collaboration
avec le Laboratoire de Marquage des Protéines (LMP) du
Département d'Ingénierie et d'Etude des Protéines
(DIEP, Direction Docteur André Menez) du CEA de Saclay. Dans le
cadre de cette collaboration, j'ai été accueilli au sein
du LMP afin de bénéficier des infrastructures d'une
plate-forme de production à moyen débit de
protéines recombinantes chez E. coli.
Outre la possibilité de tester un grand nombre
de conditions expérimentales, le programme de production du LMP
permet également de surexprimer en parallèle plusieurs
protéines ou domaines dans un délai raisonnable. C'est
pourquoi, nous avons entrepris de produire la forme mature de PRODH
humaine, ainsi que 3 autres domaines de cette protéine, dans le cadre
de cette plate-forme. En effet, de nouvelles données sont
apparues dans la littérature lorsque nous produisions PRO564. La
publication récente de la première structure
du domaine catalytique de proline déshydrogénase de
E. coli (Lee et al., 2003) nous a permis
de modifier notre stratégie d'étude structurale de
PRODH. Sur la base de cette structure, nous avons mené une analyse
bio-informatique afin de sélectionner 3 domaines potentiels de
PRODH. La description de cette étude fait l'objet du
prochain chapitre.
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