Protocole
Uniquement les rats de la souche Sprague Dawley
sont utilisés, ainsi on essaye de contourner un des grands
problèmes dans l'expérimentation en biologie; comme jamais deux
êtres vivants ne sont identiques il est impossible de
répéter la même expérience dans exactement les
mêmes conditions. En prenant des animaux d'une même souche stable
et établie on travaille autant que
possible dans des conditions semblables. Pour cette même
raison on n'utilise que des rats mâles, car leurs taux hormonaux sont
relativement stables tandis que ceux d'une femelle varient en cours du
cycle.
Les rats sont élevés en milieu stérile et
sont soumis à un régime alimentaire standard stérile, ils
ont libre accès à l'eau et ne sont sortis de l'enceinte
stérile que peu avant l'expérience. Ceci a pour but
d'éviter au maximum le développement d'une fibrose
interstitielle. Pour éviter l'accumulation du collagène dans
l'interstitium qui survient avec l'âge on utilise uniquement de jeunes
rats pesant de 60 à 80 g. Ces précautions ont pour but de
faciliter la microdissection.
Lorsque toutes les préparations ont été
faites, on injecte au rat par voie péritonéale 2 mg de
furosémide (Lasilix) qui est un inhibiteur de
transporteur NaiK+/2Cl- qui se trouve sur la membrane
apicale de la branche large ascendante. Ce transporteur est
électriquement neutre6 et secondairement activé. Il
est activé par le gradient produit par l'action de la
Na+/K+-ATPase. Lorsque le transporteur Na/K/2Cl est
inhibé, la concentration en Na+ dans le cytosol baisse
considérablement jusqu'à inhiber le fonctionnement de la
Na+/K+-ATPase par défaut de substrat. Or comme la
Na+/K+-ATPase est un des principaux consommateurs de
l'énergie dans la cellule, lorsque l'activité de ce transporteur
est réduite la consommation énergétique de la cellule est
également réduite. Ceci nous permet de maintenir les tubules plus
longtemps en vie pendant la dissection.
Dix minutes après l'injection de Lasilix on injecte,
toujours par la voie intrapéritonéale, un anesthésique (
Pentobarbital de sodium à 50 mg/kg ). Lorsque le rat est
complètement insensible à la douleur et inconscient, on ouvre le
péritoine et on y verse du Ringer froid. Les reins sont rapidement
prélevés et constamment gardés dans du Ringer
glacé. Pour préparer la microdissection on enlève la
capsule et on découpe des tranches coronales de moins de 1 mm
d'épaisseur.
La microdissection s'effectue sous une loupe binoculaire ( 25
) dans une boîte de Pétri remplie du Ringer
réfrigéré, maintenu à 4°C. Pour isoler un seul
tubule on écarte le tissu, avec des pinces fines, en commençant
toujours par la medulla. Assez souvent quelques tubules isolés se
dé-
tachent, on les sectionne à l'aide d'une aiguille fine
et on transfère le tubule avec très peu de liquide
dans la chambre de perfusion. Pour éviter que les tissus adhèrent
aux parois de la boîte de
Pétri on ajoute une petite quantité de BSA (
bovine serum albumin ) dans le bain de dissection. On considère
généralement que la viabilité des tubules ne
dépasse pas 30 min., au-delà le risque que le tubule meure
rapidement au cours de la perfusion est trop grand; donc si après 30
min. de dissection aucun tubule n'est isolé, la dissection est
interrompue et un autre rat est sacrifié.
Dans la chambre de perfusion le tubule est d'abord
examiné à fort grossissement pour déceler
d'éventuelles discontinuités dans l'épithélium ou
des opacités anormales. Toute irrégularité peut être
le signe d'une rupture de la membrane basale ou de la mort des cellules
épithéliales qui a pu survenir lors de la dissection. Tout tubule
suspect de traumatisme est écarté.
Lorsque le tubule est dans la chambre de perfusion on approche la
pipette de soutien-perfusion et par une légère aspiration on
engage une de ses extrémités à l'intérieur de la
pipette. Ensuite on introduit la pipette de perfusion à
l'intérieur du tubule. L'autre extrémité du tubule est
aspirée avec précaution dans la pipette soutien-collection. Les
deux pipettes de Sylgard sont avancées pour recouvrir les deux
extrémités du tubule avec le liquide de Sylgard; ainsi le milieu
intratubullaire est complètement isolé du bain, on est sûr
que le liquide collecté est bien celui provenant du tubule. Un montage
relié à la pipette de soutien-perfusion fournit une pression
hydrostatique assurant un écoulement régulier du liquide de
perfusion à travers le tubule. On règle cette pression
hydrostatique de façon que le débit d'écoulement du
liquide dans le tubule soit de l'ordre de 4 à
6 Échange deux anions contre deux cations
5 nL/min.
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Figure 8. Aspect du tubule lorsqu'il est
perfusé
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Collection
Le liquide de bain qui a été aspiré dans
la pipette soutien-collection lors de la mise en position du tubule doit
être enlevé avant qu'on commence la collection.
L'extrémité de la pipette soutien-collection est remplie de
l'huile saturée en eau; ainsi, lorsque le liquide collecté rentre
dans la pipette de soutien, son niveau est facilement repérable
grâce au ménisque séparant l'huile et le collectât.
Lors des prélèvements, on mesure le temps nécessaire pour
le remplissage de la pipette de collection ( dont le volume est connu ), ce
sont des périodes et elles ne sont pas toutes identiques car le
débit peut varier au cours du temps.
Lorsqu'on veut changer la composition du perfusât, la
pipette d'échange nous permet de changer le liquide dans la pipette de
perfusion sans déranger le fonctionnement du tubule. Il faut attendre
quelques minutes pour que le système se stabilise et la collection de
deuxième perfusât peut commencer. Cela nous permet d'effectuer
plusieurs observations ( le comportement du tubule en présence de
différents perfusâts ) sur le même tubule.
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