4.4. Préparation des disques
Les disques sont confectionnés à partir de
papier filtre (Wattman n° 3), à raison de 5mm de diamètre.
Pour éviter tous risques de contamination aux germes exogènes au
cours de l'expérimentation, les disques sont mis dans un tube en verre
stérile et stérilisés à 120°C pendant 15
minutes dans un four pasteur (Ait chabane, 2018).
Chapitre II Matériel et
méthodes
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4.5. L'activité antibactérienne de l'argile
4.5.1. Antibiogramme
Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant
à tester la sensibilité d'une Bactérie vis-à-vis
d'un ou plusieurs antibiotiques.
Le principe consiste à placer la culture de
bactéries en présence des antibiotiques et à Observer les
conséquences sur le développement et la survie de celle -ci.
Il existe trois types d'interprétation selon le
diamètre du cercle qui entoure le disque d'antibiotique : souche ou
bactérie sensible, intermédiaire ou résistante.
La réalisation de l'antibiogramme se fait par
étapes : (Hnich, 2017).
· La préparation de l'inoculum bactérien ;
· Ajustement de la turbidité (densité) de
l'inoculum ;
· Ensemencement et séchage des boites ;
· Disposition des disques ATB ;
· Incubation ;
· Lecture et interprétation des antibiogrammes
4.5.2. Les étapes de préparation des deux
02 témoins et ceux avec une quantité connue de l'argile
Pour réaliser ce test il est nécessaire
d'utiliser le milieu Muller Hinton agar pour la culture de la souche
bactérienne examinée. Le milieu est coulé dans des boites
de pétri (9 cm de diamètre) avec une épaisseur de 4 mm,
puis les boites sont séchées à 37°C pendant 30 min
avant l'utilisation.
A partir d'une culture jeune et pure de 18 à 24 heures
sur milieu d'isolement bouillon nutritif on prépare une suspension
bactérienne dans l'eau physiologique stérile (0.9% NaCl) de
façon à obtenir un inoculum d'une opacité
équivalente à une DO de 0.08 à 0.1, lue à 625 nm,
ce qui correspond à une charge de 1.5×108 ufc /ml
à l'échelle de McFarland (Labiod, 2016).
Des dilutions sont faites en eau physiologiques
stériles (10-1,10-2), 5 ml de la dilution
10-2 est versée sur le milieu solidifié et
l'excès est éliminer après 2 à 3 min par
méthode d'inondation
Après chaque manipulation les boites vont subir une
incubation pendant 24 h d'incubation à 37° C les zones
d'inhibitions sont mesurées en millimètre par règle,
compas ou pied à coulisse (Belkhiri, 2009).
Chapitre II Matériel et
méthodes
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I. Préparation des témoins
I. 1. ensemencent de la bactérie (T1)
Après coulage des boites on ensemence la
bactérie sur toute la surface de la gélose de Muller Hinton et
met la boite à l'étuve pour l'incubation.
I. 2. Antibiogramme par des disques de diffusion
(T2)
Les disques d'antibiotiques sont déposés sur la
gélose avec une pince métallique stérile, une fois
appliqué, le disque ne doit pas être déplacé.
Tableau 4 : Antibiotiques utilisés pour
Escherichia coli (Hennia, 2016).
|
Antibiotique
|
Signe
|
La charge du disque
|
|
Pipéracilline
|
PIP
|
75 jig
|
|
Céfazoline
|
CZ
|
30 jig
|
|
Amikacine
|
AN
|
30 jig
|
|
Doxycycline
|
DO
|
30 jig
|
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Amoxilline + acide clavulanique
|
AMC
|
20/10 jig
|
|
Pénicilline
|
P
|
6 jig
|
II. Application des suspensions d'argile
A l'aide d'une pince stérile 1 ou 3 disques de diffusions
sont placés à la surface des boites inoculées et chacun
est injecté par 10 jil de la suspension argileuse de différentes
dilutions testées (Gulluce et al., 2003).
4.6. La concentration minimale inhibitrice
(CMI)
La CMI est définie comme la plus faible concentration du
produit inhibant totalement en 18 ou 24 heures à une température
de 37°C la multiplication des micro-organismes (Audrey,
2004).
La mesure de la CMI permet de déterminer si une souche est
sensible ou résistante à l'antibiotique testé.
La lecture est réalisée en plaçant les
boites de différentes concentrations sur une surface sombre, pour y
observer la présence (ou l'absence) de colonies, par rapport à la
boite témoin. Mesurer la zone d'inhibition en millimètre à
l'aide d'une règle. Se rapporter aux tableaux
Chapitre II Matériel et
méthodes
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d'interprétation des zones d'inhibition fournis par les
fabricants de disques d'antibiotiques pour établir les
corrélations entre la zone d'inhibition et la concentration minimale
inhibitrice (CMI). La CMI est alors relevée Labiod, (2016) et
Bouarroudj, (2017).
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