ANNEXES
Annexe 1. Détermination du potentiel
mycorhizien
Extraction des spores : Elle a fait appel
à deux techniques : l'une basée sur le tamisage humide et la
décantation des échantillons et l'autre a consisté
à concentrer les spores par une centrifugation dans une solution de
saccharose (Kouassi, 2016).
Tamisage humide et décantation : la
méthode de tamisage humide a été utilisée (Kouassi,
2016). Elle s'effectue directement sur les échantillons de sol
prélevés sur le terrain. Une quantité de 50 g de chaque
échantillon de sol est mise dans 500 ml d'eau de robinet. Le
mélange a été agité pendant 10 min avec une
spatule, puis laissé au repos pendant 1mn. Ensuite, il est passé
à travers une série de tamis de maille 500 um, 100 um et 50 um,
disposés respectivement l'un au-dessus de l'autre dans l'ordre ci-dessus
mentionné. Les suspensions du dernier tamis furent
récupérées avec un peu d'eau distillée à
l'aide d'une pissette et transférées dans des tubes à
centrifuger. Après une première centrifugation à 2000 RPM
(Rotation Par Minute) pendant 5 min, le surnageant et les débris ont
été rejetés et le culot est conservé pour la
récupération des spores.
Récupération des spores : le
culot a été suspendu dans une solution de saccharose à
10%. On procède à une deuxième centrifugation pendant 1
min à 2000 RPM. Les spores sont été contenues dans le
surnageant qui est passé à travers le tamis de 50ìm de
maille et le culot est rejeté. Les spores dans le tamis sont
rincées à l'eau distillée stérile pour
éliminer le saccharose, puis récupérées avec un
liquide physiologique (NaCl à 8 %o), à l'aide de pissette dans
une boîte de Pétri dont le fond est tapissé de papier
filtre (annexe 1).
Annexe 1 : Tamisage humide des sols : a)
Dispositif tamisage, b) Lavage à l'eau de robinet, c)
Récupération des spores
xiii
Annexe 2. Détermination du potentiel
bactérien
Préparation du milieu NB (Nutrient
Broth)
La microflore totale aérobie a été
déterminée sur le milieu NB (8 %o), 8g du milieu NB (Nutrient
Broth) dans 1l d'eau distillée. Le pH est maintenu 7, puis le milieu NB
est stérilisé pendant 15 minutes à 121°C, à
l'autoclave, afin d'éliminer toute trace de contamination.
Isolement des bactéries
Les inocula bactériens ont été obtenus
à partir d'une suspension initiale du compost dans un rapport de 1g de
compost dans 9 ml d'eau physiologique stériles (Nacl 9 %o). Les inocula
sont ensuite agités pendant 1 h en mettant les billes (03 billes)
à l'intérieur des tubes de 15 ml contenant les dilutions D-1. Cet
inoculum constitue la dilution D-1 à partir de laquelle des
dilutions successives 10-2 à 10-6 ont
été réalisées pour ensemencer les microplaques
à l'aide d'une micropipette. Tout ceci se passe sous la hotte et les
tubes de 15 ml sont stérilisés. y' Ensemencement des
microplaques
Chaque microplaque (96 puits) contenant 180 ul du milieu NB a
été ensemencée avec 20 ul de la suspension-dilution
à raison d'une dilution pour une série de 24 puits
(D-1 à D-6), à l'aide d'une micropipette.
Chaque série de dilution a été séparée par
une rangée de puits vides afin d'éviter les contaminations. Les
microplaques ont été ensuite emballées avec du papier
aluminium et incubées à 30°C, à l'étuve
pendant 7 jours. Les résultats des microplaques ont été
donnés par un lecteur microplaque.
Caractérisation et isolation des microorganismes
solubilisatrices de phosphates y' Préparation du milieu
PVK (Pikovskaia)
Milieu PVK liquide contenant 10g de Glucose ;
0,2 g d'Ammonium de Sulfate ; 0,2 g de Chlorure de Potassium ; 0,2 g de
Chlorure de Sodium ; 0,1g de Sulfate de Magnésium ; 0.002 g de Sulfate
de Manganèse ; 0,002 g de Sulfate de Fer heptahydraté ; 5 g
d'extraire de Levure ; 5 g de Tricalcium de Phosphate, en maintenez le pH
à 7 et autoclave à 121°C pendant 15min. y' Isolement
des bactéries
L'isolement des bactéries a fait par
prélèvement de 1g de sol et ajouté dans les tubes à
centrifugeuse contenant 10 ml d'eau physiologique (Nacl %o) stérile et
agité pendant 1h. Cette suspension-dilution constitue la dilution
10-1 à partir de laquelle des dilutions successives ont
été effectuées. Après agitation, 1ml de la dilution
10-1 a été prélevé aseptiquement et mis
dans 9ml d'eau physiologique, stérile donnant ainsi la dilution
10-2 qui a été agitée avant de prélever
1ml que l'on ajoute 9ml d'eau physiologique stérile et ainsi de suite
jusqu'à la dilution 10-6. Ces ensuite à ensemencer le
milieu permettant d'isoler la flore à savoir :
xiv
? Solubilisation des phosphates en milieu
liquide
De même les microplaques contenant 180ul du milieu PVK
liquide ont été ensemencées par 20ul de chaque dilution.
L'incubation est effectuée à 30°C/7jours dès leur
ensemencement.
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