Régénération via l'organogénèse ou l'embryogénèse somatique chez le Scorpiurus.

BOUGUEDOURA N Président du jury professeur à l'université des sciences technologiques Houari Boumediene

ELSHAMAKHANI H examinateur Professeur à l'université Hassiba Ben Bouali de Chlef

Je tiens à remercier Monsieur. SAADI A.E.K , chargé de cours à l'Institut d'Agronomie de Chlef, d'avoir accepté d'être le rapporteur de ce travail et soutenu par son attitude à la fois compréhensive et bienveillante durant toute ma formation . Je le remercie également pour la minutie et la rigueur de ces critiques toujours constructives formulées lors de la rédaction de ce manuscrit.

Mes vifs remerciements s'adressent à Madame BOUGUEDOURA N, professeur à l'université des sciences technologiques Houari Boumediene, qui m'a fait l'honneur d'avoir accepté de présider le jury en dépit de ces nombreuses occupations, en m'apportant ces observations et ces critiques.

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à Monsieur KHILIFI L, maître de conférence à L'INA d'EL HARACH pour avoir accepter d'honorer par sa présence le jury malgré ces nombreuses tâches.

Je remercie vivement Monsieur ELSHAMAKHANI H , professeur à l'université Hassiba Ben Bouali de Chlef qui a bienvoulu accepter de faire partie du jury.

J'aimerais exprimer ma reconnaissance aux responsables de l'université Hassiba Ben Bouali et plus particulièrement à Messieurs : Le recteur de l'université Mr OUAGUED A , le directeur adjoint chargé des études Mr DILMI BOURRAS A.E.K, le directeur de l'institut d'Agronomie Mr KOUDJIL M et le chef de département de Biologie Mr BOUTIBA A.E.K pour leurs aides et leurs encouragements.

Mes remerciements s'adressent aussi à tous le staff enseignant de l'Institut de biologie de l'université Houari Boumediene, en particulier Mr BOUKHROUFA F et son équipe du laboratoire de Biologie marine et Mr AMRANI S et son équipe du laboratoire de Biologie des sols, pour leur bon accueil et leur aide à la réalisation des coupes histologiques.

Je ne serais oublier Mr HOUARI A.E.K pour son aide , sa disponibilité au laboratoire de phytopathologie de l'institut des Sciences agronomiques et biologiques de chlef, ces orientations et ces précieux conseils , qui `il trouve en ces lignes le témoignage de mon grand respect et mes sincères remerciements .

Je remercie toutes les personnes qui m'ont aidée au cours de ce travail, réalisé au laboratoire de physiologie végétale de l'Institut d'Agronomie de Chlef. Leur collaboration, leur assistance technique, leurs conseils et leur encouragement m'ont été très profitables et ont puissamment contribué à mener à bien cette étude.

Résumé du travail

Compte tenu de l'absence d'étude ayant porté sur la régénération in-vitro du Scorpiurus

au cours de la recherche bibliographique que nous avons entrepris et ce qui nous a permis d'orienter notre étude vers la recherche d'une méthode de régénération in-vitro et de tester les aptitudes à la régénération de huit génotypes de Scorpiurus . Le présent travail représente un prélude pour l'amélioration génétique du Scorpiurus . Les voies à explorer sont l'organogenèse (formation de nouveaux bourgeons) ou d'embryogenèse somatique (formation d'embryons somatiques).

Concernant l'organogenèse, les résultats révèlent que les milieux riche en cytokinines par rapport aux auxines(souvent les combinaisons hormonales 2,4-D x BA) permettent l'obtention de bourgeons néoformés à partir d'explants de racines, d'hypocotyle et de cotylédons avec l'ensemble des génotypes testés . Les bourgeons apparaissent au bout de 12 à 15 jours de cultures sur milieu d'induction.

L'enracinement des bourgeons néoformés, sur les milieux généralement pauvres ou complètement dépourvus de cytokinines a permis leur développement et aussi leur enracinement

Le transfert des plantules obtenues lors de la phase d'enracinement, sur pots n'ont pas permis à celle ci de poursuivre normalement leur développement. .

En ce qui concerne l'embryogenèse somatique, les embryons se forment soit directement sur l'explant ( embryogenèse somatique directe) soit indirectement sur un cal(embryogenèse somatique indirecte ) . Les embryons sont obtenus après un mois de culture sur milieu de culture unique et contenant une combinaison hormonale auxine x cytokinine(2,4-D x BA , 2,4-D x Kin, AIA x BA et AIA x Kin ) . Les meilleures productions embryogènes sont obtenues avec les explants hypocotyles et cotylédons des génotypes de l'espèce Scorpiurus vermiculatus et de l'espèce Scorpiurus subvillosus

Les embryons somatiques sont transférer ensuite sur un milieu de germination appauvris ou dépourvue de régulateurs de croissance.

Mots clés : Scorpiurus , Organogenèse , embryogenèse somatique , milieux de culture , explant , génotype .

Liste des tableaux

Tableau 1 : Résultats des analyses de la composition chimique des espèces de Scorpiurus, Médicago et Onobrychis.

Tableau 2 : Plantes régénérées par embryogenèse somatique chez les légumineuses

Tableau 3 : Variation de l'aptitude à la callogénèse en fonction de la composition hormonale du milieu et du génotype chez le Scorpiurus

Tableau 4: Variation de l'aptitude à la callogénèse en fonction de la composition hormonale du milieu et du génotype chez Scorpiurus

Tableau 10: Aptitudes des huit génotypes de Scorpiurus à la caulogenèse

Tableau 11 :Effet de l'interaction génotype * explants sur la caulogenèse .

Tableau 12 : Effet de l'interaction explant * composition hormonale du milieu sur la caulogenèse.

Tableau 13 : Effet de l'interaction génotype * composition hormonale du milieu sur la caulogenèse.

Tableau 14: Effet de l'interaction composition hormonale du milieu * génotype * explant sur la caulogénèse.

Tableau 15 : Tableau d'analyse de la variance à 3 facteurs croisés(caulogenèse) .

Tableau 17 : Influence de la source carbonée, sur l'aptitude caulogène des explants du génotype V12

Tableau 18 : Effet de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique

Tableau 20: Aptitude des huit génotypes de Scorpiurus à l'embryogenèse somatique

Tableau 21 : Effet de l'interaction génotype * explant sur l'embryogenèse somatique.

Tableau 22: Effet de l'interaction explant * composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique.

Tableau 23 : Effet de l'interaction génotype * composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique.

Tableau 24: Effet de l'interaction composition hormonale du milieu * génotype * explant sur l'embryogenèse somatique.

Tableau 25 : Tableau d'analyse de la variance à 3 facteurs croisés(embryogenèse somatique) .

Tableau 26 : Influence de la source carbonée, sur l'embryogenèse somatique des explants du génotypeV12.

Tableau 27 : Influence de la source carbonée, sur l'aptitude embryogène des explants du génotype V12.

Tableau 28 : Aptitude morphogénétique des embryons somatiques en fonction du milieu de germination

Figure 3 : L'aire de répartition géographique des espèces de Scorpiurus en Algérie

Figure 4: Variation du pourcentage d'explant régénérant en fonction du génotype à la lumière et à l'obscurité.

Figure 5 : Cinétique de croissance des cals issus d'explants de cotylédons des différents génotypes sur le milieu d'induction B3D0,1(3mg/l de BA et 0,1 de 2,4-D).

Liste des Abréviations

MS	: MURASHIGE et SKOOG, (1962)
ABA	: Acide abscissique
AIA ou A	: Acide - indolylacétique
ANA ou N	: Acide naphtalène acétique
2,4-D ou D	: Acide 2,4- dichlorophénoxyacétique
BA ou B	: 6 - benzyladénine
Kin ou K	: Kinétine ou 6 - furfuryladénine
GA3 ou G	: Gibberélline
M.A.D	: Matière azotée digestible
M.A.T	:Matières Azotées Totales
M.M	: Matières Minérales ;
C.U.D	:Coefficient de Digestibilité de la matière organique
C.B	: Cellulose Brute
U.F	: Unité Fourragère.
V6,V12,V13	: Scorpiurus vermiculatus ( génotypes)
B1, B6, B8	: Scorpiurus muricatus.ssp subvillosus ( génotypes)
L26 , L3	: Scorpiurus muricatus.ssp sulcatus ( génotypes)
Emb	: Embryogenèse somatique
Org	: Organogenèse
mg/l	: milligramme par litre
H	: Hypocotyle
C	: Cotylédon
R	: Racine

Liste des planches

Planche 1:( A) - Jeune plantule de Scorpiurus de 20 jours .(B) -Plante adulte de Scorpiurus au stade floraison .(C) - Fruit en gousse de Scorpiurus muricatus. (D) - Graine de Scorpiurus muricatus.. (E )- Fruit en gousse de Scorpiurus vermiculatus .(F) - Graine de Scorpiurus vermiculatus

Planche 2: -Coupes histologiques longitudinales réalisées au niveau de bourgeons néoformés, obtenus par voie directe et indirecte.

Planche 3:-Coupes histologiques longitudinales réalisées au niveau d'embryons somatiques.

Planche 8: Bourgeons néoformés obtenus, sur milieux B3D0,1 (contenant 30 g/l du maltose ( A) et du glucose ( B)), avec des explants d'hypocotyles.

Planche 10:. Principales malformations morphologiques que présentent les embryons somatiques .

Planche 11: Opération d'enracinement des bourgeons et transfert des plantules en pots .

Planche 12: Germination d'embryons somatique, après 2 semaines de culture sur milieu B0,1G0,1( 0,1 mg/l de BA et 0,1mg/l de GA3)

3 APTITUDE A L'ORGANOGENESE

3.1Aptitude à la rhizogenèse

3.1.3 Influence du génotype

3.2 Aptitude à la caulogenèse

3.2.2.4 Etude des interactions de l'explant , du génotype et la composition hormonale du milieu

3.2.2.4.3 Aptitude caulogène des différents génotypes en fonction de la composition hormonal

3.2.2.4.4 Etude de l'Interaction ( Explant, Génotype et de la composition hormonale du milieu).

4.2.4 Etude des interaction de l'explant , du génotype et de la composition hormonale du milieu

4.2.4.3 Aptitude embryogène des différents génotypes en fonction de la composition hormonale

4.2.4.4 Interaction de la composition hormonale du milieu ,du génotype et de l'explant

CHAPITRE I GENERALITE SUR LES CULTURES IN-VITRO

1 - APERCU HISTORIQUE SUR LES TECHNIQUES DE CULTURES

IN-VITRO.

La multiplication in-vitro trouve son fondement dans le concept de " totipotence cellulaire " énoncé au début du siècle : la cellule, unité morphologique et physiologique de l'être vivant ,est capable d'autonomie . Elle possède toute l'information génétique nécessaire à régénérer la plante entière, à condition bien sûr de créer les conditions favorables à ce développement . Ce concept énoncé des 1902 par HABERLANDT , ne sera finalement démontré par STEWARD et son équipe qu'en 1958 , lorsque ces chercheurs obtiendront les premiers " embryons artificiels" appelés " embryons somatiques" à partir de cellules de carotte qui évolueront par la suite en jeunes plantules(ZRYD, 1988; MARGARA, 1989; AUGE et al.,1989; BOXUS,1995 TOUTE,1998).

En effet le botaniste HABERLANDT fut le premier, en 1902, à définir exactement le problème de la culture des tissus et l'a tenter avec des fragments de plantes très diverses Il obtenait une survie des cellules de quelque mois mais jamais de multiplication (SCHMID et KELLER,1981) .

En 1934 GAUTHERET eut l'idée d'utiliser le tissu cambial des arbres. Il avait aussi trouvé le matériel idéal mais pas encore le milieu nutritif optimal. Ce n'est qu'en 1932 que WHITE aux Etats - Unis obtint des cultures indéfinies de cellules de tabac. Au même moment GAUTHERET et NOBECOURT publiaient leur résultats sur la culture indéfinie de tissus de carotte (TOUTE,1998) .

Le succès fut assuré lorsque, on commença à ajouter au milieu de culture de l'auxine. En 1946, partant d'apex, BAL aux USA obtient quelques plantes de lupin. Tandis que WETMORE et MOREL régénèrent des fougères en 1949. A la même époque l'équipe de LIMASSET et CORNUET en France démontrent l'absence de particules virales dans les apex de tabac (ZRYD,1988).

Ces dernières observations ont été mises à profil, vers les années 1952, par MOREL et MARTIN qui ont réussi à obtenir, par culture in-vitro de méristèmes, des plantes saines (indemnes de viroses ) à partir de dahlia (CHEVRE,1985).

L'année 1955 été marqué par la découverte de la Kinétine par SKOOG (substance dotée d'un grand pouvoir caulogène) a permis de provoquer, presque à volonté, la néoformation de bourgeons adventifs qui, traités par de l'acide gibbérellique et des auxines, s'enracinaient pour donner des plantes entières(TOUTE,1998).

En 1958, STEWARD et son équipe régénèrent les premiers embryons dits somatiques à partir de cellules de carotte et confirment que certaines plantes développées à partir de culture de cellules sont issues d'embryogenèse asexuée. Dès lors, les expériences s'accumulèrent avec des plantes aussi diverses que le tabac, la carotte, le trèfle, le pois, le soja,....etc (SCHMID et KELLER ,1981; MARGARA,1989; TOUTE,1998).

2- La MICROPROPAGATION

La multiplication végétative par culture in-vitro ou micropropagation présente plusieurs avantages sur les méthodes classiques dites " conventionnelles "de propagation . Cette technique a rendu possible la multiplication d'espèces chez lesquelles les semences sont rares, ou présentant des difficultés de germination et/ou dont les techniques de bouturage ou de greffage sont inapplicables , ce qui a conduit à une plus grande diversité des plantes commercialisées.

De même plusieurs autres techniques, toutes dérivées de la culture in-vitro ,ont un rôle important à jouer dans l'amélioration des performances agronomiques ou horticoles des plantes cultivées. La micropropagation est utilisé dans un but de multiplication en masse , puisqu'elle permet , en partant d'un seul individu (plant), l'obtention d'un nombre considérable de plantes génétiquement identiques à la plante mère ( FERRY et al.,1998; SEMAL,1998). Les plants reproduits ne sont pas seulement conformes mais présentent aussi une grande uniformité.

Par ailleurs, l'usage de cette technique nécessite peu d'espace et peu être programmé indépendamment des saisons. La technique représente donc sans contexte un outil puissant aux perspectives industrielles et économiques importantes (MARGARA,1982; BOXUS,1995; SEMAL,1998; SKIRVIN et al., 2000) .

· L'une qui utilise des tissus méristématiques (méristème ou apex de tige, bourgeons axillaires ) potentiellement capable de donner suite, au développement normal, d'un individu est appelée microbouturage (SAADI,1991) cette technique est souvent appelée "multiplication conforme" car elle part de méristème préexistant dans les quels , les cellules sont génétiquement très stables (AMATO,1977 in BOXUS,1995),l'individu est généralement obtenu en deux étapes successives, d'abord la production de tige ,puis son enracinement .

· L'autre voie, utilise toute sorte tissus différenciés (fragments de tige, de racines, de pétiole , de feuilles, d'embryons matures et immatures ,d'hypocotyles, cotylédons...etc) pour aboutir à la néoformation soit de bourgeons ou de racines , c'est l'organogenèse ,soit de structures ressemblant aux embryons zygotiques, c'est l'embryogenèse somatique (ZRYD,1988 ; MARGARA,1989).

les premiers résultats de cultures de méristèmes appelées communément "cultures d'apex" furent obtenus par KOTTE et ROBBINS, dés 1922 à partir de méristème radiculaires de fève et de maïs( TOUTE,1998).

Dix ans plus tard, WHITE(1934) obtiendra une culture indéfinie de racines de tomate . En même temps, il s'apercevait que si le virus de la mosaïque du tabac pouvait se multiplier dans des racines de tomate isolées , le virus n'atteignait pas les cellules méristématiques . Plus tard , LIMASSET et CORNUET(1949) montrent que les organes jeunes de tabac ne renferment que très peu de virus (TMV) et que les méristèmes apicaux n'en contiennent pas .

En 1952, partant de ces observations, MOREL et MARTIN tentent de prélever des pointes méristèmatiques de dahlias viroses pour reproduire des dahlia génétiquement semblables aux parents, mais exempts de virus . Ils réussiront de la sorte à éliminer la mosaïque du dahlia et le " spotted wilt virus". En 1955 , ils régénéreront de façons analogue des pommes de terre atteintes de virus A et Y (BOXUS, 1995).

Depuis lors , la culture de méristèmes à conduit à des applications nouvelles , originales concernant le domaine du phytosanitaire, notamment pour l'éradication de nombreuses maladies (viroses, mycose, mycoplasmoses, bactérioses) et a permis la régénération d'un grand nombre d'espèce saines (TOUTE, 1998).

Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue ,confèrent à la plante une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs. Ils représentent des petits massifs de cellules indifférenciées (0.1mm) et conservent la capacité de se diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un rôle capital dans le développement végétal puisqu'elle édifient tous les organes (CAMEFORT, 1977; MARGARA, 1989).

En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le bourgeon axillaire, le plus souvent indemne de maladies. On pourra très rapidement obtenir de nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et débarrassées de maladies dont elles étaient affectées (SCHMID et KELLER, 1984; SAMA et al., 1998;). Il est même possible de reconstituer des clones indemnes de maladies à partir de pieds -mères malades. D'après TOUTE, 1998; FLETCHER et al. ,1998 , il existe plus de 50 espèces végétales qui ont été ainsi assainies c'est le cas de la pomme de terre , la canne à sucre , de dahlia ..etc .

La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre pour éviter l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou variants (SAADI, 1991) . Elle paraît plus intéressante chez les plantes allogames ou il est généralement impossible de conserver des génotypes intacts par reproduction sexuée classique.

l'organogenèse est la base fondamentale de la multiplication végétative , laquelle s'appuie toujours sur la formation de méristèmes nouveaux (MARGARA,1989). En partant d'un explant , elle aboutit à la formation d'un nouvel individu par l'élaboration de bourgeons (caulogenèse ) et de racine (rhizogenèse).

La caulogenèse désigne à la fois l'initiation et le développement des bourgeons terminaux, axillaires, adventifs ou néoformés sur un cal.

· Les bourgeons axillaires sont produits généralement par les deux ou trois assises cellulaires superficielles de la tige.

· Les bourgeons adventifs sont formés en des endroits inhabituels. Ils sont formés à partir d'organes différenciés de la plante (entre noueds, tubercules, racines). Ils peuvent avoir pour origine des massifs cellulaires restés méristèmatiques ou bien provenir d'une différenciation de certaines cellules(CAMEFORT, 1977).

· Les bourgeons néoformés in-vitro peuvent apparaître sur l'explant initial ou sur un cal, ils peuvent être considérés comme un cas particulier de bourgeons adventifs BOXUS, 1995). Ils sont induits sur n'importe quel type d'organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions naturelles (CAMEFORT, 1977; ZRYD, 1988; MARGARA, 1989).

Les études cytologiques, conduites dans le but de déterminer l'origine des bourgeons néoformés à partir d'un fragment d'organe contenant divers tissus montrent souvent que l'aptitude à la caulogenèse se manifeste à partir de certaines catégories de tissus telle que: le cambium ,le parenchyme vasculaire ou libérien (BELANGER, 1998; FORTES et PAIS, 2000).

L'intensité de cette néoformation est nettement dépendante de la nature des tissus contenus dans l'explant. Elle est maximale pour les tissus cambiaux, élevée pour les tissus du phloème et du xylème, très faible ou nulle pour le parenchyme cortical ou médulaire (MARGARA, 1989) .

Chez les conifères, comme le pin , les premières divisions périclines apparaissent dans les couches subépidermiques du mésophylle, l'origine des pousses caulinaires parait être unicellulaire. Par contre chez les Angiospermes, l'origine peut être pluricellulaire, des méristèmes peuvent se former à partir de cellules épidermique ou encore à partir de tissus palissadiques, du mésophylle spongieux ou de la gaine perivasculaire des explants cultivés (BOXUS, 1995).

La rhizogenèse désigne la néoformation et la croissance de racine. Les méristèmes de racines se répartissent en plusieurs catégories selon leurs origines.

· Les racines latérales se forment de manière spontanée sur la racine principale dans les conditions naturelles.

· Les racines adventives sont produites par des organes divers, soit spontanément, soit accidentellement à la suite d'une blessure ou d'une manière provoquée, dans les conditions du bouturage et du marcottage.

· Les racines néoformées, au sein d'un cal, en culture in-vitro, peuvent être considérées comme un cas particulier de méristèmes adventifs (rhizogenèse indirecte) ou l'émission de racines sur un explant dans des endroits inhabituelles (rhizogenèse directe).

La rhizogenèse est un phénomène complexe, il comporte différentes phases : la dédifférenciation, formation d'amas de cellules méristèmatiques , différenciation et organisation des amas méristèmatiques en primordium racinaire qui se développeront en jeunes racines ( MARGARA , 1989; BOXUS, 1995).

L'origine des cellules impliquées dans la cicatrisation dépend de l'espèce. FAVRE (1985) inBOXUS,(1995)sur son modèle vigne relève que ce sont les cellules du phloème primaire qui réagissent les premières. Les cellules non lignifiées d'origine secondaire et le parenchyme cortical, ou même la moelle peuvent également réagir en formant un tissu cicatriciel plus ou moins important. Mais dans tous les cas, c'est l'assise génératrice libéro- ligneuse ( combium) qui donne, des tissus de bonne aptitude callogène. Le cal est formé essentiellement de cellules de type méristèmatique secondaire, qui incorporent certaines cellules voisines parenchymateuses . Les cellules méristèmatiques se différencient par la suite et s'organisent pour donner naissance à une nouvelle racine.

Classiquement, l'embryon est défini comme étant une plante se trouvant au stade initial de son développement. Il s'agit en fait d'une structure bipolaire ( munie de deux méristèmes : l'un caulinaire et l'autre racinaire) qui, suite au processus de germination, donne naissance à une nouvelle plante.

Habituellement, l'embryon s'édifie à partir d'une cellule initiale, le zygote, formé lors de la reproduction sexuée (embryon zygotique) .

Cependant, d'autres types d' embryons peuvent également se développer à partir de cellules du sporophyte ou du gamétophyte, embryons qui ne sont pas le produit d'une fusion gamétique et qui sont appelés "embryons somatiques" . Parfois, chez certains espèces, ils résultent d'une embryogenèse somatique naturelle qualifiée d'apomixie . Dans certains cas en effet, les anthérozoîdes , l'oosphère , voire d'autres cellules gamétophytiques peuvent engendrer des embryons parthénogénétiques. Dans d'autres cas, certaines cellules sporophytiques localisées au niveau des tissus intra-ovulaire, en particulier le nucelle, fournissent naturellement des embryons apoméiotiques appelés aussi "embryons nucellaires. Ce type d'embryogenèse est très développé dans la famille des Rutacées, spécialement chez les Citrus (TISSERAT et al., 1979;VARDI et al., 1990) Toutefois, cette appellation est essentiellement appliquée , selon certains auteurs comme PIATTI, (1988) et MARGARA, (1989), aux embryons obtenus à partir de culture de tissus in-vitro du sporophyte .

Les donnés cytologiques montrent que les embryons somatiques ont pour origine des cellules particulières; dites embryogènes. Elles présentent des caractères de cellules méristèmatiques primaires: petites tailles, cytoplasme dense, gros noyaux aux nucléoles proéminents et petites vacuoles.

Elles fixent de manière intense les colorants ce qui les rend aisément repérables en cytologie(JULLIEN, 1991 ;LOISEAU et al .,1998; VASLENKO et al, 2000).

Selon SHARP et al (1980)in PIATTI (1988)décrivent deux voies pour l'embryogenèse somatique:

La première dite est l'embryogenèse directe où les embryons sont initiés à partir de tissus en absence de prolifération de cal. Ceci se produit à partir des cellules pré-embryogéniques déterminées (P.E.D.C) ou les cellules sont déjà engagées dans un développement embryogène et ils ont besoins seulement d'être libérées (PIATTI,1988; ROUGET,1989). Elle semblent préexister dans les tissus de certains explants comme les embryons immatures ou les fragments de très jeunes plantes (SAADI, 1991) .

La seconde dite est l'embryogenèse somatique indirecte, pour la quelle une prolifération cellulaire est requise. Les travaux de SHARP (1980) et d'EVANS (1981) in PIATTI(1988) ont également pu servire à mettre en évidence, l'existence de cellules initiatrices qui sont déjà différenciées mais dépourvues de capacité embryogènes. Ils les nomment des cellules pré-embryogènes indéterminées(PEIC).Les cellules embryogènes apparaissent tardivement au sein du cal produit par la réactivation mitotique des cellules différenciées et/ ou la prolifération des cambiums obtenus à partir d'explants de type racines, tige ou de feuille(JULLIEN,1991 ; RUGKHLA et JONES , 1998)). Leurs multiplications aboutit à la formation de groupes de cellules embryogènes "nodules méristèmatiques" dispersés, parmi les autres cellules du cal et qui sont généralement de type parenchymateux. A la suite de leur repiquage sur des milieux dépourvus d'auxines, ces nodules évoluent en des embryons somatiques comme c'est le cas chez la carotte (SAADI,1991).

Les embryons somatiques connaissent les même stades de développement morphlogiques que traversent habituellement les embryons zygotiques à savoir : stade globulaire, cordiforme, torpille et cotylédonaire(EGERTSDOTTER et ARNOLD , 1998). Ils ont une structure chromosomique souvent semblable à celle de la plante- mère dont ils sont issus (NUTI RANCHI, 1995) . Le critère qui permet de reconnaître un embryon somatique est certainement sa structure bipolaire, qui développe précocement et simultanément un méristème caulinaire et un méristème racinaire (NORREL, 1973 ; NUTI RANCHI , 1990).

Historiquement , les premiers embryons somatiques ont été signalés, en 1958, par l'équipe de REINERT & STUART sur des cultures du parenchyme libérien de racine de carotte (BELANGER, 1998).Depuis et grâce au progrès spectaculaire que connaît les techniques de cultures in-vitro, la production d'embryons somatiques est devenue possible chez un grand nombre d'espèces végétales.

Comparativement aux autres voies de multiplication végétative in-vitro , l'embryogenèse somatique se montre plus séduisante en terme de performance et d'efficacité (HARKMAN et ARNOLD , 1985 ; PIATTI, 1988). En effet, la maîtrise de la production d'embryons, chez certaines espèces, via les suspensions cellulaires permet d'obtenir des milliers d'embryons par litre de milieu de culture et par conséquent la régénération de milliers de plants. L'embryogenèse somatique permet aussi en un temps très court de produire des plantes entières sans passer par les contraintes que connaît habituellement l'organogenèse ( phase de caulogenèse et de rhizogenèse) (DAIKH et DEMARLY, 1987 ; ROGUET, 1989).

La voie de l'embryogenèse somatique est actuellement intégrée dans de nombreux schémas de sélection puisqu'elle permet de diminuer sensiblement la longueur des cycles d'amélioration comme par exemple , le temps nécessaire à la valorisation du matériel sélectionné âgé ou juvénile ou la production de parents hybrides nécessaires à la diffusion de nouvelles variétés (DEMARLY et SIBI, 1989 ; DEMARLY, 1994; STANANTINO et al., 1998; LOISEAU et al., 1998; TREMBLAY et al., 1999). De telles applications ont été réalisées chez plusieurs espèces comme le café (CARNEIRO, 1999) ; la carotte (TOUTE,1998); la luzerne (REDENBOUGH et al., 1986 FUJII et al., 1987 ; STUART et al., 1987 ; RAY et BINGHAM, 1989) ;Asparagus officinalis (MAMIYA et SAKAMOTO , 2001); le palmier dattier (FERRY et al, 1998) et le palmier à huile (RIVAL et al., 1998).

Les facteurs influant sur la régénérabilité in-vitro peuvent être schématiquement répartis en 2 groupes ( figure 2) . Le premier représente Les facteurs internes , ( ceux liés à la plante) et concerne d'une part le génotype , la nature et l'âge ontogénique de l'explant et d'autre part l'état physiologique de la plante mère sur laquelle, l'explant a été prélevé . Le second réunit les différents facteurs externes qui englobent et les milieux (notamment leur composition en régulateurs de croissance et les sucres ) et les conditions de cultures.

Un des atouts majeurs de la culture in-vitro est de montrer que des cellules somatiques (à 2n chromosomes) , pouvaient produire , soit des structures comparables à des embryons somatiques, soit à des bourgeons et dont le développement permet de régénérer des plantes conformes à la plante mère . Pratiquement, n'importent quel organe(bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou fragment d'organe (explant), prélevé sur celle-ci , peut être cultivé isolément sur milieu nutritif synthétique, mais le choix de celui-ci est d'une importance primordiale . On retiendra cependant que la réponse in-vitro est sous la dépendance de nombreux facteurs .

Généralement dans les cultures in-vitro ,on privilégiera les explants les plus jeunes (embryons immatures , jeunes feuilles , méristèmes etc.) car c'est l'état juvénile qui semble offrir le plus de possibilités de régénération ( DAVIS, 1986.,SAADI, 1991). Souvent , ce sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière nette et reproductible, l'aptitude à la régénération, .C'est le cas par exemple du pois (SAADI, 1991); du lupin (DESIRE, 1988) , du coton (BRAR et al. , 1998) ; du soja (SANTAREM et al ., 1997); du tournesol(CHARNIERE et al., 1999) ; Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) et bien d'autres espèces.

Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un stade de vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à développer des réactions différentes en culture in-vitro. Cette différence peut être expliquée par la modification des équilibres internes des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines, gibbérelline ...) lors des différentes saisons (AUGE et al., 1989) .

Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants et les conditions extérieures seront influentes . La taille choisie variera selon la nature de l'explant . si le tissu végétal est de nature organisée , un ensemble assez complet sera nécessaire ( soit un noeud , un apex , ou un bourgeon entier ) mais dans le cas d'une structure différenciée ( éléments de feuilles , de tige, de racines ,inflorescence..) des fragments de 5à 10 mm suffiront ( ZRYD, 1988., AUGE et al ., 1989; HANNWEG et al ., 1996).

D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles » qui répondent à un stimulus indicateur qui orientera son programme morphogénétique vers une voie particulière de développement contrairement à certains tissus récalcitrants aux manipulations in-vitro, dues essentiellement à un manque de compétence cellulaire(COLEMAN et ERNST, 1990 ; NUTI RONCHI, 1995 ; YADAV et RAJAM , 1998).

La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée à l'espèce. A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis qu'un autre ne peut fournir que des embryons(AUGE et al ., 1989) . Cependant, plusieurs auteurs mentionnent que seulement certains génotypes paraissent posséder la capacité d'induire une embryogenèse somatique . Cette capacité, chez beaucoup d'espèce semble être génotypiquement contrôlé ( GEORGE et SHERRINGTON , 1984 ., BROWN, 1988 ; DODEMAN et al ., 1997 ) .

Un tel contrôle de la régénération ( par la voie de l'embryogenèse somatique ou de la caulogenèse ) a été rapporté chez les Légumineuses fourragères est spécialement chez la luzerne par BROWN et ATANASSOV (1985); Trifolium repens par PARROT (1991) et bien d'autres espèces . BENCHEIKH et GALLAIS (1996 ) indiquent la présence de quelques gènes majors pouvant contrôler l'embryogenèse somatique chez le pois. De même BINGHAM et al (1975) ont réussit à augmenter considérablement la fréquence embryogène chez Médicago sativa après deux étapes de sélection récurrente. REISCH et BINGHAM , (1980) trouvent chez un génotype de luzerne diploïde que la différenciation de bourgeons à partir de cal est contrôlée par deux gènes dominants désignés Rn1 et Rn2 dont la présence simultanée permet un taux élevé de régénération ( plus de 75 % des explants) . L'hétérogénéité existante chez les Légumineuses fourragères, permet d'expliquer la facilité à identifier les génotypes favorables à la régénération .

Avec le développement des cultures de tissus , divers milieux de base comprenant des sels inorganiques , des composés organiques ( sucres , vitamines et régulateurs de croissances ) ont été progressivement utilisés .Certains milieux proposés dans un but donné sont en fait utilisables d'une manière beaucoup plus étendue.

Les milieux de culture sélectionnés doivent être le plus parfaitement adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude afin de laisser s'exprimer pleinement son potentiel génétique.

Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement représentés par les macro et les micro-éléments, une source carbonée et azotée, des vitamines et des régulateurs de croissance.

Selon EVANS et al , (1981) ,dans 70% des cas , des milieux de culture de base de type MURASHIGE et SKOOG (MS) ont été utilisés. Il a été employer d'une manière générale pour tous les types de cultures in-vitro . Mais c'est essentiellement pour le déclenchement de l'organogenèse , en particulier pour la néoformation de bourgeons que s'est révélé nettement supérieur à d'autres milieux (MARGARA, 1989) c'est le cas du Cunila galioides ( FRACARO et ECHEVERRIGARAY , 2001).

Le milieu de MURASHIGE et SKOOG est caractérisé principalement par une très forte teneur en sels minéraux , en particulier en potassium et par une concentration également élevée en azote (60méq/l environ sous forme de nitrate et d'ammonium ) dont 1/3 apporté sous forme réduite (ionsNH4+); le rapport nitrate / ammonium, dans ce milieu est très favorable à l'induction de l'embryogenèse somatique , en particulier chez Feijoa sellowiana (DEL VESCO et GUERRA , 2001).

Il apparaît à travers la recherche bibliographique que nous avons effectuées , qu'il existe deux composantes majeurs du milieu qui peuvent intervenir dans l'orientation du phénomène de morphogenèse et qui sont représentées par les régulateurs de croissances et la source carbonée.

Un régulateur de croissance est défini comme étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous certaines conditions les processus de cytodifférenciations (STREET, 1977).

Aucun régulateur de croissance ne provoque une initiation directe du phénomène d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique , mais il interfère dans de nombreux métabolismes internes de la cellule végétale.

l'organogenèse est fortement influencée par les régulateurs de croissance. Les deux hormones, les plus souvent utilisés, d'une manière conjointe ou séquentielle, sont les auxines et les cytokinines. NITSH et NOUGAREDE ,(1967) ont montré que des explants de parenchyme médullaire de tabac cultivés in-vitro dans un milieu ne contenant ni auxine ,ni cytokinine ne prolifèrent pas. Il en était de même lorsque seulement une auxine ou une cytokinine était incorporée au milieu. Par contre , la prolifération cellulaire se déclenchait lorsque ces deux substances sont présentes dans le même milieu de culture.

Le rapport hormonal (auxine/ cytokinine) conditionne, en grande partie, le type de néoformation obtenu. Ce rapport a conduit, dans le cas de la culture in-vitro du parenchyme médullaire de tabac, par exemple , à l'orientation des tissus, soit vers la caulogenèse , soit vers la rhizogenèse (SKOOG et MILLER, 1957 in ZRYD ,1988). Ainsi la néoformation de bourgeons est souvent favorisée par des teneurs élevées en cytokinine (FRETT, 1977; WALKER et al., 1979; MARGARA , 1989; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et al., 2001; TANG et GUO, 2001 ) alors que les fortes doses en auxines stimulent la formation de racines et améliorent leurs qualités (DRUART, 1992, HOBBIE, 1998; ABRIE et STADN , 2001; COMPTON et al., 2001).

L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant , pas une règle générale pour toutes les espèces végétales . En effet, il suffit, dans certains cas, d'ajouter au milieu de culture l'un ou l'autre des deux régulateurs précités pour parvenir à une réponse morphogénétique (SEON et al. , 1998). Dans ce cas précis, nous pouvons citer deux exemples : le premier, concerne le Tritical où l'organogenèse a été obtenue en se servant uniquement d'auxine ( milieu dépourvu de cytokinine) (VIKRANT et RASHID , 2001) ; le second, touche l'espèce Piper barberi gamble où l'équipe d'ANAND et RAO,(2000) a obtenu des bourgeons néoformés en utilisant des cytokinines seules dans le milieu d'induction

Par ailleurs ,il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses obtenues dans ce domaine , qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité des différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les effets paraissent varier essentiellement avec le matériel végétal employé.

Tout comme l'organogenèse, Les régulateurs de croissance de type auxine et cytokinine sont aussi indispensables à l'embryogenèse somatique.

La production d'embryons somatique est généralement obtenue en deux phases de culture, sur des milieux qui différent essentiellement par leurs concentrations en régulateurs de croissance (AUGE et al., 1989). Par exemple, chez la carotte ou la luzerne, les embryons sont obtenus en deux phases: Une phase dite d'induction réalisé sur un milieu souvent riche en régulateurs de croissance en particulier en auxines permet la formation et / ou la prolifération des cellules embryogènes. Ces cellules n'évolueront en embryons qu'au cours d'une deuxième phase dite de développement qui se réalise au moyen d'un transfert de tissus induits, sur un nouveau milieu moins riche , voir dépourvu de régulateurs de croissance essentiellement en auxines (SAADI, 1991 ; GIORGETTI et al.,1995) .

Cette façon de faire ou plutôt ce schéma de transfert a été appliqué avec succès dans de nombreux travaux de recherche portant sur l'obtention de l'embryogenèse somatique . Nous citons, à titre d'exemple, les travaux réalisés à partir d'embryons immatures de graminées (JULLIEN, 1991) , de pois (SAADI, 1991), de coconut (NAIR et al ., 1999) , de Pinus sylvestris ( HAGGMAN et al ., 1999) , d'Arabidopsis thaliana ( GAJ, 2001 ) ; de boutons floraux du bananier (ESCALANT et al., 1994) ; d'hypocotyles du tournesol (LAPARRA et al., 1997) ; des feuilles du Santalum album et Santalum spicatum (RUGKHLA et JONES , 1998); etc...

Le transfert des tissus d'un milieu riche en auxine vers un milieu pauvre n'est pas toujours indispensable pour le déroulement des différentes phases annoncées précédemment. L'exemple des travaux de MAHESWAREN et WILIAMS, (1984), portant sur l'embryogenèse du trèfle et la luzerne, est très significatif puisqu'ils ont réussi à obtenir, des embryons somatiques, directement sur les explants d'embryons immatures cultivés sur un milieu riche en cytokinine et totalement dépourvu d'auxine. C'est l'exemple aussi des travaux de KRISTEN et al., 2000 réalisés sur les explants de pétioles de Echinecea purpurea L

Par contre d'autres cultures exigent en phase inductive, la présence conjointe d'une auxine et d'une cytokinine, c'est le cas de la luzerne (JULLIEN, 1991); du papayer (MONMARSON et al., 1994); du cocotier (SERGE, 1998) ; du caféier (CARNEIRO, 1999) et bien d'autres espèces.

Il est utile de rappeler , que les auxines les plus souvent utilisées en organogenèse ou en embryogenèse somatique sont le 2,4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon pouvoir inducteur, le 2,4 -D semble détenir, d'après EVANS et al., 1981, le record d'utilisation dans les études portant sur l'embryogenèse somatique (puisque 57 % des travaux de recherche l'utilisent comme régulateur). Quand aux cytokinines , elles sont représentées par la Kinétine, , la benzyladenine (BA), la 2- isopentenyladénine et la zéatine.

Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de croissance peuvent intervenir dans le processus d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique tels que les gibbérellines et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur utilisation reste limiter . Les gibbérellines, selon JAYASREE et al, 2001, stimulent fortement la production de bougeons néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles sont combinées aux cytokinines. Par contre, d'après MARGARA, 1989, les gibberellines ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la rhizogenèse chez le Chou-fleur.

L'acide abscissique (ABA) quant à lui, est employé par certains auteurs dans le but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique des embryons (UNNIKRISHAN et al., 1990 ; DODEMAN et al., 1997). Son usage peut inhiber, en même temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et empêche la germination précoce des embryons somatiques MILENA et al., 1998; SVOBODOVA et al ., 1999).

Les tissus en cultures in-vitro sont largement hétérotrophes via à vis du carbone en raison de l'absence ou de l'insuffisance de l'assimilation chlorophyllienne. Il est donc indispensable d'ajouter une source carbonée (des glucides) au milieu de culture. Les glucides remplissent deux fonctions principales dans les milieux de culture ; ils fournissent de l'énergie nécessaire pour la croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du milieu de culture (ZRYD, 1988). Cette pression osmotique, appelée aussi « effet osmoticum , peut avoir diverses actions sur les tissus. Elle agit , dans certains cas , sur l'orientation ou l'expression morphogénétique des tissus (BELAIZI et BOXUS, 1995; CHARNIERE et al., 1999), dans d'autres , sur la maturation des embryons somatiques produits (WALKER et PARROTT, 2001) .

Les glucides, les plus généralement utilisés sont le saccharose et le glucose (MARGARA,1989; DRUART et SAMYN,1995). Selon certains auteurs, le maltose peut constituer une bonne source carbonée puisqu'il permet , dans certains travaux portant sue l'embryogenèse, d'améliorer à la fois, et la qualité et la quantité des embryons somatiques produits ( SAADI , 1991).

L'organogenèse ou l'embryogenèse somatique ne semblent pas être influencées uniquement par la nature des sucres mais aussi, et pour un même sucre, par sa concentration dans le milieu de culture. Généralement, selon PIATTI, 1988, les doses employées oscillent entre 2 et 12 %.

L'effet dose peut avoir, comme nous l'avons signalé ultérieurement, une grande influence sur le devenir morphogénétique des cultures. Dans ce cas , l'exemple du tournesol est très significatif, l'usage d'une concentration de 12% en saccharose peut orienter le processus vers la voie de l'embryogenèse somatique, alors qu'une concentration de 3 % conduirait vers la néoformation de bourgeons (CHARNIERE,1999).

3 LES LEGUMINEUSES ET LA MICROPROPAGATION

3-1 Intérêt de la famille des Légumineuses

La famille des Légumineuses renferme environs 600 genres et 12000espèces, disperser dans le monde (DESIRE, 1988). Généralement, elle est divisée en deux classes : Légumineuses fourragères et les Légumineuses à graines .

Ces espèces présentent une importance agronomique particulière. Les cultures de certaines Légumineuses sont d'un intérêt de premier ordre , du fait de leur mode de nutrition azotée ( symbiose avec des bactéries du genre rhizobium, réalisant la fixation de l'azote atmosphérique), car elles permettent à la fois une économie d'engrais lors de leur culture et un enrichissement des sols en matières azotées (assolement , enfouissement) . En outre , dans les zones semi-arides et arides où l'absence d'humus pose de grave problème , l'introduction et l'adaptation de certaines Légumineuses sont au premier plan des préoccupations. D'autant plus que les sols algériens sont généralement pauvres en matières organiques et régulièrement soumissent au phénomène d'érosion (ABDELGUERFI BERRIKIA et ABEDELGUERFI 1986. ,OUZZANE et ABEDELGUERFI, 1989).

De plus, les graines de certaines Légumineuses sont particulièrement riche en protéines de réserve, présentant parfois des aminogrammes tout à fait compatibles avec une nutrition animale et humaine. Elle sont utilisées comme complément alimentaire pour le bétail et interviennent aussi dans l'alimentation humaine .

Les Légumineuses fourragères ( luzerne ,trèfle ,sain foin etc... ) sont cultivées essentiellement pour leur système végétative, producteur de matière verte. Le développement de ce type de culture, dans un pays comme le notre, contribuera certainement d'une part à compenser le déficit fourragère, estimait, d'après MOSKAL, 1983, à 3 milliard en U.F et d'autre part à anéantir la carence chronique, des ressources azotées dans l'alimentation du cheptel et dont les conséquences se répercutent sur les performances des animaux ( ZEGHIDA et al .,1997).

Le genre Scorpiurus fait partie de cet ensemble de plantes fourragères sauvages qui peut constituer un model biologique, fortement intéressant de par sa production et la qualité nutritive de ses graines .La grosseur des graines et leurs appréciations par les ovins pourrait amener les éleveurs à l'utiliser comme aliment concentré (M'HAMMEDI BOUZINA,1992).

Les résultats de certaines analyses chimiques effectuées dans le but d'évaluer la valeur alimentaire des espèces du genre Scorpiurus au stade végétative et comparée à d'autres espèces appartenant aux Légumineuses comme les Hedysorum, Onobrychis et les Trifoliées (la luzerne pérenne et les luzernes annuelles) révèlent l'existence en quantité très appréciables de matière minérale (M.M) et azotées totales(M.A.T) .

Le coefficient de digestibilité de la matière organique (C.U.D) est assez voisin de ceux du bersim (GAILLARD et al. , 1977) et des luzernes annuelles, (GOUMIRI et ABEDELGUERFI , 1989). Leurs teneurs en Matières azotées digestibles(M.A.D) sont par contre inférieures à celles des Trifoliées (ANDRIEU et al. , 1978) ( tableau 1).

Aujourd'hui, les légumineuses spontanées d'intérêt fourragères sont appelées à être valoriser et intégrer dans des programmes de sélections pour participer à la réduction du déficit en protéines que connaît l'alimentation animale en Algérie.

Tableau 1 : Résultats de l'analyse de la composition chimique des espèces de Scorpiurus , Médicago et Onobrychis. Source (GOUMIRI et ABEDELGURFI,1989).

Teneur en Matière
Espèces	M.M (%)	M.A.T (%)	C.B (%)	C.U.D (%)	U.F (%)	M.A.D (g)
*Scorpiurus.muricatus.* *sulcatu*	19.47	21.83	15.61	73.84	0.57	173.20
*Scorpiurus.muricatus.* *subvillosus*	22.42	20.55	14.12	75.46	0.58	161.03
*Scorpiurus.vermiculatus*	20.14	14.44	14.60	74.87	0.58	103.17
*Hedysarum aculeolatum*	16.14	11.80	14.94	75.57	0.61	78.22
*Médicago arborea*	09.00	22.00	23.00	66.00	0.47	173.00
*Onobrychis capot-golli*	09.84	11.63	22.59	66.31	0.54	76.61

M.A.T: Matières Azotées Totales; M.A.D: Matières Azotées Digestibles ; M.M : Matières Minérales ; C.U.D: Coefficient de Digestibilité de la matière organique ; C.B: Cellulose Brute ; U.F: Unité Fourragère.

3.2-Micropropagation des Légumineuses in-vitro

La micropropagation chez les Légumineuses est récente et c'est seulement au cours des quinze dernières années que son application est devenue possible sur de nombreuses espèces . Elle a pu être réalisée aussi bien via l'organogenèse que l'embryogenèse somatique ( HAMATT et al , 1986).

La multiplication végétative in-vitro par néoformation de bourgeons a été obtenue chez plusieurs Légumineuses et avec divers explants . On note cependant que ce mode de régénération n'est bien maîtrisé que chez certaines espèces à petites graines, cultivée pour la production de fourrage vert comme la luzerne ( SAUNDERS et BINGHAM, 1972; 1975; BINGHAM et al ., 1975; WALKER et al ., 1978 ) , les trèfles ( PELLETIER et PELLETIER, 1971 ; BEACH et SMITH, 1979; PHILLIPS et COLLINS, 1979) ou le lupin (SROGA, 1987). Chez ces derniers, les plantes sont facilement régénérées à partir de cal dérivant d'organes divers : racines, hypocotyle, cotylédon, tige, pétiole, feuille ou organes floraux.

Contrairement aux précédentes, les Légumineuses à grosses graines telles que le soja, le pois , l'haricot et le fève, ont montré très longtemps une faible capacité de régénération en culture de tissus . Dans le cas du soja , seule l'utilisation d'embryons zygotiques immature (BARWALE et al ., 1986; GRAYBOSCH et al., 1987 ) ou de jeunes feuilles (WRIGHT et al ., 1987; WRIGHT et al. , 1986 ; WEY et XU, 1988) a permis l'obtention de cals caulogènes . Chez le pois, de bons résultats ont cependant pu être obtenus à partir de tranches d'hypocotyles MALMBERG et ,(1979) , de jeunes feuilles ( MOROGINSKI KARTA, 1981) et d'embryons mûrs ( ATANASSOV et MEHANDJIER, 1979).

Autrefois limitée à quelques espèces de la famille des ombellifères, l'embryogenèse somatique a été obtenue in-vitro sur de nombreuses autres famille ( AMMIRATO, 1983) dont celle des Légumineuses . Toutefois dans cette famille, l'obtention d'embryons somatique reste encore limitée à quelques espèces qui la plupart du temps appartiennent aux Légumineuses à petites graines . En effet, les premiers embryons ont été obtenus par SAUNDERS et BINGHAM (1972) sur la luzerne. De nombreux travaux ont été réalisés depuis et se sont portés sur des espèces particulièrement intéressantes sur les plans agronomiques et économiques . Quelques résultats obtenus ces dernières années ont été répertoriés dans le tableau 2.

Tableau 2 : Plantes régénérées par embryogenèse somatique chez les légumineuses

Espèces

Source d'explants

Références

Pisum sativum

Lens culinaris

Glycine max

Winged bean

Médicago

Trifolium

Phasueolus

Apex

Apex et embryon immature

Embryon immature

cotylédon

Noeud cotylédonnaire

Embryon immature

Hypocotyle et cotylédon

Inflorescence et tige

Embryon immature

Hypocotyle

Embryon immature

Pétioles

Pétiole

Culture cellulaire

feuille

Protoplaste

Hypocotyle

Culture cellulaire

Hypocotyle et épicotyle

Embryon immature

JACOBSEN et KISELY, 1987

KISELY et al., 1987

SAADI, 1991

SAXENA et KING, 1987

TETU et al. ,1987;

PARROTT et al., 1989

GUIFERREIRA et al., 1990

HARTWECK et al., 1988

BARWALE et al., 1986

VENKETE SWARANS et al., 1990

SANDERS et BINGHAM,1972

BINGHAM et al., 1975

SKOKUT et al.,1985

STUART et al .,1985

BIANCHI et al. ; 1988

BROWN,1988

REISH et BINGHAM , 1981 ; GROSE et BINGHAM, 1984

TEOULE et DATTEE ,1987

PELLETIER et PELLETIER, 1971 ;

BEACH et SMITH,1979

PHILIPS et COLLINS , 1979

SANTALLA et al.,1998 ALAVENA et ROTA , 1990

4 -OBJECTIF DU TRAVAIL

La micropropagation une des plus remarquable technique qu'offrent les cultures in-vitro et la biotechnologie en général permet d'obtenir des individus semblables et génétiquement "conformes" aux plantes d'origine, devrait fournir un moyen efficace pour multiplier par exemple des individus hybrides très performants à des fin de production commerciale .

En effet partant d'un fragment de végétal, placé en conditions plus au moins aseptique, la plante mère peut être multipliée en un temps très court, en plusieurs millions d'exemplaires et cela à l'infini. Il s'agit là probablement d'un objectif lointain dont l'intérêt technico-économique doit être soumis à évaluation. La technique est maîtrisée surtout chez les espèces à petites graines cultivées pour la production de fourrage vert. Contrairement au Scorpiurus, qui selon notre recherche bibliographique, nous a conduit à conclure, qu'il n'existe aucune étude dans ce contexte sur l'espèce en comparaison avec d'autre Légumineuses.

Le Scorpiurus est une plante autogame, à fleurs pauvres en nectar. L'autofécondation qui se déroule à une étape précoce du développement de la fleur, réduit fortement le taux de pollinisation croisée. Les essais des croisements interspécifiques effectués par DOMINGUEZ et GALLIANO (1974) pour la recherche des hybrides ne semble pas réussir. Le mode de reproduction qui caractérise cette plante rendait difficile l'obtention des hybrides, les méthodes de micro propagation in- vitro permettent de palier à cet obstacle.

L'absence de travaux ayant porté sur la régénération in-vitro chez le Scorpiurus , nous a permis d'orienter notre tache vers la recherche d'une méthode de régénération in-vitro et de tester les aptitudes à la régénération de plusieurs génotypes de Scorpiurus . Le présent travail représente un prélude pour l'amélioration génétique du Scorpiurus. Cette tentative s'appuyait sur les résultats déjà obtenus avec les autres Légumineuses réputées pour longtemps récalcitrantes. Les voies à explorer sont l'organogenèse (formation de nouveaux bourgeons) ou d'embryogenèse somatique (formation d'embryons somatiques) avec ou sans passage par une phase de callogénèse. La démarche scientifique suivie pour essayer d'atteindre les objectifs que nous étions fixés consiste à tester trois principaux paramètres pouvant influencer ce processus. Il s'agit d'abord de la nature de l'explant, puis l'effet génotypique et aussi la nature du milieu (régulateurs de croissance et la source carbonée).

CHAPITRE II MATERIELS et METHODES

Le Scorpiurus est une plante dicotylédone appartenant à la famille des Légumineuse (troisième grande famille chez les Angiosperme) et la sous famille des Papilionacées, à la tribu Hedysarée et au genre Scorpiurus. La classification du Scorpiurus étudiée par plusieurs auteurs, indique que jusqu'à nos jours, pas de nomenclature claire concernant ces espèces et reste cependant très confuse, en particulier pour l'espèces Scorpiurus muricatus en raison de l'existence d'un polymorphisme morphologique. De ce fait de nombreuses classifications sont proposées (BATTANDIER et TRABUT, 1890 ; JULIEN,1894 ; JAHANDIEZ et MAIRE 1932 ; FOURY, 1954 ; LE HOUEROU, 1959 ; NEGRE, 1961; QUEZEL et SANTA, 1962 et DOMINGUEZ et GALIANO,1974) se basant essentiellement sur l'étude de caractères morphologiques.

Pour notre travail , nous retiendrons la classification de DOMINGUEZ et GALIANO,(1974 ).

· Scorpiurus vermiculatus est la forme sauvage la plus stable du genre Scorpiurus (2n=14);

· Scorpiurus muricatus :Cette espèce regroupe des plantes annuelles (2n=28), au sein du quel on distingue:

Le Scorpiurus est une plante annuelle , autogame. Elle présente au stade plantule de grands cotylédons qui prennent l'aspect d'un axe dressé, lancéolé et atténue progressivement en pétiole. Les premières feuilles qualifiées de primordia foliaires sont entières et sont disposées sur un court hypocotyle en rosette lâche. La tige est rampante et dont la taille peut atteindre , les 40 à 50 cm de longueur avec un large recouvrement végétal. Les feuilles sont grandes, entières et de forme ovales (BENSALEM et al.,1990; YOUNSI , 1996 ).

La floraison débute vers le mois de mars et s'étend jusqu'a mai .Les graines en nombre de (9 à 11) sont pourvues d'un tégument très dur causant ainsi la dormance tégumentaire (BATTANDIER et TRABUT, 1890 ; NEGRE, 1990 ).

la différenciation morphologique entre les espèces est généralement décelable au moment ou les plantes atteignent le stade adulte (Planche 1).

L'espèce est dotée d'un système racinaire pivotant, puissant et atteignant parfois 1.0 mètre de taille (OUZZANE et ABEDELGUERFI, 1989).

Les fleures sont grandes, à pétales jaunes ou parfois rougeâtres. Elles sont généralement solitaires. Les fruits sont des gousses, grosses ,repliées sur elles- mêmes en spires régulières . Elles sont couvertes de tubercules , élargies au sommet en forme de chapeau et couvertes d'épines en écusson (BATTANDIER et TRABUT, 1890 ; NEGRE,,1961; CARENE, 1992).

Les fleurs sont de petites tailles , groupées en inflorescence (2 à 5 fleurs) et portées par de longs pédoncules. Les fruits sont des gousses enroulées de façon irrégulière et se décomposant en articles à maturité. Cependant on note la présence d'aiguillons au niveau des gousses chez le Scorpiurus muricatus ssp sulcatus alors qu'ils sont absent chez le Scorpiurus muricatus ssp subvillosus (BATTANDIER et TRABUT, 1890 ; JULIEN, 1894 ; NEGRE,,1961; CARENE, 1992).

Bien que l'origine de Scorpiurus soit obscure et sa classification peu claire . C'est une espèce très connue par les agriculteurs communément appelés cheniettes , Tagourit ou El ghagfa . Elle est citée comme mauvaise herbe .

On signale sa répartition dans le monde entier. On la rencontre, en plus du Nord africain , en Australie , en Amérique du nord et aussi sur le basin méditerranéen (les Iles Canaries, Sud du Portugal, l'Espagne, Centre de l'Italie, Malta, Sud-ouest de la France, la Grèce) ; mais dont les conditions pédoclimatiques différent d'une espace à une autre, ZIELINSKI,(1991) .

En Algérie, certains auteurs comme BATTANDIER et TRABUT, (1890 ) trouvent que le Scorpiurus vermiculatus et Sscorpiurus muricatus ssp subvillosus sont présent pratiquement dans toute la partie Tell de l'Algérie. Ils poussent préférentiellement bien dans les régions bien arrosées, de faible altitudes, sur sol à texture fine et pauvre en calcaire total. Alors que d'autres comme JAHANDIEZ et MAIRE (1932), limitent leurs présence aux zones de pâturages de type argileux, et sablonneux des plaines et plus rarement sur les régions des bases montagnes .

Quant au Scorpiurus muricatus ssp sulcatus , il semble moins exigeant sur le plan nutritionnel et pédologique (BENSALEM et al.,1988). Il parait effectivement s'accommoder d'habitat différent , on a signalé sa présence sur les terres argileuses de Constantine, lieux herbeux et pentes des collines JULLIEN (1894). Par contre BENSALEM et al (1990) indique l'avoir rencontré dans plusieurs régions en Algérie (figure 3).

Au cours de cette étude, huit génotypes d'origine, très diverses ont été utilises afin d'éviter tout apparentement entre eux. Ils sont issus de huit populations de Scorpiurus distantes les unes des autres de 50 à 800 km et qui ont été récolté dans les régions nord du pays : Miliana - Alger- Médéa -Bejaia - Tébessa - Skikda - Barika et Annaba .

* Trois autres génotypes appartiennent à Scorpiurus subvilusus (B1--B6-B8) ;

Toutes les semences employées dans notre étude, nous ont été aimablement fournies par M^er.M'HAMMEDI BOUZINA enseignant chercheur à l'institut agronomique de Chlef. La récolte des graines à été faite lors des différentes sorties de prospections effectuées dans le cadre d'une collaboration INA EL Harrach, INA Paris et ICARDA de Syrie.

Les graines de Scorpiurus présentent un faible pourcentage de germination suite à une dormance tégumentaire. Selon WHITE in COME (1970), la cuticule et une partie des cellules palissadiques empêchent la pénétration de l'eau chez certaines graines de Llégumineuses. Pour surmonter cet obstacle, les graines ont été scarifiés graine par graine, à l'aide d'une planche en bois recouverte de papier verre et d'une lime métallique. Celles ci étant perméable à l'eau germent plus facilement.

Les graines sont désinfectées dans une solution d'hypochlorite de calcium concentrée à 7% et d'ISIS liquide (un détergent liquide équivalent au domestos) à 4% pendant 25 ;minutes. Après plusieurs rinçage à l'eau distillée stérile, les graines sont mises, aseptiquement, à germer sur milieu gélosé (0,8%), à l'obscurité pendant huit jours, les plantules présentent les caractéristiques suivantes.

Planche 1:(A) - Jeune plantule de Scorpiurus au stade de 25 jours .(B) -Plante adulte de Scorpiurus au stade floraison .(C) - Fruit en gousse de Scorpiurus muricatus. (D) - Graine de Scorpiurus muricatus.. (E )- Fruit en gousse de Scorpiurus vermiculatus .(F) - Graine de Scorpiurus vermiculatus

3-TECHNIQUE DE CULTURE IN-VITRO

Le pH est ajusté de 5.7 à 5.8 avec une solution d'hydroxyde de sodium, avant que le milieu ne soit stérilisé par autoclavage (20 minutes à 120°C , 2bar). Ils sont ensuite repartis en fraction de 15 ml dans des boites de pétris stériles de 9 cm de diamètre pour être utilisé.

Les explants de tiges , de feuilles , de pétioles et de cotylédons sont plongés dans une solution d'éthanol à 70 % (V/V) pendant 30 secondes, puis immergés dans un désinfectant commercial à 12 % (V/V) pendant 15 à 20 minutes . Les explants sont ensuite rincés trois fois à l'eau distillée stérile afin d'éliminer toute trace du produit désinfectant. Après la désinfection , les tiges , pétioles , feuilles et cotylédons sont découpées stérilement en fragments d'environ 1 cm de longueur.

A partir de plantules cultivées in -vitro, âgées de 8 jours ,les explants de cotylédons , d'apex, d'hypocotyles et de racines sont prélevés et fragmentées en petits morceaux de 2 mm de longueurs pour les explants cotylédons, racines et 5 mm pour les explants hypocotyles .

Les explants ainsi préparés, sont ensemencés sur les différents milieux , à raison de 15 explants par boites de Pétri avec un nombre de répétition de cinq(05). Les boites sont ensuite scellées par un film extensible " parafilm" . La dissection et l'ensemencement se font sous une hotte stérilisée avec de l'eau de javel et de l'alcool à 70% . Les pinces et scalpels sont passés à l'éthanol 70% puis flambés .

Après l'ensemencement , les cultures sont exposées , soit à l'obscurité , soit à la lumière (2500lux), 16 heurs de photopériode et à une température de 25 + 1°C. ces dernières conditions seront maintenues pour la plupart des cultures durant la phase de développement et de germination des embryons somatiques ou pour l'enracinement et le développement des bourgeons.

L'évaluation de la callogénèse a été appréciée quantitativement (la masse de la teneur en matière fraîche et sèche ) et qualitativement (importance, couleur et texture des cals).

La callogenèse est exprimée par le pourcentage d'explants callogènes pendant une durée d'exposition de quatre (4) semaines sur le milieu d'induction . En outre la texture, la coloration sont notée. Ainsi que l'évolution de la matière fraîche et sèche est suivie au cour du temps. Les cals obtenus sont prélevés et pesés individuellement. La teneur en matière sèche est évaluée, après passage des cals à l'étuve 65°C pendant 24 heurs. La taille ( diamètre) des cals est appréciée approximativement.

Le relevé des structures embryogènes ou organogènes est réalisé périodiquement ce qui permet de mentionner les observations suivantes:

Ces paramètres peuvent être définis pour chacune des boites de pétri ou pour la totalité des boites d'un même test. L'effet des différents facteurs conditionnant , la production des structures embryogènes ou organogène est étudiée statistiquement au moyen des méthodes d'analyse de la variance (DAGNELIE,1970).Les analyses de la variance sont réalisées avec le logiciel (statitcf). Pour la comparaison des moyennes, elle est réalisée à l'aide du test de NEWMAN& KEULS.

Les échantillons sur lesquels nous avons effectué des coupes histologiques sont d'abord fixés pendant 24 heures par le FAA(Formol 40%: 2 ml , Alcool 95%: 17ml , Acide acétique : 2 ml ) , lavés à l'eau courante pendant 30 minute puis déshydratés progressivement par des passages successifs dans des bains d'éthanol de 25% jusqu'à l'alcool absolu pendant 30 minutes chacun . pour les échantillons de petite taille , une étape supplémentaire est nécessaire . Elle consiste à les inclure dans l'agar à 10 % pour pouvoir mieux les orienter .Après leur passage à l'alcool , les échantillons sont transférés dans un solvant de la paraffine, le toluène , d'abord mélangé à l'alcool ( 3/4 - 1/4 ; 1/2 -1/2 ; 1/4 - 3/4 ) ensuite pur .

Une imprégnation de transition toluène - paraffine , à l'étuve à 60 °C est effectuée avant l'inclusion des échantillons dans la paraffine en fusion coulée, entre deux lames métalliques (barres de LEUKART) et sur une plaque de verre.

A l'aide de pinces fines et chauffées, les échantillons sont orientés dans les bains selon le plan de coupe, avant solidification des blocs. Ceux ci sont sectionnés au mictrome à 7ou 10 um d'épaisseur selon les échantillons.

En fin les coupes sont montées sur des lames préalablement gélatinées et après un déparaffinage au toluène et alcool et un rinçage à l'eau distillée, elles sont colorées dans le réactif de SCHIFFS et l'hématoxyline de GROAT. Un passage à l'eau courante a lieu entre chaque bain de colorant . Les lames sont alors passées rapidement dans des bains d'alcool 100° absolu et remises à sécher à 35 °C pendant plusieurs jours.

CHAPITRE III RESULTATS

compte tenu de l'absence totale d'un support bibliographique traitant la question de la régénération in-vitro du Scorpiurus ; nous étions amené donc à nous inspirer , dans une première série d'expérience, que nous avons qualifiée de préliminaire, d'un certains nombre de travaux réussis portant sur l'organogenèse et l'embryogenèse somatique de plusieurs espèces appartenant à la famille des légumineuses en vue d'établir un protocole expérimental susceptible de nous conduire à résoudre notre problématique . Cette problématique qui se résume en fait à essayer d'obtenir soit des bourgeons néoformés soit des embryons somatiques et par la même , réussir dans la mesure de possible, à régénérer des plantes entières via l'une ou l'autre méthode de micropropagation .

Après l'étude bibliographique , nous nous sommes parvenues à établir un protocole de travail , qui prenait en compte les paramètres suivants :

La lecture des résultats des expériences préliminaires a été faite à trois niveaux de considération . Le premier, concerne la callogenèse, le second l'organogenèse et le troisième l'embryogenèse somatique.

S'agissant de la callogenèse, nous avons constaté qu'elle s'est déclenchée sur l'ensemble des explants testés à l'exception des apex qui débourrent et cela, quelle que soit leur nature ou leur origine . Toutefois, son importance, semble varier selon l'explant et aussi selon le milieu de culture ( en particulier sa composition hormonale). En effet, concernant les explants, ce sont les cotylédons suivies des hypocotyles qui paraissent répondre le mieux à la callogenèse . Quant aux milieux de cultures, ils induisent dans leurs majorité, des cals, en dehors de ceux dépourvus de régulateurs de croissance ou pourvus uniquement de ( BA) ou de 2,4-D seuls. Les meilleurs réponses sont obtenues sur les milieux : D3B0,1 ; D0,1 B3 et D1B3.

Les résultats des expériences préliminaires, nous ont permis de mettre en exergue, l'influence de la photopériode. L'exposition des cultures sous une photopériode de 16/8 (16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité) favorise de loin la callogenèse que l'obscurité.

Par ailleurs, les plantules ayant servi comme "parc à bois " ou plantes - mères, apportent aussi leur part d'influence. Ainsi, nous avons pu relevé que les explants provenant de plantules cultivées in-vitro réagissent mieux que ceux prélevés des plantules cultivées en pots .

Ce sont là, les principaux remarques que nous avons pu relever lors de ces expériences préliminaires .

Au sujet de l'organogenèse, nous avons remarqué qu'elle s'exprime chez les trois génotypes testés. Toutefois, comme en callogenèse, son importance est fonction de la nature l'explant et de la composition hormonale du milieu . Effectivement, ce sont encore une fois les cotylédons et les hypocotyles qui expriment des aptitudes organogènes et ce sont aussi les explants issus de plantes cultivées in-vitro qui réagissent positivement à ce processus, à l'inverse de ceux prélevés sur plantules cultivées en pots.

En ce qui concerne les milieux de culture, ce sont ceux pourvus d'un mélange (2,4-D - BA) qui ont permis l'obtention de structures organogènes. Ces milieux sont représentés par le D0,1B3, le D1B3 et le D1B5.

Comme en callogenèse, l'organogenèse est complètement inhibée à l'obscurité ; un régime photopériodique de 16/8 ( 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité ) lui est très favorable (Figure 4).

Concernant l'embryogenèse somatique, les résultats préliminaires indiquent qu'elle est possible chez le Scorpiurus. Cependant, elle reste tributaire, comme c'était le cas en callogenèse et en organogenèse, de plusieurs facteurs tels que : la nature de l'explant, le génotype et la composition hormonale du milieu.

Parmi, tous les explants testés, les cotylédons , les hypocotyles et les racines, sont les seuls à avoir exprimé des potentialités embryogènes et seulement avec deux génotypes (le V12 et le B6) sur trois.

Quant à l'influence de la composition hormonale du milieu, nous avons relevé que, parmi toute la panoplie de milieu de culture que nous avons testé, seuls les milieux à (2,4-D - BA), notamment le D3B0,1 et le D0,1B0,5 , possèdent des pouvoirs inducteurs.

Par ailleurs, il est important de signaler que les différents types d'explants réagissent mieux à l'embryogenèse somatique en présence de lumière qu'en obscurité ( Figure 4).

Le temps d'apparition des embryons sur les cals, lorsque les cultures sont soumises à l'obscurité, prend beaucoup plus de temps comparativement aux résultats obtenus en présence de la lumière. Effectivement , les structures embryogènes n'apparaissent qu'après 60 jours de culture sur le milieu d'induction. Elles n'atteignent le stade cotylédonnaire qu'au bout du 90 ^éme jours. Alors qu'à la lumière , elles apparaissent dés le 15^éme jours qui suit l'ensemencement et atteignent le stade cotylédonnaire au alentour du 25^éme jours de culture.

Nous avons procédé dans cette partie réalisé des coupes histologiques pour confirmer , si les structures organogènes ou embryogènes que nous avons obtenues représentent réellement des bourgeons ou des embryons somatiques.

L'apparition des bourgeons sur les explants hypocotyles, cotylédons et racines s'est faite de façon progressive. Néanmoins, il a été possible de distinguer 2 situations. D'une part, un certain nombre d'explants édifiant des bourgeons très rapidement (7 à 8 jours) .D'autre part, des régénérations ne se formant qu'après un temps de culture plus important (12 à 35 jours ).Il était intéressant de savoir si le processus d'organogenèse etaient le même dans les deux cas. Quelques coupes histologiques ont été effectuées.

Les explants ont été transformés par la culture. Les tissus sont plus lâches avec des amas de grandes cellules très vacuolées. Il y a constitution de cal sur les zone de blessures et l'intérieur de l'explant. De même, l'épiderme n'est plus continu mais interrompu, par des cellules de type cal à cellules de taille variable. On note la présence de très jeunes méristèmes dont le point végétatif est identifiable(Planche 2B). Cet ensemble est très dense fortement colorer. La discontinuité dans les explants entre les bourgeons néoformés et les tissus conducteurs permet d'envisager le cal de néoformation à partir de cellules de cal.

Nous avons regardé la forme et l'organisation cellulaire des cals embryogènes et des embryons somatiques obtenus, à travers des coupes histologiques.

Les cellules des cals embryogènes sont souvent grandes et vacuolisées. On observe quelque fois, la présence d'amas de cellules différentes du reste du cal. La taille de ces cellules particulières est inférieure aux autres cellules du cal, leur contenu est dense et le noyau occupe une grande partie de la cellule. Elles sont probablement à l'origine des embryons somatique. Les parties sous-jacentes aux embryons somatiques sont composées de cellules de grandes tailles(Planche 3:A).

La coupe d'un embryon au stade globulaire ou un pseudo-embryon sur son cal, nous montre un pédicelle qui le rattache au cal (Planche 3:B). Dans le quel, on trouve pas de liaisons vasculaires qui relieraient le pseudo-embryon au cal, mais il y à une rupture de l'épiderme à ce niveau.

A travers les résultats obtenus lors des essais préliminaires, nous avons décidé d'orienter notre travail de recherche sur deux axes essentiels à savoir l'organogenèse et l'embryogenèse somatique qui paraissent être favorables à la lumière qu'a l'obscurité. Par ailleurs il s'avère utile d'utiliser comme source d'explants, ceux issues des plantules cultivées in-vitro avec les trois génotypes testées et ayant manifestés des aptitudes embryogénes et /ou organogénes.

Planche 2: -Coupes histologiques longitudinales de bourgeons formé par voie directe après 7 à 8 jours ( A ) et par voie indirecte après 12 à 35 jours ( B) de culture des explants d'hypocotyle du génotype V12 sur milieu de culture D0,1B3( milieu pourvu de 3mg/l de BA et 0,1mg/l de 2,4-D).

Planche 3:-Coupes histologiques longitudinales d'embryons somatiques au stade globulaire (A) et au stade torpille (B) obtenus à partir d'explant d'hypocotyle du génotype V 6 sur milieu de culture D3B0,1( milieu pourvu de 3mg/l 2,4-D et 0,1 mg/l de BA).

ESSAIS D'OPTIMISATION

A la lumière des résultats obtenus au cours des essais préliminaires , et qui nous ont permis de conclure que la régénération par organogenèse ou embryogenèse somatique est possible chez l'espèce Scorpiurus. Nous avons lancés une série d'expérience, de grande envergure, dans le but d'apporter des réponses à un certains nombre de questions que nous nous sommes posées. Parmi ces questions , on voulait savoir s'il n'existe pas un problème de répétabilité ou de reproductibilité des expériences qui peut poser dans notre cas. On voulait aussi déterminer les possibilités d'optimisation de la production de bourgeons ou d'embryons somatiques et en dernier, voir l'éventualité de régénérer des plantes entières via l'organogenèse ou l'embryogenèse, autrement dit, tester la convertibilité des bourgeons ou embryons somatique en plantes.

Pour cela, nous avons intégré, dans ces expériences, d'une part des régulateurs de croissance autres que ceux utilisés lors des essais préliminaires. Il s'agit de l'AIA et de l'ANA pour les auxines et de la Kinétine pour les cytokinine et d'autre part de nouveaux génotypes (V13, V6 ,B6,B1 et L3) dans l'intention d'élargir, le plus possible, la variabilité génétique de l'espèce étudiée et augmenter, ainsi, les chances de tomber sur un génotype à fort potentiel organogène et ou embryogène.

Lors de cet essai , nous avons testé l'effet que peut avoir l'apport seul puis combiné des auxines ou des cytokinines, sur l'aptitude à la callogenèse chez les huit génotypes de Scorpiurus choisis, en se servant des explants ayant montré des capacités organogènes et embryogènes lors des essais préliminaires. Les cultures sont conduites sur milieu de base MS contenant différentes combinaisons hormonales.

Le suivi de la callogenèse porte à la fois sur la détermination du pourcentage d'explants callogènes, l'estimation quantitative des cals formés, et sur la description des caractéristiques morphologiques des cals (texture et couleur) .

Les régulateurs de croissance testés sont les auxines, représentées par le 2,4-D, l'AIA et l'ANA et les cytokinines , représentées par la BA ou BAP et la Kinétine. Ils sont apportés seuls ou combinés entre eux , à différentes doses (0,1; 0,5 ; 1; .. . . . . .15; 20; 25 ;30 ; 35 ; 40).

De manière générale, l'usage des auxines seules, à faibles concentrations dans le milieu d'induction s'est révélé inefficace à la callogenèse quelque soit le génotype ou le type d'explant utilisé . Cependant, leur apport à forte concentrations semble déclencher une légère callogenèse , souvent localisée au niveau des zones de blessures des explants. C'est le cas du 2,4-D ou de l'ANA et l'AIA lorsqu'ils sont fournis, au milieu, respectivement aux doses de (5 mg/l à 10 mg/l) et (10 mg/l à 40 mg/l). L'emploi de concentrations plus fortes devient létale.

Quant à l'apport des cytokinines seules, dans le milieu d'induction, quelle que soit la dose, la nature de l'explant , ou le génotype utilisé, il se montre sans effet aucun sur la callogenèse.

Les combinaisons hormonales testées, lors de ce travail, sont du type (2,4-D x BA; 2,4-D x Kin ; AIA x BA ; AIA x Kin ; ANA x BA et ANA x Kin).

Les résultats du tableau 3, représentant l'influence de la nature et de la concentration des régulateurs de croissance sur l'aptitude à la callogenèse des cotylédons de plusieurs génotypes, montrent clairement que l'apport combiné des auxines et des cytokinines ne peut être que bénéfique et par conséquent très stimulant à la callogenèse. En effet, la callogenèse a été induite, mais à des degrés différents, sur l'ensemble des milieux testés et ce sont les combinaisons à base de 2,4-D qui semblent développer les meilleurs pouvoir inducteur. La callogenèse est, davantage, améliorée lorsque l'association ou la combinaison regroupe le 2,4-D et la BA.

On note par ailleurs que le pourcentage callogène des explants devient plus important, lorsque le rapport auxine/cytokinine , dans le milieu, est supérieur à 1.

On remarque aussi que la présence de fortes doses de kinétine, dans le milieu, permet souvent l'obtention de cal à texture friable et à aspect chlorophylliens (coloration vert pâle)( Planche 4:A). La présence de BA,

quant à elle , semble favoriser la production de cals à texture compacte et à coloration verdâtre (Planche 4:B), bien qu'il y ait parfois présence de tâches rougeâtres .

Tableau 3 : Variation de l'aptitude à la callogénèse en fonction de la composition hormonale du ( quelque soit le génotype testé). Les résultats sont obtenus après 30 jours de culture des explants cotylédons .

Taille des cals : (+) : (0 - 0.5)cm ; (++) : (0.5 - 1)cm ; (+++) : (1 - 1,5) cm.

Composition hormonale du milieu

Pourcentage d'explants callogènes

Couleur des cals

Texture des cals

Taille des cals

N4B0,1

N4K1

D3B0,1

A20K11

A20B1

D2K1

43.57

30.62

85.75

42.50

40.87

60.62

Vert

Compacte

+++

N1B3

N0.1K11

D0.1B3

A1B3

A4K11

D0.1K1

30.00

20.87

91.75

19.00

12.37

36.37

Vert

Vert pâle

Vert

Vert pâle

Vert

Compacte

Friable

Compacte

Friable

Compacte

+++

Les résultats de nos expériences, nous ont révélé que la callogenèse dépendait aussi de la nature des explants. Dans notre cas, ce sont les explants de cotylédons suivis des hypocotyles qui réagissent le mieux à la callogenèse. Leur pourcentage d'explant callogène est presque similaire et il est de l'ordre de 45% à 100%.. Les racines, quant à elles, paraissent développer de faibles capacités callogène avec un pourcentage oscillant généralement entre 13 % et 40%.

La callogenèse se déclenche après les cinq premiers jours de culture qui suivent l'ensemencement. Les explants commencent d'abord par connaître un léger gonflement, accompagné de brunissement, au niveau des zones d'excisions. Les cals font, souvent, leur apparition au niveau de ces zones et sur les facettes, des explants, se trouvant en contact avec le milieu et se généralise, par la suite, pour couvrir la totalité de l'explant. Le développement de la callogenèse devient plus important au delà du 10^ème ou du 12 ème jours de culture

On note par ailleurs, que la croissance des cals varie aussi d'un type d'explant à un autre. Ainsi, nous avons pu constaté que les cals provenant des explants de cotylédons, malgré leur apparition tardive, connaissent une croissance plus rapide et donc plus importante que ceux produits par le reste des explants : hypocotyles et racines.

Les résultats préliminaires ne nous ont pas permis d'avoir une idée précise sur l'effet génotypique et ses conséquences sur la callogenèse, compte tenu du nombre très restreint de génotypes soumis à l'expérience. L'élargissement des expériences à d'autres génotypes est devenu donc nécessaire. Ainsi, huit génotypes de Scorpiurus ont été choisis, afin de tester leurs aptitudes à la callogenèse, en se servant d'un milieu (D0,1B3) ayant montré de bon pouvoir inducteur, lors des résultats préliminaires (l'annexe 3).

Les résultats du tableau 4, présentant les aptitudes à la callogenèse, montrent que, pour un explant donné, l'ensemble des génotypes testés développent une callogenèse. Toutefois son, importance change d'un génotype à l'autre. Les génotypes de l'espèce Scorpiurus vermiculatus ( V12, V13 et V6) et Scorpiurus muricatus ssp sulcatus donnent les meilleurs pourcentages callogènes.

Tableau 4: Variation de l'aptitude à la callogénèse de huit génotypes de Scorpiurus sur milieu D0,1B3. Les résultats sont obtenus après 30 jours de culture des explants cotylédons .

Génotypes

Pourcentage d'explants callogènes

Couleur des cals

Texture des cals

Taille des cals

V12

V13

L26

100.00

98.00

96.00

76.00

83.00

85.00

96.00

100.00

Vert

Compacte

+++

Le suivi de la callogenèse, en établissant une cinétique de croissance des cals obtenus, avec les explants de cotylédons des huit génotypes, sur milieu d'induction D0,1B3 ( fig 5), reflète bien l'existence d'une variabilité génotypique. En effet, avec les génotypes de l'espèce Scorpiurus vermiculatus, en particulier le V12, la croissance des cals est plus importante, comparativement aux génotypes de l'espèce Scorpiurus muricatus..

L'ensemble des génotypes et explants testés ont manifesté des aptitudes callogènes. Le pourcentage, la texture, la couleur et la taille des cals dépend de la composition hormonale du milieu, de l'explant et du génotype. En effet , l'usage des auxines ou des cytokinines seules, dans le milieu d'induction, ne favorise pas la callogenèse et les meilleurs résultats sont obtenus avec les explants cotylédons et hypocotyles des génotypes de l'espèce Scorpiurus vermiculatus et Scorpiurus muricatus ssp sulcatus sur le milieu de culture D0,1B3.

Planche 4: Différents types de cals retenus après 20 jours de culture des explants de racine sur milieux d'induction (MS) contenant 4 mg/l d'AIA et 11mg/l de Kinétine (A); 3mg/l de BA et 0,1mg/l de 2,4-D(B)

2.3 Aptitude à l'organogenèse

2.3.1-Aptitude à la rhizogenèse

On désigne par le terme rhizogenèse , la différenciation de racines soit directement sur les explants soit indirectement sur les cals produits au cours de la phase d'induction. Ce processus morphologique est dépendant à la fois, de la composition hormonale du milieu, de l'explant et du génotype .

L'induction des racines semble être, elle aussi, sous grande influence des régulateurs de croissance. La nature des régulateurs, la dose avec laquelle sont employés, ainsi que le type de combinaison hormonale testée sont tous des modulateurs importants de la rhizogenèse. Parmi, toutes les gammes de concentration et les différentes combinaisons hormonales testées, seuls les milieux à AIA * KN et à des degrés moindre le 2,4-D * BA, permettent des résultats positifs (tableau 5). L'action de l'ANA quant à elle est quasiment nulle.

Il n'est pas inutile de rappeler , que la rhizogenèse n'a pu être induite sur les milieux qui contenaient des auxines ou des cytokinines seules.

Généralement les milieux dotés de 2,4-D permettent le développement de racines vigoureuses, de coloration jaunâtre . Sur ses mêmes racines peuvent se développer des racines secondaires (Planche 5:A). On note par ailleurs, que les racines produites en présence d'AIA paraissent moins vigoureuses et ne développent jamais de racines secondaires(Planche5:B).

Tableau 5 : Effet de la composition hormonale du milieu sur la rhizogenèse. Les résultats sont prélevés 3 semaines de la mise en culture des explants (quelque soit le génotype ou explant testé )

Composition hormonale du milieux

Pourcentage d'explant rhizogène

Nombre moyen de racine / explant

Longueur des racines (cm)

D0 ,1B0 ,1

D3B0,1

A20B0,1

A20K0,1

D0,1B3

D1B3

10.25

02.66

11.17

16.44

05.99

03.11

0.86 +0.81

0.45+0.69

0.39+0.49

1.42+1.66

0.83+0.94

0.34+0.515

0.5 -4 .0

1.0 -3.5

1.0 -4.0

4.0 - 8.0

0.5 -4.0

0.5 -2.0

Planche 5: Différents types de racines développées dans des milieux d'induction (MS) contenant respectivement: 0,1mg/l de 2,4-D et 0,1mg/l de BA sur explants hypocotyles (A) ; 20mg/l d'AIA et 0,1 mg/l de BA sur explants cotylédons (B).

Planche 6: Développement de racine, directement sur explant d'hypocotyle (A1), et de cotylédon (A2) sur milieu D0,1B0,1 ( milieu pourvu de 0,1 mg/l de 2,4-D et de 0,1 mg/l de BA) et indirectement sur explant de racine (B), sur milieu A20B0,1 ( milieu pourvu de 20mg/l d'AIA et 0,1 mg/l de BA).

Les résultats, de notre expérience (tableau 6), montrent, de manière inéluctable que la nature des explants influence également la rhizogenèse. C'est toujours les hypocotyles qui prennent le dessus sur le reste des explants en exprimant les meilleures potentialités.

On signale par ailleurs, que les racines formées à partir d'hypocotyles paraissent plus vigoureuses et plus nombreuses comparativement à celles issues de cotylédons. On note également qu'avec certains types d'explants comme les cotylédons ou les hypocotyles l'induction de la rhizogenèse peut être à la fois directe ou indirecte (Planche6: A₁ et A₂), par contre avec d'autres explants comme les racines, elle est exclusivement indirecte(Planche 6 B)

Tableau 6 : Variation des aptitudes rhizogène des explants. Les résultats sont prélevés 3 semaines après la mise en culture des explants (quelque soit le milieu ou le génotype testé)

2.3.1.3 Influence du génotype

Les résultats du tableau 7, donne une idée précise sur la variabilité des aptitudes à la rhizogenèse en fonction des génotypes. Comme on peut le constater, les meilleures réponses ont été obtenues avec les génotypes L3,V12 et V13 sur les huit (08) testés. Des génotypes comme le B8, le B6 et le B1 ne manifestent aucune attitude rhizogène .

Tableau 7 : Aptitudes des huit génotypes de Scorpiurus à la rhizogenèse . Les résultats sont prélevés 3 semaines après la mise en culture des explants (quelque soit le milieu ou l'explant testé)

De l'ensemble des résultats que nous avons trouvé, nous pouvons retenir les conclusions suivantes :

2.3.2 Aptitude à la caulogenèse

On désigne par le terme caulogenèse, la néoformation de bourgeons de manière directe ou indirecte à partir des différents types d'explants.

Après la mise en culture des explants provenant des différents génotypes ; on assiste à la néoformation de bourgeons qui peut se faire selon deux voies exclusives :

Dans certains cas, des bourgeons prennent naissance directement sur la surface de l'explant sans passer par le stade cal. Généralement, après 3 à 5 jours de culture, des zones verdâtres apparaissent à la surface des explants. On assiste, par la suite, à un gonflement superficiel de l'épiderme, qui entraînera son déchirement et finira par crée une petite entrave à travers laquelle sortira les premières primordias foliaires des bourgeons néoformés(Planche 7: A). On note par ailleurs, que la formation directe des bourgeons néoformés n'est cependant possible qu'avec les explants d'hypocotyles .

Dans d'autres cas, les explants développent, après une semaine de culture , des cals compacts et de coloration verdâtre. Souvent, les cals surmontés d'un amas de petites cellules blanchâtres présentent de grandes prédispositions à la caulogenèse. Ces petites cellules blanchâtres dispersées sur les cals peuvent constituer donc un marqueur (ou indice) morphologique de bonnes aptitudes à la caulogenèse. Ce n'est qu'à partir du 15 ^éme jour de culture, que des primordia foliaires (des futures bourgeons néoformés) commencent à se différencier à partir des structures nodulaires réparties sur les cals (Planche 7:B,C et D). Vers le 25 ^éme jours, les cals peuvent être entièrement envahies par des touffes de bourgeons (Planche 7 : E).

Il est important de rappeler par ailleurs, qu' il existe des endroits privilégiés à l'apparition des nouveaux bourgeons comme les zones de blessures par exemple.

Planche 7: (A) Néoformation de bourgeons directement sur les explants d'hypocotyles. Aspect des nodules méristématiques différenciées après 7 jours (B), 10 jours(C) et 15 jours (D)de culture, sur des cals provenant d'explants d'hypocotyles. (E) Développement de bourgeons néoformés en touffe sur le milieu d'induction D0,1B3 (milieu pourvu de 3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).

Après avoir confirmé la possibilité d'obtenir des bourgeons néoformés avec l'espèce Scorpiurus, lors des essais priliminaires, nous assaillons, cette fois-ci, d'améliorer la production en testant trois facteurs essentiels à savoir la composition hormonale des milieux, la nature de l'explant et le génotype.

La nature et la concentration des régulateurs de croissance employé dans le milieu de culture peut influencer considérablement l'organogenèse. Partant de ce constat, nous avons testé l'influence d'un certain nombre de régulateurs de croissance à savoir : trois (3) auxines (2,4-D, AIA et ANA ) et deux (2) cytokinines (BA et Kinétine). Leur apport, dans le milieu, peut être effectué seul ou combiné et à différentes doses.

Les résultats de la caulogenèse, obtenus avec l'ensemble des milieux ayant exprimé un pouvoir inducteur et ceci quel que soit le génotype ou le type d'explant testé, sont représentés dans le tableau 8. Après lecture de ces résultats, nous pouvons retenir que seules les combinaisons 2,4-D x BA , 2,4-D x Kin , AIA x BA et l'AIA x Kin se révèlent favorable à la caulogenèse mais en général se sont les combinaisons à 2,4-D x BA qui fournissent les meilleures réponses. Les combinaisons faites avec l'ANA se sont montrés totalement inefficaces.

Les résultats du tableau 8, nous enseigne une fois de plus sur l'inefficacité de l'usage seul des auxines ou des cytokinines dans le milieu de culture vis à vis de la caulogenèse.

Dans ce volet, les résultats de l'analyse statistique (comparaison de moyennes) pour comparer les rendements moyens en bourgeons par milieu, en se basant sur le test de NEWMAN et KEULS, révèlent l'existence de deux groupes homogènes :

le 2 ^eme groupe, à rendement moyen à faible, englobe les milieux D0,5B0,5 ; D0,5B1 ; D0,5B3 ; A20K11 ; D1B5 ; D0,1 B0,5 ; D0,5 K0,1 et A20 B0,1.

Tableau 8 : Effet de la composition hormonale du milieu sur la caulogenèse . Les résultats sont obtenus après 4 semaines de cultures (quelque soit le génotype ou l'explant testé) . A et B désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Composition hormonale du milieu

Nombre moyen de bourgeons /explant(A)

Pourcentage d'explants caulogène(B)

Rendement

(AxB)

D1B3

D0,1B3

D0,1B0,5

D0,5B0,5

D0,5B1

D0,5B3

D1B5

D0,5K0,1

A20B0,1

A20K11

4.07+2.05

5.41+1.78

1.71+2.27

0.95+2.52

0.69+1.47

1.06+2.81

3.58+3.57

1.26+1.72

1.12+1.96

3.59+3.58

43.98

44.90

01.57

01.68

15.90

04.71

06.14

00.48

00.89

00.27

1.790A

2.430 A

0.027 B

0.16 B

0.080 B

0.050 B

0.22 B

0.0061 B

0.010 B

Nous avons tenté, dans cette partie du travail, de tester les performance, en terme de production de bourgeons, des différents types d'explants et ceci quel que soit le génotype ou le milieu de culture utilisée (en particulier sa composante hormonale).

Tableau 9 Variation des aptitudes caulogène des explants . Les résultats sont relevés après 4 semaines de la mise en culture des explants (quelque soit le milieu ou le génotype testé).

Comme on peut le constater, l'ensemble des explants testés (cotylédons, hypocotyles et racines) réagissent, de façon presque similaire, à la caulogenèse. Ainsi, et en dépit de la différence apparente qui existe, le test de NEWMAN et KEULS n'a pas décelé de différence significative entre les rendements. On note cependant que les explants d'hypocotyles ont une production de bourgeons par explants supérieures à celle des cotylédons et des racines. Par contre, le pourcentage d'explants caulogènes des cotylédons et des racines est supérieur à celui des hypocotyles. La corrélation entre le pourcentage d'explant caulogène et le nombre moyen de bourgeons / explant est négatif (R= - 0.745).

Les travaux entrepris dans cette étude , consistent à tester l'aptitude à la caulogenèse des huit génotypes sur tous les milieux ayant manifesté un pouvoir inducteur .

A la lecture des résultats du tableau 10, nous constatons que l'ensemble des génotypes répondrait favorablement à la caulogenèse. Cependant, les réponses varient d'un génotype à un autre .On distingue, selon le test de NEWMAN et KEULS, trois groupes de génotypes . Un premier groupe, constitué du génotype V6 , présente les meilleures aptitudes. Un deuxième , à faible aptitude caulogène, regroupe le B1, le B6 et le B8 . Le reste des génotypes se situent entre ces extrêmes et correspondent au troisième groupe.

Tableau 10 :Aptitudes des huit génotypes de Scorpiurus à la caulogenèse . Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants ( quelque soit le milieu ou l'explant utilisé) . A et B désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Génotypes

Nombre moyen de bourgeons /explant (A)

Pourcentage d'explants caulogène (B)

Rendement

(AxB)

V12

V13

L26

7.49+1.458

8.77+3.710

5.43+1.618

6.02+2.98

6.23+3.03

3.45+3.98

2.03+0.01

6.47+3.63

14.95

08.80

11.18

08.97

13.96

01.44

02.93

01.47

1.12 A

0.77 B

0.60 B

0.54 B

0.87 B

0.05 C

0.059 C

0.095 C

En ce qui concerne le nombre moyen de bourgeons par explant, on remarque qu'il dépend lui aussi du facteur génotypique. En effet, des génotypes comme le V12 et le B6 parviennent à produire un nombre élevé de bourgeons par explant comparativement au reste des génotypes. Sur ce chapitre, on enregistre que les écart types sont moins importants pour certains génotypes ; c'est le cas des cultures issues des V6,V13 et B8 qui affichent une certaine homogénéité par rapport aux autres.

2.3.2.2.4 Etude des interactions de l'explant , du génotype et de la composition hormonale du milieu sur la caulogenèse

Dans cette partie du travail, nous avons essayé de connaître l'incidence que peut avoir l'interaction génotype * explant sur la caulogenèse .Le tableau 11 où sont présentés les résultats ayant trait à cela, mettent en évidence le degré d'influence, de ce paramètre, sur la néoformation de bourgeons. Ainsi, nous constatons que, certains explants comme les hypocotyles et les racines des génotypes B1,B6 et B8 se montrent incapables de produire des bourgeons, contrairement aux cotylédons qui eux, réagissent très favorablement et ceci quel que soit le génotype testé. Nous constatons aussi, qu'avec certains génotype comme leV12,leV6, leV13,le L26 et le L3, l'ensemble de leurs explants réagissent positivement à ce processus.

En terme de rendement, les meilleurs résultats (0.753) sont obtenus avec les explants d'hypocotyles du génotype V6.

Tableau 11 : Influence de l'interaction génotype * explant sur la caulogenèse. Les résultats sont obtenus après 4 semaines de culture.

Génotype	Explants	Pourcentage d'explant Caulogéne (B)	Nombre moyen de bourgeons / explants (A)	Rendement (AxB)
V12	Hypocotyle Cotylédon Racine	43.84 28.11 5.54	1.30+1.99 0.97+1.92 1.06 +2.01	0.570 0.272 0.05
V13	Hypocotyle Cotylédon Racine	25.45 15.96 5.83	1.75+2.60 0.93+2.18 0.76+2.14	0.446 0.148 0.044
V6	Hypocotyle Cotylédon Racine	23.53 37.33 06.84	3.20+3.71 0.99+2.14 2.13+3.63	0.753 0.369 0.145
B1	Cotylédon	06.73	0.40 + 1.13	0.026
B6	Cotylédon	04.68	1.19+2.31	0.055
B8	Cotylédon	04.75	0.48+0.99	0.022
L26	Hypocotyle Cotylédon Racine	22.38 03.14 04.12	1.34+2.84 0.66+1.87 0.82+2.32	0.30 0.02 0.033
L3	Hypocotyle Cotylédon Racine	16.97 03.82 06.60	2.54+2.80 0.88+2.51 1.21+2.15	0.438 0.030 0.080

2*** = 929.96 DDL = 10 (significatif au seuil =0.001,pour tout milieux confondus )

La comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS met en évidence l'existence de 10 groupes homogènes. Le classement par ordre décroissant des rendements est le suivant.

V6H>V12H>V13H=L3H=V6C>L26H=V12C>V13C>V6R>L3R>V12R=V13R= B6C >L26R= L26C = L3C= B1C=B8C.

La corrélation entre le nombre de bourgeons et le pourcentage caulogène varie d'un génotype à un autre. Elle est très importante pour le génotype L26 (R = 0.96) , L3(R=0.95) et V13( R= 0.85) et moyenne pour les génotypes V12(R=0.66) et V6(R=0.61).

2.3.2.2.4.2- Effet de l'interaction (composition hormonale du milieu* explant)

Dans cette partie, nous avons essayé de vérifier l'existence ou pas de corrélation entre la nature de l'explant et la composition hormonale du milieu et ceci quel que soit le génotype.

En se réfèrant au tableau 12, nous remarquons que l'ensemble des explants réagissent différemment selon les milieux testés. En effet ,seuls les milieux à concentration élevée en BA permettent une induction caulogène quel que soit la nature de l'explant mis en culture. Les milieux en question, sont représentés par le D1B5 , le D1B3 et le D0,1B3. Le reste des milieux permettent cette induction mais seulement avec certains type d'explant, le plus souvent, l'hypocotyle .

Sur ce sujet, la séparation des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS a pu mettre en exergue des différences significatives entre les rendements moyens obtenus sur totalité des milieux testés . Les meilleurs rendements sont enregistrés sur les milieux D1B3 et D0,1B3, . Le classement par ordre décroissant des rendements moyens obtenus pour chaque milieu est le suivant :

D0,1B3H>D0,1B3R>B3D1C=D1B3H=D0,1B3C>D1B3R>D1B5H>D1B5R=A20B0,1H>=D0,5B0,5H=D0,5B0,5R=D1B5C>D0,5B0,1C=A20K11H=D0,5K1H>D0,1B0,5H=D0,5B1C=D0,1B0,5R.

On remarque par ailleurs, qu'il existe, en se servant de certain milieu, comme le D1B3, une corrélation négative (R= - 0.89) entre le pourcentage caulogène et le nombre moyen de bourgeon par explant ; l'usage d'autres milieux comme le D0,1B3 conduit lui, à une corrélation positive (R=0.64).

Tableau 12 : : Aptitude caulogène des explants en fonction de la composition hormonale du milieu ( quelque soit le génotype testé). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition Hormonale Du milieu	Explants	Pourcentage d'explants Caulogéne (B)	Nombre moyen de bourgeon/ explant(A)	Rendement (AxB)
D1B5	Hypocotyle Cotylédon Racine	05.60 04.07 10.57	2.075 + 0.5 0.82 + 0.066 0.69 + 0.176	0.1166 0.0334 0.033
D1B3	Hypocotyle Cotylédon Racine	64.00 41.40 43.40	3.28 + 0.89 5.55 + 3.19 3.37 + 1.32	02.10 02.30 01.80
D0,5 B3	Hypocotyle	4.41	1.06 + 0.15	0.0471
D0,1 B3	Hypocotyle Cotylédon Racine	51.50 42.00 53.60	6.32 + 1.93 4.78 + 1.57 5.31 + 1.87	3.26 2.01 2.25
D0,5 B1	Hypocotyle Cotylédon	02.67 08.85	0.56 + 1.073 0.131 + 1.768	0.015 0.0116
D0,5 B0,5	Racine	03.54	0.953 + 0.05	0.0338
D0,1 B0,5	Hypocotyle Cotylédon Racine	02.82 01.83 04.15	00.41 + 0.176 1.091 + 0.033 0.20 + 0.01	0.0116 00.02 0.0083
D0,5K1	Hypocotyle	01.23	1.26 + 0.649	0.0156
A20B0,1	Hypocotyle	05.56	1.127 + 0.272	0.0627
A20K11	Hypocotyle	02.50	0.656 + 0.81	0.0165

En abordant la question des interactions, nous avons essayé de connaître, cette fois-ci, si les milieux testés interagissent avec les différents génotypes et cela quel que soit la nature de l'explant utilisé .

A la lumière des résultats présentés dans le tableau 13, nous constatons qu'il existe réellement un effet interaction (milieu * génotype) sur la caulogenèse. De manière générale, l'ensemble des génotypes testés expriment des potentialités caulogènes. Néanmoins, ces potentialités paraissent varier en fonction de la composition hormonale du milieu. En effet, certains milieux tels le D0,1B3 , le D1B3 ou le D1B5 possèdent un large pouvoir inducteur , ce qui a permis d'ailleurs, à un grand nombre de génotype de s'exprimer favorablement à la caulogenèse. D'autres milieux comme le D0 ,5B3 ; le A20B0,1 ou le A20K11, permettent à un ou au plus à deux génotypes de s'exprimer.

D'après les résultats de l'analyse statistique, aucune corrélation n'a été décelé entre le pourcentage caulogène et le nombre moyen de bourgeons par explant sur les milieux D0,1B3 (R=0.39) , D1B3(R=0.21). Par contre, elle est très importante sur le milieu D1B5(R = 0.92).

Tableau 13: Aptitude caulogène des huit génotypes de Scorpiurus en fonction de la composition hormonale du milieu (quelque soit l'explant testé). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition

Hormonale du milieu

Génotype

Nombre moyen de bourgeons /explant (A)

Pourcentage d'explant caulogène (B)

Rendement

(AxB)

D0,1B3

V12

V13

L26

11.42+1.04

6.87+1.67

9.31+2.58

10.16+3.17

6.00+2.51

58.66

37.33

54.22

30.66

34.21

6.69

2.56

5.04

3.11

2.05

D1B3

V13

L26

6.52+2.54

7.76+1.68

1.53+0.82

2.4+2.59

2.03+1.88

4.66+1.12

7.64+3.79

48.87

55.00

11.10

15.10

12.00

36.00

58.22

3.18

4.26

0.17

0.36

0.24

1.67

4.45

D0,5 B0,5

7.625+1.65

9.375+1.27

03.50

0.27

0.332

D1 B5

V13

V12

2.75+1.023

6.15+0.966

4.28+1.001

4.5+1.63

11.04+1.026

01.70

05.70

03.10

01.70

10.60

0.04

0.35

0.132

0.076

1.170

D0,5B3

A20 B0,1

D0,5B1

D0,1K0,1

A20K11

V13

L26

8.5+1.274

5.61+0.766

4.5+1.073

10.5+1.768

4.5+1.06

3.25+1.138

2.00+0.5

04.43

08.00

02.60

14.40

00.80

01.77

0.376

0.448

0.117

1.197

0.036

0.057

0.035

2.3.2.2.4.4 Effet de l'interaction (composition hormonale du milieu * explant * génotype).

Après avoir testé l'influence des interactions entre de deux paramètres, nous étions amené, dans un dernier essai, à tester l'effet que peut avoir l'interaction entre trois paramètres (composition hormonale * explant * génotype) sur la caulogenèse. Compte tenu du nombre élevé de répétitions ayant des rendements nuls, dans nos résultats, et qui peuvent poser d'énormes difficultés dans le calcul statistique, nous nous sommes limités donc, dans ce travail, à tester seulement deux milieux de culture D0,1B3 et D1B3 sur l'ensemble des génotypes et des explants.

Le tableau 14 regroupe les observations faites des expériences précédentes sur les milieux D1B3 et D0,1B3, déterminant la production caulogène en fonction à la fois de la composition hormonale du milieu, du génotype et de l'explant.

A travers ces résultats, il apparaît que les meilleurs rendements sont obtenus avec les explant d'hypocotyles du génotype V12(9.78) et sur le milieu D3B0,1. Les plus faibles rendements sont enregistrés respectivement avec les explants de cotylédons du génotype V13 et L26 ainsi que les explants de racines du génotype L3.

Afin de proposer une évaluation quantitative de l'aptitude à la caulogenèse des différents milieux testés, nous étions amené à se servir des méthodes statistiques classiques. Dans ce cadre, nous avons effectué une analyse de variance, à partir du rendement de chaque boite de pétri. Les résultats sont prélevés après 4 semaines de culture. Elle correspond à un model complètement aléatoire à 5 répétitions et à 3 facteurs croisés.

Tableau 14: Aptitudes caulogènes des explants des huit génotypes cultivés sur milieux de cultures D0,1 B3 (3 mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4D) et D1 B3 ( 3 mg/l de BA et 1 mg/l de 2,4-D). Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants .

Composition Hormonale du milieu	Génotype	Explants	Nombre moyen de bourgeons /explant (A)	Pourcentage caulogène (B)	Rendement (AxB)
D1B3	L26	Hypocotyle	5.81+0.54	38.72	2.25
		Cotylédon	4.10+0.047	33.17	1.36
		Racine	4.06+0.80	61.82	2.51
	L3	Hypocotyle	6.73+1.62	64.48	4.34
		Cotylédon	9.27+1.21	38.29	3.55
		Racine	6.93+2.82	58.87	4.08
	V13	Hypocotyle	6.32+8.04	75.15	4.75
		Cotylédon	6.47+1.04	24.88	1.61
		Racine	6.77+1.15	48.39	2.87
	V6	Hypocotyle	7.41+8.17	73.27	5.43
		Cotylédon	6.70+0.98	37.91	2.54
		Racine	9.18+2.11	53.92	4.95
	B 1	Cotylédon	7.20+5.46	66.80	4.81
	B6	Cotylédon	4.6+1.29	36.30	1.67
	B8	Cotylédon	6.10+2.06	46.22	2.82
D0,1 B3	V12	Hypocotyle	12.79+3.62	76.46	9.78
		Cotylédon	11.40+0.56	44.73	5.10
		Racine	10.06+0.73	55.46	5.58
	V13	Hypocotyle	8.25+0.94	27.15	2.24
		Cotylédon	5.44+0.20	24.08	1.31
		Racine	6.92+3.57	73.69	5.10
	V6	Hypocotyle	10.36+3.20	67.27	6.97
		Cotylédon	6.84+2.35	69.15	4.73
		Racine	10.74+2.92	66.85	7.18
	L26	Hypocotyle	11.88+1.68	31.22	3.71
		Cotylédon	7.85+0.75	30.57	2.40
		Racine	10.74+1.65	33.33	3.58
	L3	Hypocotyle	7.26+2.26	46.14	3.35
		Cotylédon	6.73+1.98	38.18	2.57
		Racine	4.00+0.85	33.75	1.35

Les résultats de l'analyse de variance sont présentés dans le tableau 15. Ils montrent sans ambages l'existence d'une différence qui peut être, dans certains cas, très hautement significative comme, c'est le cas avec le facteur génotype, de l'interaction (composition hormonale * génotype) ou (génotype * explant ), dans d'autres, hautement significative comme pour le facteur composition hormonale et l'interaction (composition hormonale * génotype * explant) ou simplement significative comme c'est le cas avec l'interaction (composition hormonale * explant). Cependant certains facteurs comme l'explant n'enregistre aucune différence.

Source de variation

Somme des carrés

D.D.L

Carré moyen

F. calculé

Var . totale

Var. Milieux

Var. Génotype

Var. Explant

Var. Milieux X Génotype

Var. Milieux X Explant

Var. Génotype X Explant

VAR.Milieux X Génotype X Explant

Var . Résiduelle

1915.78

24.67

637.49

11.31

411.47

25.75

171.12

98.16

535.81

239

192

8.02

24.67

91.07

5.66

58.78

12.88

12.22

7.01

2.79

8.84**

32.63***

2.03 NS

21.06***

4.61*

4.38***

2.51**

NS : Non significatif , * : Significatif au seuil =0.05 , ** : Significatif au seuil =0.01

Toujours dans l'espoir d'améliorer davantage les rendements de nos cultures en terme de caulogenèse, nous avons, dans cette partie, essayé de tester l'influence de la source carbonée. Pour conduire cette expérience nous avons retenu un seul génotype le V12 , compte tenu de ses bonnes performances préalablement manifestées, et pour les même raisons le milieu D0,1 B3 est sélectionné.

Quatre sucres comprenant deux monosaccharides (glucose et fructose) et deux disaccharides (saccharose et maltose) ont été testés. Les résultats observées sont reportées sur le tableau 16 . Comme on peut le constater sur le tableau 16, l'ensemble des sucres testés, induisent une caulogenèse mais à des degrés différents. Le maltose et le saccharose se révèlent très favorable à la néoformation de bourgeons face au fructose et le glucose. Les rendements obtenus avec le maltose et le saccharose sont nettement supérieur au rendement moyen relative à l'essai (3.88)

Tableau 16: Effet de la source carbonée sur la caulogenèse. Les expériences sont conduites avec les explants du génotype V12 ensemencées sur milieu D0,1 B3 (3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture. A et B : Désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

A travers ces premiers résultats nous pouvons dire, avec prudence, que les disaccharides paraissent plus favorables à la caulogenèse que les monosaccharides. La comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS à 5% a permis de classer les sucres par ordre décroissant comme suite:

L'entrée en production, des bourgeons néoformés, par les explants semble gagner de précocité lorsque le milieu contient du maltose ou du saccharose. Les bourgeons commencent à apparaître souvent vers le 15 ^ème qui suit l'ensemencement. En présence de glucose ou de fructose, la néoformation des bourgeons ne démarre qu'à partir du 20 ^ème jours.

Planche 8: Bourgeons néoformés , induit à partir d'explants hypocotyles, sur milieux D0,1B3 ( milieu pourvu de 3mg/l de BA et 0.1 mg/l de 2,4-D) contenant 30 g/l du maltose ( A) et du glucose (B).

Les rendements les plus élevés sont obtenus avec les explants d'hypocotyles cultivés en présence de maltose ou du saccharose. Il est à noter par ailleurs, que les explants de cotylédons paraissent incapables de produire des bourgeons sur milieu contenant du glucose (tableau 17).

Tableau 17 : Influence de la source carbonée, sur l'aptitude caulogène des explants du génotype V12. L'expérience est conduite sur milieu D0,1 B3 (3mg/l de BA et 0,1 mg/l de 2,4-D).Les résultats sont prélevés après 4 semaines de culture. % EC : Pourcentage d'explant caulogène, NMB/E : Nombre moyen de bourgeons par explant et R : Rendement.

Nature de l'explant
Explants	Hypocotyle			Cotylédons			Racine
	% EC	NMB/E	R	%EC	NMB/E	R	%EC	NMB/E	R
Maltose Saccharose Glucose Fructose	79.25 76.52 32.20 22.42	14.46+0.86 12.78+1.32 0.59+ 0.80 3.88+2.70	11.46 9.78 0.19 0.87	61.01 44.73 _ 2.65	8.67+1.76 11.40+1.11 _ 2.00+0.49	5.29 5.10 _ 0.53	62.09 55.46 11.82 32.24	11.16+1.70 10.06+0.92 0.93+0.55 2.14+0.84	6.93 5.58 0.11 0.69

En guise de conclusion, nous pouvons dire que cette partie de notre travail nous a permis de retenir ce qui suit :

Généralement sur les milieux ayant montré des pouvoirs embryogènes, l'embryogenèse somatique peut être induite soit directement sur l'explant ensemencé soit indirectement (en passant par une phase de callogenèse).

Dans le cas d'une embryogenèse somatique directe (qui se reproduit rarement), les embryons apparaissent sur la surface des explants de racines. Le processus commence tout d'abord par l'apparition de petits gonflements, au niveau de l'épiderme des explants, qui évoluent en petites structures de forme sphérique et à aspect lisse verdâtre. Ces structures traversent, par la suite, les mêmes stades de développement morphologique que traversent habituellement les embryons zygotiques (Planche9: E).

.Dans le cas d'une embryogenèse somatique indirecte, c'est la callogenèse qui se déclenche la première, après 5 jours de culture. Après le 8 ème jour, le cal se développe davantage et présente un aspect hétérogène. A ce moment, on distingue des régions très -chlorophylliennes dispersées sur la surface du cal et à partir duquel se développent de petits corps de forme nodulaire ou globulaire et à aspect lisse verdâtre. Ces corps représentent en fait, des embryons somatiques au stade globulaire (Planche 9:A) et qui sont appelés ,par la suite, à évoluer à d'autres stades : cordiforme (Planche 9:B), torpille (Planche9:C) et cotylédonaire (Planche9:D).

Les embryons somatiques produits présentent souvent des malformations morphologiques (embryons monocotylé, tricotylé, en forme de bouteille.....etc.) (Planche11: A,B,C,D). On enregistre cependant, un faible taux d'embryons somatiques à morphologie normale.

De la même manière qu'en caulogenèse, nous avons essayé de voir, dans cette partie de travail, s'il existe ou non un effet milieu en particulier sa composition hormonale, sur l'induction de l `embryogenèse somatique. A cet effet, nous nous sommes servis de 8 génotypes de Scorpiurus et de divers explants pour conduire cette expérience. Les milieux de culture testés sont pourvus d'un cocktail hormonal composé de deux types de régulateurs de croissance à savoir : les auxines et les cytokinines. Les premiers sont représentés par l'AIA, l'ANA et le 2,4-D et les seconds par la BA et la Kinétine. Ces régulateurs sont apportés aux milieux soit séparément, soit en mélange.

La nature des auxines ou des cytokinines influence considérablement la production d'embryons somatiques quel que soit le génotype ou l'explant utilisé.

L'induction de l'embryogenèse somatique semble être nulle lorsqu'on emploi des milieux à auxines ou à cytokinines seuls et à différentes doses. Ceci est valable avec l'ensemble des concentrations employées mais aussi sur l'ensemble des explants et génotypes testés. Seuls les milieux pourvus d'un mélange hormonal (auxine*cytokinine) semble amorcer cette induction. Ainsi, l'apport du 2,4-D et de l'AIA en mélange avec des cytokinines, notamment la BA et la Kinétine, dans le milieu d'induction permet l'obtention d'embryons somatiques. Comme on peut le constater, les résultats du tableau 19, montrent clairement l'effet de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique et cela sans tenir compte du facteur génotype ou explant utilisé.

Tableau 19 : Effet de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique. Les résultats sont obtenus après 4 semaines de cultures (quel que soit le génotype et explant testé) le pourcentage d'embryons normaux est calculé à partir des embryons qui se différencient sur milieu d'induction.. A et B désignent les groupes homogènes séparés par le TEST de NEWMAN et KEULS au seuil 5%

Composition Hormonale

Du milieu

Nombre moyen de structure embryogène (A)

Pourcentage d'explants embryogène(B)

Rendement

( A x B )

Pourcentage d'embryons normaux

D3B0,1

D0,1B0,5

A20 B1

A20 K0.1

7.79 + 4.37

4.47 + 3.23

4.78 + 3.54

5.56 + 3.60

31.19

22.14

32.42

.26.07

2.67 A

1.15 B

1.69 B

1.59 B

53.00

34.00

76.00

84.00

Planche9 : Formation et développement des embryons somatiques: Embryons somatiques obtenu, directement sur explant de racine (A), cal embryogène avec embryons somatiques au stade globulaire(B); au stade cordiforme (C); au stade torpille (D) et au stade cotylédonnaire (E).

Les rendements rapportés dans le tableau 19, montrent que les milieux à 2,4-D x BA sont plus favorables que ceux à AIA x BA ou à Kin x AIA. Malgré les différences apparentes observées entre les rendements obtenus en milieu D0,1B0,5 ; B1A20 ou A20K0.1, l'analyse statistique n'en révèle aucune. Néanmoins, il est clair que le milieu D3B0,1 est plus favorable à la production de structures embryogènes que le reste.

On relève par ailleurs ,en partant des résultats du tableau 19, que la corrélation entre le pourcentage embryogène et le nombre moyen d'embryons par explant est très élevée, sur les quatre milieux testés. Toutefois, la bonne corrélation est enregistrée sur le milieu B0,5D0,1 (R=0.98) ,suivie de B1A20 et de A20K0.1 (R=0.95) et enfin de B0.1D3 (0.81). On note aussi que les écart- types augmentent, quand la moyenne des structures embryogènes par explant augmente. Ceci est dû à la production très irrégulière d'embryons somatique par explant.

La structure morphologique des embryons produits semble elle aussi être affectée par la nature de l'auxine utilisée. En effet, comparativement aux milieux à 2,4-D, les milieux à ANA paraissent favoriser mieux le développement d'embryons normaux. Ainsi, nous constatons que le taux d'embryons somatiques à morphologie normale est plus élevé sur milieu à AIA qu'à 2,4-D. Les principales malformations qui caractérisent ces embryons sont : la monocotylédonie, la tricotylédonie ou l'obtention de structure complètement désorganisée ou en forme de bouteille.

Par ailleurs, il n'est pas inutile de rappeler aussi, que certains milieux, notamment ceux pourvus de 2,4-D x BA, peuvent provoquer à la fois et l'induction de l'embryogenèse et le développement des embryons. Par contre, des milieux renfermant de l'ANA, nécessitent des transferts d'embryons sur milieu dépourvu de régulateurs de croissance pour permettre leur développement.

Pour évaluer les potentialités embryogènes des explants en fonction de leur nature, nous avons mené cette expérimentation avec les explants de cotylédons , d'hypocotyles et de racines des huit génotypes. Les milieux d'induction retenus sont le D3B0,1 ; le D0,1B0,5 ; le A20K0.1 et le A20B1 .

Les résultats de cette expérience (tableau 20),nous ont permis de conclure que les hypocotyles suivis des cotylédons possèdent les meilleures aptitudes à l'embryogenèse somatique. En effet le classement du rendement des explants par le test de NEWMAN

Planche 10 (suite): Principales anomalies morphologiques des embryons somatique .(A) embryon somatique monocotylé. (B) embryon somatique en forme de font de bouteille. (C) embryon somatiques présentant des fasciations au niveau des hypocotyles .(D) amas d'embryons somatiques complètement désorganisés.

& KEULS met en évidence l'existence de trois groupes homogènes: le premier groupe comprend les hypocotyles, le second les cotylédons et le troisième les racines.

On note par ailleurs que le pourcentage embryogène est proportionnel au nombre moyen d'embryon par explant (R=0.86). Quant, aux écart - types du nombre moyen d'embryons produits par explants et ceci quel que soit le génotype ou le milieu utilisé sont importants.

Tableau 20: Variation de l'aptitude embryogènes des explants ( quel que soit le milieu ou le génotype testé). Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture . A et B : désignent les groupes homogènes séparés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5% :

2.4.2.3-Effet du génotype

Lors de cette essai, nous avons testé l'aptitude embryogène des huit génotypes dont nous disposions, sur les milieux d'induction D3B0,1 ; D0,1B0,5; A20K0.1 et A20B1 (milieux supposés être à bon pouvoir embryogène) . Les résultats de cette essai devraient nous conduire à choisir le génotype le plus performant en terme de potentialités embryogènes.

En se referant au tableau 21 où sont présentés les résultats, nous constatons qu'il existe, d'après l'analyse statistique (test de NEWMAN et KEULS), quatre (4) groupes homogènes. Les génotypes sont classés selon leurs aptitudes à l'embryogenèse somatique. Le groupe A où se trouve le V12, renferme les génotypes à fort potentiel embryogène. Le groupe B, où figure le V6 et le V13, regroupe les génotypes aux potentialités embryogènes moyennes. Le groupe C ,représenté par le B1, B8 et B6, se caractérise par un faible potentiel embryogène. Le groupe D, renfermant le L26 et le L3, se montre quasiment nul à l'égard de l'embryogenèse.

Dans ces résultats (du tableau 21), nous remarquons que la différence en terme de rendement entre les différents génotypes est beaucoup plus marquée par le nombre moyen d'embryon par explant (qui oscille entre 12.23 et 0.77) que par le pourcentage d'explant embryogène.

Tableau 21: Aptitude des huit génotypes de Scorpiurus à l'embryogenèse somatique (quelque soit le milieu ou l'explant utilisé). Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture . A, B, C et D désignent les groupes homogènes classés par le test de NEWMAN et KEULS au seuil 5%.

Génotype

Nombre moyen d'embryons par explants

(A)

Pourcentage d'explant embryogène

(B)

Rendement

(AxB)

V12

V13

L26

9.63 + 5.50

12.23 + 4.92

9.49 + 4.76

1.10 + 0.77

0.68 + 1.95

0.77 + 2.26

27.72

33.68

31.08

30.00

39.70

24.67

2.67 B

4.12 A

2.95 B

0.33 C

0.27 C

0.19 C

0 D

2.4.2.4 - Effet de l'interaction des explant, des génotypes et de la composition hormonale du milieu sur l'embryogenèse somatique

De la même manière qu'en caulogenèse, le but visé par cet essai est de connaître l'incidence de l'interaction génotype *explant sur l''embryogenèse somatique . L'expérience a été conduite sur les milieux d'induction (MS): B0,1D3; A20K0.1; A20B1; D0,1B0,5

Une fois de plus l'effet de l'origine génétique des explants se prononce sur l'expression morphogène des explants .En effet les résultats obtenus (tableau 22) montrent que les explants d'hypocotyle et de racine provenant des génotypes B1, B6 et B8 , sont incapables de produire des embryons somatiques. On remarque par contre, que la totalité des explants issus des génotypes V12 ,V6 et V13 sont embryogènes.

Le classement par ordre décroissant du rendement moyen par le test de NEWMAN & KEULS est le suivant: HV12 > HV6 > CV12 > HV13 > CV13>RV12 > RV13>CV6>RV6 >CB8 >CB6 > CB1.

Tableau 22 : effet de l'interaction (génotype*explant) sur l'embryogenèse somatique. Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture et ceci quel que soit le milieu testé. NMES/E : Nombre moyen d'embryons somatiques par explant PE : Pourcentage embryogène et R : Rendement.

Nature de l'explant
Génotype	Hypocotyle			Cotylédon			Racine
	NMES/E	PE	R	NMES/E	PE	R	NMES/E	PE	R
V12 V6 V13 B6 B8 B1	15.30+6.41 14.47+5.19 9.59 +5.87 _ _ _	41.98 28.95 36.07 _ _ _	6.31 4.18 3.46 _ _ _	11.42+5.14 7.72+4.170 10.32+6.19 2.32+3.99 3.31+ 1.35 2.03+3.43	30.73 26.16 29.55 34.91 29.90 28.57	3.51 2.02 3.05 0.81 0.99 0.087	9.98+3.34 6.71+5.12 8.56+3.10 _ _ _	25.25 26.97 27.33 _ _ _	2.52 1.81 0.58 _ _ _

2** = 51.87; DDL =10 (significative au seuil = 0.01)

Dans cette partie du travail, nous avons essayé de voir s'il existe ou pas une interaction (explant * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique. Cet essai a été conduit avec les génotypes ayant montré de bonnes aptitudes embryogènes.

L'effet de l'interaction (explant * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique, peut être mis en évidence, d'après les résultats du tableau 23. On remarque que les aptitudes embryogènes changent d'un type d'explant à un autre et pour un même explant, elles varient d'un milieu à un autre. Comme on peut le constater, ce sont les cotylédons ensemencés sur le milieu D3B0,1 qui donnent les meilleurs rendements. La comparaison des moyennes réalisée par le test de NEWMAN & KEULS confirme cela.

Tableau 23: Effet de l'interaction (explant * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique et cela quel que soit le génotype testé. Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture.

NMES/E : Nombre moyen d'embryons somatiques par explant ; PE : Pourcentage embryogène et R : Rendement .

Composition hormonale du milieu

Explants

D3B0,1

A20K0.1

A20B1

D0.1B0.5

NMES/E

NMES/E

NMES/E

Hypocotyle

Cotylédon

Racine

6.75+ 3.44

11.75 +5.9

4.89+ 3.40

44.88

30.80

27.60

3.03

3.62

1.35

7.5 +3.29

4.17+4.30

5.02 + 3.2

30.40

30.21

24.10

2.28

1.26

1.21

6.98 +5.5

3.87 +2.2

3.49 +1.7

37.82

28.68

31.51

2.64

1.11

1.10

5.01+3.47

4.95 +3.8

3.43 +2.3

26.94

26.46

23.03

1.35

1.31

0.79

Le classement par ordre décroissant du rendement moyen des explants mis en culture sur les milieux d'induction est le suivant : D3B0,1(C) > D3B0,1(H) = A20B1(H) >A20K0.1(H)=D0,1B0,5(H) = A20K0.1(R)= D0,1B0,5(C) =D3B0,1(R) = A20K0.1(C) = A20B1(C) = A20B1(R) >D0,1B0,5(R).

On remarque aussi, dans les résultats du tableau 23, que le nombre moyen d'embryons produits par les explants d'hypocotyles et de racines est sensiblement identique, quel que soit le milieu. Par contre, avec les explants de cotylédons, ce nombre moyen est nettement supérieur avec le milieu D3B0,1 qu'avec le reste.

2.4.2.4.3- Effet de l'interaction (génotype * composition hormonale)

Comme pour les autres interaction , nous essayons, lors de cet essai , de voir l'effet (génotype * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique. Les expériences sont conduites uniquement avec les meilleurs explants qui sont les hypocotyles.

Les résultats de cet essai (tableau 24) mettent en évidence, l'existence réelle d'un effet interaction (génotype * composition hormonale). Ainsi , nous remarquons que les réactions, à l'égard de l'embryogenèse, varient d'un génotype à un autre et pour un même génotype, elles varient d'un milieu à un autre.

Tableau 24 : Effet de l'interaction (génotype * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique. Les expériences sont conduites avec les explants d'hypocotyles. Les résultats sont obtenus après 4 semaines de la mise en culture des explants . NMES/E : Nombre moyen d'embryons somatiques par explant; PE : Pourcentage embryogène et R : Rendement

Composition hormonale du milieu

Génotype

D3B0,1

D0,1B0,5

A20K0.1

A20B1

NMES/E

V12

V13

B8

15.18+5.31

11.43 + 5.58

9.94 + 4.67

2.70 + 4.00

4.41 + 1.58

3.09 + 0.00

42.02

33.15

26.65

28.15

29.93

34.95

6.38

3.79

2.65

0.77

1.32

1.08

10.71+ 4.96

9.06 + 3.03

7.02 + 5.69

22.31

20.97

2.39

1.90

2.62

11.78+ 5.3

11.41 + 5.7

10.21 + 4.6

32.17

27.78

24.87

3.79

3.17

2.54

11.25 +4.61

6.64 + 4.72

0.78 +6.02

34.66

16.88

36.92

3.90

1.82

3.98

De manière générale, nous constatons que les génotypes appartenant à l'espèce Vermiculatus paraissent plus souples ou plus disposer à produire des embryons somatiques et sur une large gamme de milieu, que les autres espèces. On peut citer à titre d'exemple un ensemble de milieu comme le D3B0,1 , le D0,1B0,5 ; le A20K0.1 et le A20B1 où les espèces Vermiculatus., se sont favorablement exprimées. Ce n'etait pas le cas avec des génotypes comme le B1 , le B6 ou le B8 où le nombre de milieu ayant permis leur expression était limité au D3B0,1 seulement.

S'agissant des corrélations existante entre le pourcentage d'explant embryogène et le nombre moyen d'embryons par explant, elles peuvent être, avec certains génotypes, très positives comme c'est le cas du V6 (R=0.96) ou négative comme le V13 (R= - 0.51).

2.4.2.4.4- Effet de l'interaction (composition hormonale * génotype * de l'explant )

Nous avons décidé, de finir cette série d'expérience en essayant de voir, par le biais d'une analyse de variance, l'influence de l'interaction des trois principaux paramètres, préalablement testés à savoir : l'explant, le génotype et la composition hormonale du milieu, sur l'embryogenèse somatique.

Les résultats du tableau 25 indiquent que le nombre moyen d'embryons par explant et le pourcentage d'explant embryogène, obtenus, en particulier, avec les hypocotyles et les cotylédons des génotypes, version Vermiculatus, et sur milieux D3B0,1 et A20K0.1, sont les meilleurs. Ainsi, les bonnes performances, vis à vis de l'embryogenèse, manifestées d'une part par les hypocotyles et à degré moindre par les cotylédons et d'autres part par les génotypes affiliés à l'espèce Vermiculatus, se confirment une fois de plus.

Tableau 25: Effet de l'interaction (explant * génotype * composition hormonale du milieu) sur l'embryogenèse somatique. Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture.

Composition hormonale du milieu	Génotype	Explants	Nombre moyen d'embryons /explant (A)	Pourcentage d'explant embryogène (B)	Rendement (AxB)
D3B0.1	V12	Hypocotyle	17.67 + 3.54	61.33	10.67
		Cotylédon	12.77 + 7.93	36.02	4.60
		Racine	15.12 + 4.84	25.66	3.88
	V13	Hypocotyle	6.67 + 6.16	17.84	1.19
		Cotylédon	15.82 + 4.49	27.11	4.29
		Racine	7.34 + 4.27	23.70	1.74
	V6	Hypocotyle	16.14 + 5.9	34.57	5.58
		Cotylédon	11.26+ 5.5	29.57	3.35
		Racine	6.89 + 6.56	35.55	2.45
	B 1	Cotylédon	8.11 + 7.48	28.60	2.32
	B6	Cotylédon	9.28 + 8.69	34.80	3.23
	B8	Cotylédon	13.23 +2.95	29.93	3.96
A20K0.1	V12	Hypocotyle	18.48 +5.51	33.06	6.11
		Cotylédon	9.59 + 6.85	35.97	3.45
		Racine	7.26 +4.5	25.06	1.82
	V13	Hypocotyle	11.47 + 5.23	28.68	3.29
		Cotylédon	7.07 + 6.49	23.90	1.69
		Racine	12.08 + 2.29	21.93	2.65
	V6	Hypocotyle	15.04 + 4.5	28.59	4.30
		Cotylédon	8.38 + 6.74	28.75	241
		Racine	10.80 + 7.11	26.01	2.81

Tableau 25: Effet de l'interaction (explant * génotype * composition hormonale du milieu) sur l'embryogenèse somatique. Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture.

Composition hormonale du milieu	Génotype	Explants	Nombre moyen d'embryon par explant (A)	Pourcentage d'explant embryogène (B)	Rendement (AxB)
D0,1B0,5	V12	Hypocotyle	12.45 +8.41	23.69	2.95
		Cotylédon	16.58 + 3.00	14.17	2.35
		Racine	9.50 + 2.51	19.68	1.87
	V13	Hypocotyle	3.97 + 2.26	31.13	2.17
		Cotylédon	10.09 + 5.23	35.67	3.60
		Racine	7.01 + 4.2	29.95	2.10
	V6	Hypocotyle	13.65 + 3.91	33.77	4.61
		Cotylédon	9.43 + 2.30	21.31	2.01
		Racine	4.10 + 3.89	19.02	0.78
A20B 1	V12	Hypocotyle	12.60 +8.08	43.80	5.52
		Cotylédon	13.12 + 2.61	27.82	3.65
		Racine	8.04 + 1.4	31.34	2.52
	V13	Hypocotyle	16.23 + 9.66	39.86	6.47
		Cotylédon	8.30 + 5.38	31.44	2.61
		Racine	7.81 + 2.12	36.74	2.87
	V6	Hypocotyle	13.04 + 7.76	29.52	3.85
		Cotylédon	1.82 + 1.16	21.42	0.39
		Racine	5.07 + 4.05	24.06	1.22

L'analyse de variance est réalisée à partir du rendement obtenu par boite de pétri. Elle correspond à un modèle complètement aléatoire à 5 répétitions et à 3 facteurs croisés :

Les résultats de cette analyse (tableau 26) montrent qu'il existe , dans certains cas, des différences très hautement significatives comme, c'est le cas avec les facteurs : explant ; génotype ; composition hormonale du milieu ; de l'interaction (composition hormonale * explant) ; (génotype * explant) ou (composition hormonale * génotype), dans d'autres, elles sont hautement significatives comme avec l'interaction (milieu * génotype * explant).

De cette analyse de variance , il y a lieu de retenir surtout que le génotype constitue le facteur essentiel, autrement dit le facteur qui influence le plus le processus de l'embryogenèse somatique. En effet, cela se confirment par le fait qu'environ 34.55 % de la variation totale est liée au facteur génotypique.

2.4.2.5-Influence de la source carbonée.

Compte tenu de l'importance capitale que revêt la source carbonée dans les recherches entreprises sur l'embryogenèse somatique, nous avons décidé de tester l'effet de la nature des sucres sur ce processus morphogénétique. Les expériences sont conduites avec des explants d'hypocotyles, de cotylédons et de racines, du génotype V12. Le milieu de culture choisi contient 3 mg/l de 2,4-D et 0,1 mg/l de BA. ( composition hormonale ayant conduit à l'obtention de meilleures réponses à l'embryogenèse). La gamme des sucres utilisés est la même que celle préalablement testée en caulogenèse.

De façon générale, l'embryogenèse s'est manifestée sur l'ensemble des sucres testés. Néanmoins, les sucres disaccharides semblent plus stimulant à ce processus que les monosaccharides. Des résultats, du même ordre, ont été signalé au cours de la caulogenèse. Cela confirme, une fois de plus, l'efficacité des sucres disaccharides, en l'occurrence le maltose et le saccharose, par rapport aux monosaccharides.

Source de variation

D.D.L

Somme des carrés

Carré moyen

F. calculé

Var . totale

Var. Milieux

Var. Génotype

Var. Explant

Var. Milieux * Génotype

Var. Milieux * Explant

Var. Génotype * Explant

VAR.Milieux * Génotype * Explant

Var . Résiduelle

359

288

2347.22

111.67

871.00

89.20

115.83

69.66

173.16

146.26

770.45

6.54

37.22

174.20

44.60

7.72

11.61

17.32

4.88

2.68

13.91***

65.12***

16.67***

2.89***

4.34***

6.47***

1.82**

Tableau 27 : Influence de la source carbonée, sur l'embryogenèse somatique des explants du génotypeV12.L'expérience est conduite sur milieu contenant 3 mg/l du 2,4-D et 0,1 de BA. Les résultats sont prélevés après 4 semaines de culture.

% EC : Pourcentage d'explant caulogène, NMB/E : Nombre moyen de bourgeons par explant et R : Rendement. A,B,C,et D:Désignent les groupes homogènes séparé par le test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5% .

L'analyse statistique confirme la supériorité des disaccharides, en terme d'efficacité, comparativement aux monosaccharides. Les rendements obtenus en présence du maltose sont statistiquement supérieur à la moyenne générale du rendement relative à l'essai qu'est de l'ordre de 3.89. Les rendements les plus faibles sont obtenus sur les milieux à glucose. La comparaison des rendements moyens de l'essai par le test de NEWMAN & KEULS a permis de classer les sucres par ordre décroissant comme suit :

Les explants eux aussi réagissent différemment selon la nature des sucres employés. Ainsi, nous constatons que les explants d'hypocotyles s'expriment mieux en présence de saccharose qu'en maltose et c'est le contraire qui se reproduit, avec les explants de cotylédons et de racines (tableau 28).

Tableau 28 : Influence de la source carbonée, sur l'aptitude embryogène des explants du génotype V12. L'expérience est conduite sur milieu D3B0,1. Les résultats sont prélevés après 4 semaines de cultures.

NMES/E : Nombre moyen d'embryons somatiques par explant, % EE : Pourcentage embryogène et R : Rendement

SUCRE	Hypocotyle			Cotylédon			Racine
SUCRE	NMES/E	%EE	R	NMES/E	%EE	R	NMES/E	%EE	R
Maltose	25.40+2.52	35.99	9.141	19.26+4.65	33.33	6.161	13.23+1.58	33.33	4.40
Saccharose	17.67+3.54	61.33	10.83	12.77+7.92	29.33	3.74	15.12+4.84	25.33	3.82
Glucose	5.12+4.66	18.66	0.955	4.90+3.66	18.59	0.910	1.76+0.34	30.66	0.54
Fructose	8.8+2.54	30.66	2.698	8.24+2.39	33.33	2.746	3.50 +1.45	22.66	0.793

2.4.3- Germination des embryons somatiques

Les embryons somatiques ayant atteint le stade cotylédonaire sont automatiquement détachés du cal et transférés sur trois milieux (MS) « dits de germination » , dont la composition hormonale est la suivante :

Milieu de Germination	Pourcentage d'embryons somatique
	Ne développant que de racines	Ne développant que de tiges	Développement de plantes entières	M0 B0,1G0,1 A20K2G0,1
100 35 100	0 20 0	0 40 0	0 5 0

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE

En terme de ce travail , on peut dire que la régénération chez le Scorpiurus via l'organogenèse et l'embryogenèse somatique est donc possible. Mais il reste de nombreux problèmes à résoudre, pour que la technique soit exploitable en sélection végétale.

Concernant l'embryogenèse somatique, le rendement et la qualité des embryons somatique doivent être améliorée d'avantage et devaient conduire à l'amélioration de la germination..

Une autre voie de recherche très prometteuse devra se porter sur la maîtrise de l'enracinement des bourgeons et la résolution du problème d'endurcissement ou la phase d'acclimatation qui reste une des étapes les plus réfractaires à réalisée.

En conclusion , cette étude nous a permis d'atteindre l'objectif que nous étions fixé au départ et elle représente une première contribution de notre part, pour la régénération de plantes entières chez le Scorpiurus. Ainsi les résultats auxquels nous nous sommes parvenus sont plus qu'encourageant puisque jusqu'alors aucune référence bibliographique n'a rapporté des résultats relatifs à l'obtention de plantes entières via l'embryogenèse somatique ou l'organogenèse chez le Scorpiurus.. Ce travail mérite d'être poursuivie pour mieux maîtriser la régénération chez le Scorpiurus

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Régénération via l'organogénèse ou l'embryogénèse somatique chez le Scorpiurus

Résumé du travail

Liste des tableaux

Liste des Abréviations

Liste des planches

3 APTITUDE A L'ORGANOGENESE

3.1Aptitude à la rhizogenèse

3.1.3 Influence du génotype

3.2 Aptitude à la caulogenèse

4.2.4.3 Aptitude embryogène des différents génotypes en fonction de la composition hormonale

CHAPITRE I GENERALITE SUR LES CULTURES IN-VITRO

1 - APERCU HISTORIQUE SUR LES TECHNIQUES DE CULTURES

IN-VITRO.

2- La MICROPROPAGATION

3 LES LEGUMINEUSES ET LA MICROPROPAGATION

3-1 Intérêt de la famille des Légumineuses

3.2-Micropropagation des Légumineuses in-vitro

4 -OBJECTIF DU TRAVAIL

CHAPITRE II MATERIELS et METHODES

· Scorpiurus vermiculatus est la forme sauvage la plus stable du genre Scorpiurus (2n=14);

· Scorpiurus muricatus :Cette espèce regroupe des plantes annuelles (2n=28), au sein du quel on distingue:

3-TECHNIQUE DE CULTURE IN-VITRO

CHAPITRE III RESULTATS

ESSAIS D'OPTIMISATION

2.3 Aptitude à l'organogenèse

2.3.1-Aptitude à la rhizogenèse

Pourcentage d'explant rhizogène

Nombre moyen de racines / explant

Longueur des racines (cm)

2.3.1.3 Influence du génotype

Génotype

Pourcentage d'explant rhizogène

Nombre moyen de racines / explant

Longueur des racines (cm)

V12 V13 L3

V6

13.10

1.0 - 8.0

2.3.2 Aptitude à la caulogenèse

2.4.2.3-Effet du génotype

Cotylédon

2** = 51.87; DDL =10 (significative au seuil = 0.01)

Tableau 23: Effet de l'interaction (explant * composition hormonale) sur l'embryogenèse somatique et cela quel que soit le génotype testé. Les résultats sont récoltés après 4 semaines de culture.

NMES/E : Nombre moyen d'embryons somatiques par explant ; PE : Pourcentage embryogène et R : Rendement .

D3B0,1

NMES/E

2.4.2.4.3- Effet de l'interaction (génotype * composition hormonale)

D3B0,1

B8

2.4.2.5-Influence de la source carbonée.

2.4.3- Germination des embryons somatiques

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

V12
V13
L3