Memoire Online - Contribution à l'étude de la production de l'IFNγ et des immunoglobulines circulantes (IgM, IgG et IgA) chez des patients atteints de la maladie de Behçet

Chapitre I : Introduction..........................................................................................2

Chapitre II : Généralités.....................................................................3

II.1. La maladie de Behçet...................................................................3

II.1.2 Prévalence...............................................................................4

II.1.3 Etiopathogénie........................................................................ 4

II.1.4 Mécanismes physiopathologiques de la maladie de Behçet.....................5

II.1.5 Thérapie....................................................................................7

II.2. Les cytokines...............................................................................9

II.2.1. Les interférons...........................................................................9

II.2.2. L'interféron gamma (IFNã)............................................................9

II.3. Les immunoglobulines ..................................................................13

Chapitre III : Matériels et méthodes........................................................15

III.1. Matériel.....................................................................................15

III.2. Méthodes.................................................................................15

III.2.1. Etude de la production de l'IFNã in vivo...........................................15

III.2.1.1. Dosage de l'IFNã par la technique Elisa sandwich..............................15

III.2.2. Etude de la production des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA)...16

III.2.2.1.Dosage des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA) par Immunonéphélémétrie Laser..................................................................16

III.3. Etude statistique...........................................................................18

Chapitre IV : Résultats et discussions.......................................................19

Chapitre V : Discussion générale............................................................21

Chapitre VI : Conclusion.....................................................................22

Chapitre VII : Bibliographie..................................................................23

I. Introduction:

Le syndrome de Behçet est une pathologie endémique. C'est une vascularité multisystémique caractérisée par des désordres immunitaire et inflammatoire. Parmi les manifestations cliniques les plus fréquents de cette maladie : l'uvéite et l'aphtose bipolaire.

Son étiologie reste inconnue car il n'y a pas de signes spécifiques qui permettent de la reconnaître. Plusieurs éléments interviennent dans l'apparition de la maladie de Behçet (MB), dont une susceptibilité génétique :

association génétique entre la maladie de Behçet et HLA-B51, gène MICA (major histocompatibility complex class I chain related gene) et gène du TNFá ,des facteurs environnementaux (infections virales et/ou bactérienne), des anomalies de la réponse inflammatoire (protéines du choc thermique, dysrégulation de la production de NO) et des anomalies de l'immunité : les lymphocytes CD4+ et CD8+ produisent des cytokines pro-inflammatoires ( l'IL2, l'IFNã , l'IL6, l'IL8, l'IL12 et le TNFá).

Les cytokines sont des médiateurs autocrines, endocrines, et paracrines apparaissant désormais comme un langage universel dans le dialogue muni entre les différentes cellules de l'organisme. Elles peuvent modifier, induire ou supprimer les fonctions de nombreux types cellulaires.

Deux voies distinctes de réponses des lymphocytes Th ont été mises en évidence au cours de la MB : les lymphocytes Th-1 produisent essentiellement l'IFNã qui joue un rôle important dans divers processus immunitaires, il module la prolifération, la différentiation et l'activité des cellules immunitaires. Les concentrations sériques de ces cytokines sont augmentées au cours de la maladie de Behçet et l'augmentation du nombre des lymphocytes Th-1 dans le sang périphérique est corrélée à l'activité de la maladie. Les cytokines marqueurs de la voie Th-2 sont IL4, IL10, IL5. Plusieurs arguments suggèrent que l'immunité humorale participe à la physiopathologie de la maladie de Behçet malgré que le nombre de lymphocytes B de patients soit normal.

Parmi les anomalies de l'immunité humorale décrites au cours de la maladie de Behçet, l'élévation de taux des immunoglobulines sériques.

L'objectif de ce travail est de suivre d'une part, l'activité de l'IFNã in vivo chez des patients atteints de la MB en activité (poussée inflammatoire) vue son implication dans les mécanismes immunopathologiques antérieurement rapportée dans la MB par de nombreux auteurs (Guenane, 2001; Guenane et al, 2006 ; Djaballah-Ider, 2008), et d'autre part, de situer la production des immunoglobulines circulantes (IgM, IgG, IgA) vue le rôle non négligeable du lymphocyte B dans la MB.

Ø Etude de la production des immunoglobulines sériques (IgM, IgG, IgA) par Immunonéphélemétrie Laser.

Chapitre II Généralités

En 1937, un professeur en dermatologie turc, Hulusi Behçet «1889-1948», définit une entité associant une aphtose buccale, une aphtose génitale et une inflammation oculaire sous le nom de la maladie de Behçet, depuis de nombreuses autres manifestations systémiques ont été reliées à cette triade. La physiopathologie de la maladie de Behçet reste incomprise, de nouvelles données expérimentales permettent toutes fois de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans cette maladie.

La maladie de Behçet (MB) est une vascularité multi systémique d'étiologie inconnue, elle se manifeste essentiellement par des signes muqueux tels des aphtes buccaux, des aphtes génitaux et cutanés. Des manifestations systémiques notamment oculaires (uvéite, vascularité rétinienne), neurologiques et vasculaires. Son diagnostic est clinique et repose sur des critères internationaux (ISGBD 1990).

Tableau I. - Critères diagnostiques du groupe international d'étude sur la maladie de Behçet (ISGBD, 1990)

critères obligatoires:

Ulcérations buccales récurrentes : aphtose mineure, aphtose majeure ou ulcération herpétiforme observée par un clinicien ou le malade survenant au moins 3 fois en 12 mois.

Autres critères :

1. Lésions cutanées : érythème noueux observé par un clinicien ou le malade, pseudo-folliculites ou lésions papulopustuleuses ou nodules acnéiformes observés par un clinicien en dehors de la période d'adolescence et de traitement corticoïde.

2. Ulcération génitale récurrente : aphtose ou cicatrice observée par un clinicien ou le malade.

3. Lésions oculaires : uvéite antérieure, uvéite postérieure ou hyalite à l'examen à la lampe à fente ou vascularite rétinienne observée par un ophtalmologiste.

4. Test pathergique : lu par un clinicien entre la 24 e et la 48 e heure. présence d'une pustule ou d'une papule après 24 à 48 h, au point de ponction d'une aiguille sous-cutanée à la face antérieure de l'avant-bras.

La maladie de Behçet est particulièrement fréquente dans les pays du bassin Méditerranéen et au Japon. Sa prévalence est de 80-370/100000 habitants en Turquie, d'environ 10/100000 habitants au Japon, de 110/100000 habitants en Tunisie (Zouboulis, 1999), de 2/10000 en Arabie Saoudite, de 1.67/10000 en Iran. En Europe la prévalence la plus élevée se situe en Italie : 2.5/100000 (Kone-Paut 2001) mais, elle est rare au États Unis, sa prévalence est de 0,1-7,5/100000 habitants (Zouboulis, 1999).

La maladie de Behçet survient généralement entre 18 et 40 ans, avec une prédominance masculine.

La pathogénie de cette maladie reste inconnue, pour cela les facteurs environnementaux et immunologiques impliqués sont de plus en plus étudiés afin de mieux la caractériser.

Les mécanismes physiopathologiques ne sont pas encor clarifier (Otmani, 2003), cette étiologie a été focalisée initialement sur :

-L'auto-immunité ou réactivité croisée entre antigènes microbiens et antigènes mucosales.

Behçet suggéra que le virus de l'herpes simplex soit un agent causatif de la maladie dans son premier rapport, il y a une forte incidence d'anticorps antivirus herpes simplex (Lee et al ,1996) virus de l'hépatite C et le parvovirus B19.

Dans la maladie de Behçet, les antigènes streptococciques ont été aussi impliqués, en particulier une rare variété de Streptococcus sanguis dont l'hypersensibilité joue un rôle important dans l'étiopathologénie de cette maladie (Tanaka et al, 1999).

La multiplicité des facteurs étiologiques devrait avoir comme dénominateur commun la protéine microbienne HSP 65 KDa (heat shock protein). C'est une protéine largement conservée entre plusieurs espèces, synthétisée par les cellules en réponse à un stress thermique, aux agents toxiques et à l'infection. L'HSP 65 KDa montre une homologie significative avec l'HSP 60 KDa mitochondriale humaine; il a été aussi démontré que des régions de 200 résidus d'acides aminés dans la séquence de la molécule HSP de Streptococcus pyogenes et l'HSP de boeuf présentant une homologie de 47% (Stanford et al, 1994).

Les recherches sur les HSP ont révélé chez des patients la présence de trois populations de cellules B spécifiques de trois épitopes de la protéine HSP 65 de Mycobactérium tuberculosis. Il s'agit des fragments 111-125, 154-172 et 311-326. Les peptides 136-150 et 336-351 de l'HSP 60 KDa mitochondriale humaine montre des résultats comparables avec leurs homologues mycobactériens respectifs 111-125 et 311-326 (Direskeneli et al, 1996). Ces observations confirment le rôle de l'infection bactérienne dans l'apparition de la maladie de Behçet et en particulier avec Streptococcus pyogénes.

L'investigation de l'étiologie de la maladie de Behçet a porté par la suite sur la composante génétique retrouvée dans la pathologie de la maladie (Samngooei et al, 2000 ; Cohen et al 2002).

Le gène le plus étudié est de l'HLA B51 (Misuki et al ,2001), mais il existe d'autres gènes qui ont été aussi associés à la maladie comme le gène MICA et les gènes de certaines cytokines (TNFá, IL6, IL1) dont le polymorphisme des régions promotrices induit une hyperréactivité des lymphocytes T (Mi-La et al, 2004 ; Chang et al, 2005).

La composante génétique de la MB reste à élucider et plus particulièrement l'identification des gènes impliqués dans sa survenue. S'il est admis qu'il existe des cas familiaux, aucun modèle d'hérédité ne peut encore être définitivement établi.

Des associations avec le système HLA ont été décrites, le rôle de l'HLA B51 dans l'étiopathologie de la MB a été en premier évoqué par Ohno et al en 1973 puis confirmé par plusieurs auteurs.Un certains nombre d'études a fourni l'évidence que l'antigène HLA-B51est fortement associé à la maladie de Behçet, vue la prévalence de cet antigène au niveau du bassin méditerranéen et en extrême orient (Ohno et al, 1982). Selon les populations, l'expression variante de cet antigène est apparue non conforme aux critères de diagnostic proposés par le groupe d'étude international sur la maladie de Behçet (ISGBD, 1990). Sa fréquence au cours de la maladie varie entre 50 et 88% des cas.

Une étude a montré que l'allèle B5101 est trouvé chez 72% des patients avec une prédisposition chez l'homme aux uvéites Behçet (Mizuki et al, 2001).

Il a été démontré récemment, une association avec un polymorphisme du gène MICA (major histocompatibility complex class I chain related gene). Ce gène localisé à 46kb en position centromérique du gène HLA-B et le séparant de celui du TNFá, code pour une protéine HLA de classe I non classique induite par le stress, jouant probablement un rôle directe dans la destruction des cellules cibles par les lymphocytes Tãä (Hue-Lemoire et al, 1999 ; Nishiyama et al, 2004).

Récemment un polymorphisme des gènes de certaines cytokines a été démontré, induisant une augmentation de la production du TNFá, de l'IL6 de l'IL1 et une diminution de l'IL10 (Mi-la et al, 2004 ; Chang et al, 2005).

Le système immunitaire est fortement impliqué dans la maladie de Behçet car des auto anticorps anti auto antigènes de localisations diverses ont été détectés dans le sérum de patients atteint de la MB : des autoanticorps-anti muqueuses buccales, des auto anticorps-anti cellules endothéliales (Le Hoang, 1988), des auto-anticorps anti antigènes rétiniens, des anticorps anticardiolipines, des anticorps anti alpha-tromyosine ; toutes ces molécules induisent une réactivité lymphocytaire importante (Smet et Dayan, 2000 ; Triolo et al, 2002).

Les LT participent et jouent un rôle majeur dans l'évolution de la MB, et l'anomalie en question touchant le LT a pu être située.

Il s'agit d'une transduction excessive du signal due à une perturbation des chaines â du TCR (Hirohata et Hashimoto, 1998) et une anomalie fonctionnelle de LCK (Tyrosine Kinase) qui cause une hyperphosphorilation de la ZAP70 impliquée dans la transduction du signal.

Les LT des patients présentant d'autres anomalies parmi lesquelles l'augmentation du nombre de cellules CD4+CD29+ avec diminution du nombre de cellules CD4+CD45RA+ (cellules naïves) (Kahan et al, 1991). Des changements dans le répertoire Vâ au niveau du TCR (Direskeneli et al, 1999) et une élévation des cellules CD4+ (Thelper) exprimant le CD16 et le CD56. Ce dernier marqueur dont l'expression est corrélée avec l'activité de la maladie est une molécule associée aux NK ce qui conforte l'hypothèse d'une sous population de cellules CD8+ cytotoxiques (Eksioglu-Demiralp et al, 1999) et l'orientation vers la cytotoxicité fréquemment rencontrée dans cette pathologie.

Le rôle pathogénique des LT exprimant à leur surface le TCRãä a été démontré, l'augmentation de la proportion des LT de type ãä, notamment en réponse aux HSP 65kda mycobactériénnes (Hasan et al, 1996), cette augmentation est corrélée à la phase active de la maladie (Bank et al, 2003) avec une diminution des LT de type áâ.

Bien que le nombre de LB de patients atteints MB soit normal (Eksioglu-Demiralp et al, 1999) plusieurs arguments suggèrent que l'immunité humorale participe à la physio- pathologie de la MB du fait que des taux élevée d'IgA sériques sont signalés au cours des formes rhumatismales, neurologiques et oculaires de la pathologie (Le Hoang, 1988), alors que le taux d'IgG et d'IgM sont normaux.

Le taux de cellules B (CD19+) exprimant les marqueurs myéloïdes CD13 et CD33 est augmenté, ainsi que celui des cellules CD19+CD45RA+ et des cellules CD19-CD80+ (cellules B activées). Ces anomalies de fonction des cellules B semblent être liées à une stimulation de moindre degré mais continue par un antigène externe inconnu (Eksioglu-Demiralp, 1999).

De nombreux chercheurs se sont intéressés à étudier le profil des cytokines pro inflammatoires (IL12, IL6, IL10, IL18, IFNã) de fait que la vascularité multisystémique est un processus inflammatoire, au cours de l'évolution clinique de la pathologie (Guenane, 2002 ; Guenane et al, 2006 ; Hartani et al, 2006 ; Djaballah-Ider, 2008) c'est-à-dire durant la phase active (poussées inflammatoires) et inactive (rémission).

D'autres auteurs rapportent l'augmentation de la production du TNFá, de l'IL1 (IL1â) de l'IL6, du récepteur soluble (75kda) du TNFá, de l'IL8 et du récepteur soluble de l'IL1 chez des sujets en phase active par rapport au sujet normaux et aux malades en rémission (Akoglu et al, 1990 ; Hamzaoui et al, 1990 ; Mege et al, 1993; Adam et Calikoglu, 2004).

L'IL8 semble jouer un rôle clé dans le développement de la réaction inflammatoire. Son taux est très élevée au cours des poussées (Al-Dalaan et al, 1995 ; Mantas et al, 2000). Elle a été associée à l'activité de la maladie (Katsantonis et al, 2000).

L'IL8 est secrétée principalement par le systéme monocyte/macrophage et les LT en réponse à l'IL1â et le TNFá. Cette cytokine est chimiotactique pour les granulocytes et les LT. Elle favorise leurs passage a travers l'endothélium en augmentant l'expression des molécules d'adhésion (Mantas et al, 2000).

La production de l'IFNã, de l'IL2 et de l'IL12 est importante in vivo et in vitro, cette production corrélée à l'activité de la maladie (Hamzaoui et al, 2002 ; Djaballah-Ider, 2008).

Guenane et al en 2006 ont démontré une production augmentée d'IL10 chez de nombreux patients. Cette même observation a été rapportée par Raziuddin et al en 1997 indiquant que le profil de sécrétion de cytokines est à la fois Th1/Th2.

L'évolution de la MB pouvant se faire par poussés et rémission. Son traitement est essentiellement symptomatique du fait des nombreux inconnus concernant son étiologie et sa physiopathologie.

L'hyperstimulation des polynucléaires, avec en particulier une augmentation du chimiotactisme rencontrer au cours de la MB, explique l'utilisation et l'efficacité de la colchicine qui induit une dépolymérisation des microtubules cytoplasmiques, atténuant ainsi la première étape du processus inflammatoire à l'origine de la microvascularite et justifiant son utilisation avec la Thalidomide dans les formes cutanéomuqueses et rhumatismales de la MB (Le Hoang, 1988).

Les glucocorticoïdes de synthèse, prednisone et méthylprednisone, possèdent touts une série d'effets qui les rendent extrêmement efficaces pour inhiber la réponse immunitaire, partiellement par leurs actions sur les cytokines de l'immunité mais aussi, en raison de leurs effets inhibiteurs de l'inflammation. Ces effets anti-inflammatoires sont particulièrement remarquables : une inhibition de la sécrétion des prostaglandines a été reportée, des leucotriénes et une inhibition de l'activité de la phospholipase A2 (PLA2) via la synthèse de lipocortine, inhibition de la sécrétion des cytokines pro- inflammatoires (IL-1, IL-6 et plus modestement le TNFá) et stimulation des inhibiteurs de ces cytokines, inhibition de nombreuses protéases, inhibition de la production de monoxyde d'azote (NO). Les glucocorticoïdes sont aussi immunosuppresseurs par leurs effets inhibiteurs directs sur la production de cytokines impliquées dans la réponse immune, spécialement d'IL-2 et de l'IFNã.

La corticothérapie est souvent associée à l'utilisation des immunosuppresseurs dont certains sont cytotoxiques tels que le méthotréxate, l'azathioprine, le chlorambucil et le cyclophosphamide (Caspers-Velu et al, 1989 ; Hamuryudan et al, 1997 ; Okada, 2000).

L'azathioprine appartient à la famille des thioprines. Son activité inhibitrice s'exerce principalement sur les lymphocytes T auxiliaires (CD4+), les cytotoxiques (CD8+), et sur les NK.

Le cyclophosphamide (Endoxan) et le chlorambucyl (Chloraminophéne) ont des effets inhibiteurs sur la réponse immune, essentiellement sur la production d'anticorps qui est inhibée de manière spectaculaire ; accessoirement sur la prolifération des lymphocytes T auxiliaires (CD4+) ou cytotoxiques (CD8+).

Cyclosporine A et le Tacromilus (FK506) sont des substances extrêmement hydrophobes qui se lient dans le cytoplasme aux récepteurs de la famille des immunophilines (Okada, 2000). Ce complexe inhibe la calcineurine, qui contrôle les processus d'activation de la transcription de plusieurs gènes de cytokines responsables de la réponse immune cellulaire : IL-2, IL-4, IFNã.

L'IFN-á (IFN-á2a) est utilisé comme un immunomodulateur permettant la diminution du taux du TNFáR et d'E-sélectine chez les patients en phase active de la maladie de Behçet (Kotter et al, 1998).

L'utilisation des anticorps monoclonaux anti- TNFá a fait ses preuves dans le traitement de maladie de Behçet (Hassard et al, 2001).

Les cytokines forment un groupe de médiateurs intercellulaires qui agissent de façon autocrine, paracrine ou endocrine. Elles interviennent dans le développement des réponses immunitaires, cellulaires ou humorales, l'induction de la réponse inflammatoire, le contrôle de la prolifération, la différenciation cellulaire et la cicatrisation des plaies. Elles sont classées en quatre groupes en fonction de leur structure biochimique (Scott et al, 2002):

Dans les années trente, plusieurs chercheurs notamment Jener observèrent le phénomène de l'interférence virale ou l'infection d'un animal par un virus semble le protéger contre l'infection par d'autre virus. En 1957 Isaacs et Lindenman découvrirent l'agent de l'interférence virale, une protéine libérée par les cellules quand elles sont exposées à un virus et qui permet aux autres cellules de résister à l'infection virale. Ils appelèrent cette protéine : l'interféron (Falcoff ,1972).

Les interférons (IFN) naturels constituent une famille de protéines synthétisées par les cellules eucaryotes en réponse à une infection virale ou à des inducteurs divers. Ces protéines sont capables de conférer à toutes les cellules d'espèce homologue une protection contre la multiplication des virus aux quelles elles sont d'origine permissives. A l'intérieur d'une même espèce, il existe une variété d'IFNs (Kelly, 1986). Cette diversité a conduit à établir une classification selon la source cellulaire, le mode d'induction, la structure de leurs gènes, leurs caractéristiques physico-chimique et les propriétés antigéniques des INFs (Commission de nomenclature ISICR, 2000). Ils ont été classés en deux types distincts: Les IFNs de type I (IFNá, â, ù, æ) et l'IFNã de type II dit immunologique et possédant des effets pléiotropies (tableau II).

L'IFNã est une glycoprotéine basique composée de deux sous unités protéiques de 166 acides amines avec deux sites potentiels de glycosylation en 25 et 97 et ne contenant pas de ponts disulfure (Rinderknescht et al, 1984 ; Touil, 1986).

Elle existe sous trois formes monomériques de 25 ; 20 et 15,5 KDa. Son poids moléculaire dépend du degré de glycosylation (Kelker et al ,1984):

L'extrémité N terminale de l'IFNã est caractérisée par la présence d'un résidu Pyroglutamate alors que son extrémité C terminale est hétérogène.

Les formes monomériques s'associent pour former des dimères de 45 à 50 KDa : formes biologiquement actives.

La forme dimérique est nécessaire à son activité biologique (Ferrar et Scheiber, 1993) mais les deux sous unités ne sont pas liées par des liaisons covalentes. L'IFNã est codé par un gène unique situé sur le bras court du chromosome 12 avec 3 introns et 4 exons. Il ne présente aucune autre homologie avec les gènes codants pour les autre IFNs de type I.

L'IFNã est principalement produit par les lymphocytes T CD4 de type Th1, les cellules T CD8, les lymphocytes Tãä et les cellules NK (Gao et al ,2003), mais il peut être aussi produit à faible quantité par les monocytes /macrophages et les cellules dendritiques en présence de certains effecteurs tel que l'IL12 et IL18, de même que les NK le produisent en réponse à l'IL2 (Munder et al ,1998).

Les agents viraux sont la cause majeure induisant la synthèse de l'IFNã. D'autres agents non viraux peuvent également l'induire :

La synthèse de cette cytokine est le résultat d'une dérepression du gène codant pour la protéine «IFNã» permettant la transcription du message et ainsi une synthèse et une excrétion de la molécule de l'IFNã dans le milieu extracellulaire.

Les récepteurs de l'IFNã sont présent à la surface de toute les cellules de l'organisme à différent degré d'affinité ce qui suggère son implication dans divers processus physiologiques ou physiopathologiques dans différents types cellulaires.

L'IFNã exerce des actions prolifératives, antiprolifératives et apoptotiques sur différents types cellulaires. L'IFNã active la synthèse de l'IRF-1 (Interferon Regulatory Factor-1) par la forte expression de ses récepteurs à la surface cellulaire. Ce facteur stimule la transcription des gènes impliqués dans la régulation négative de la croissance cellulaire et conduirait ainsi à l'apoptose, cette derniére est liée à l'expression de la Bcl-2 toujours sous l'action de l'IFNã (Kim et al, 2002).

De même, l'IFNã induit l'expression de la p21 et la p202 : molécules qui bloquent le passage de la phase G1 à la phase S du cycle cellulaire, ce qui impliquera une action antiproliférative de l'IFNã.

Par ailleurs, l'effet prolifératif est le résultat d'une action synergique de l'IFNã avec certaines cytokines stimulant la prolifération et la différenciation cellulaire, telles qu'en présence de l'IL3 et l'IL6, l'IFNã induit la prolifération des cellules CD34⁺ (Snoecket al, 1993).

L'IFNã tient une place très importante au cours de la réponse immunitaire Il régule la prolifération, la différenciation et l'activité des cellules immunitaires.

L'IFNã est un puissant activateur des cellules de système monocytes /macrophages .En effet, il induit une augmentation importante de leurs activités cytotoxiques, anti tumorales, antimicrobiennes et antivirales. Ces activités sont le résultat de l'induction de différentes enzymes par l'IFNã notamment de la NOS II, de la NADPH oxydase et des protéases neutres. Cette induction est plus importante en présence de certaines cytokines qui exercent une action synergique avec l'IFNã telle que l'IL1, IL6 et le TNFá, la production de ces cytokines pro-inflammatoires elle même est induites par l'IFNã. L'IFNã intervient également dans les processus de maturation et d'activation des autres cellules présentatrices de l'antigène (CPA) telle que les cellules dendritiques, les cellules de Langerhans, les cellules endothéliales et les cellules microgliales en induisant l'expression les molécules du CMH de classe II et par conséquent augmentera leur capacité de présenter les antigènes aux lymphocytes T CD4+ (John et al ,2003).

L'IFNã régule la prolifération et la différenciation des lymphocytes B, action qui résulte de l'importante présence de son récepteur IFNGR2 à la surface cellulaire des cellules B notamment préactives (Bernabei et al ,2001). Il exerce un effet inhibiteur sur le recrutement des lymphocytes B immatures (Flaishon et al, 2000).

L'IFNã stimule la production des isotypes d'immunoglobulines IgG2a et IgG3 et inhibe la synthèse des IgE (Snapper et al, 1992).

L'IFNã induit la différenciation de lymphocytes T CD4+ vers la voie Th1 en induisant la production de l'IL12 et de la sous unité â de son récepteur, par ailleurs il inhibe la réponse vers le profile Th2 en stimulant la production de l'IL4 et par l'inhibition de son récepteur (Farrar et al, 2002).

En plus de la participation de l'IFNã dans les mécanismes de défenses antiviraux par la modulation positive de l'activation des cellules T cytotoxiques et par l'augmentation de l'expression de l'antigène CMH I et II augmentant ainsi la capacité des cellules infectées à présenter les peptides viraux aux lymphocytes T CD8+ (Touil-Boukoffa, 1998). L'IFNã possède des propriétés antivirales très importantes qui résultent de son action directe sur les enzymes impliquées dans la production des protéines virales dont les principales induites par l'IFNã sont les PKR (Protéine Kinase dépendant des RNA double brin) et la 2',5' oligoadénylate synthétase.

L'implication de l'IFNã dans de nombreux mécanismes de régulation des réponses immunitaire anticancéreuses et antivirales et antiparasitaires (Touil, 1986 ; Touil-Boukoffa, 1998), a suscité son utilisation dans diverses thérapies anticancéreuses, antivirales et antiparasitaires (Antoniou et al 2003 ; Amri et al, 2007).

Le traitement par l'IFNã de la leishmaniose viscérale réfractaire au traitement classique par des Sels d'antimoine à un pronostic très positif (Falcoff et al, 1993). De même le traitement des lisions cutanées de lèpre par l'IFNã conduit à la diminution de l'index bactérien avec affluence de macrophages et lymphocytes T activés vers les lésions (Miossec, 1998).

Les immunoglobulines (Ig) sont des glycoprotéines sécrétées par les plasmocytes qui se différencient à partir des lymphocytes B. Elles sont impliquées dans la réponse humorale. Cinq classes d'immunoglobulines ont été identifiées: IgG, IgA, IgM, IgE et IgD d'après la structure de leurs chaînes lourdes.

La structure de base d'une immunoglobuline est identique quelle que soit la classe à la quelle elle appartient, elle est constituée de quatre chaînes polypeptidiques dont deux chaînes légères (? ou ë) et deux chaînes lourdes identiques (ã, á, u, ä ou å) réunies entre elles par un nombre variable de ponts disulfures.

L'IgM est la première immunoglobuline produite par les cellules B et exprimée sur leur surface.

Elle agit en récepteur d'antigène pour ces cellules, elle est ainsi présente en molécule soluble dans le sang. Cette molécule est exprimée sur la surface de la cellule B en unité à quatre chaînes (deux chaînes H u et deux chaînes -L).

Elle est composée de cinq unités à quatre chaînes retenues entre elles par des ponts disulfures à l'extrémité C terminale des chaînes u. La chaîne J également associée à l'IgM dans le sang, initie la polymérisation de ses sous-unités au moment ou elle est secrétée par les plasmocytes.

En raison de sa taille (900 KDa), l'IgM est trouvée principalement dans l'espace intra vasculaire, elle est le premier anticorps produit dans une réponse immunitaire.

Les IgM possèdent 10 sites de liaison par molécule qui peuvent être synergiques les uns aux autres sur la même molécule lorsque celle-ci se lie à un antigène. Donc, l'intensité globale de la liaison d'une molécule d'IgM (avidité) à un antigène est élevée, ce qui permet aux anticorps de cette classe de supprimer l'antigène en question.

Les immunoglobulines de la classe IgG possèdent un poids moléculaire de 150 KDa et sont trouvées dans les espaces vasculaire et extravasculaire ainsi que dans les sécrétions.

L'IgG est l'immunoglobuline la plus abondante dans le sang, elle fournit la majorité de l'immunité aux agents infectieux transmit par voie sanguine. Elle est la seule classe d'anticorps qui traverse le placenta pour fournir l'immunité humorale passive au foetus.

L'IgG possède deux chaines-H (chaine de type ã) avec deux chaines légères (ê et ã).

Il existe quatre sous-classes d'IgG (désignées par IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) qui possèdent des séquences de chaines-H et des activités fonctionnelles légèrement différentes.

Cette immunoglobuline est présente dans le sérum (PM : 170 KDa), sous forme de quatre chaînes polypeptidiques (deux L et deux H). Elle est principalement présente dans les sécrétions externes telles que le colostrum, le lait et la salive ou elle existe en dimère de 420KDa. Outre les chaînes -L (? ou ë) et la chaîne lourde (désignée par á), qui la distingue de l'IgG ou des autres classes d'anticorps, l'IgA sécrétoire contient également deux autres chaînes polypeptidiques (pièce sécrétoire) et la chaîne J (chaîne de liaison).La pièce sécrétoire appartient à la molécule (récepteur du poly-Ig) qui contribue au transport transépithélial de l'IgA exocrine et la stabilise contre une dégradation protéolytique.

Les deux unités à quatre chaînes composant l'IgA sécrétoire sont retenues ensemble par la chaîne-J à travers des ponts disulfures. La majorité de l'IgA est synthétisée localement par les plasmocytes dans les glandes mammaires et salivaires, et le long du tractus gastro-intestinal, respiratoire et génito-urinaire. Elle est ensuite transportée par les cellules épithéliales à la lumière. Cet anticorps constitue la première ligne de défense contre l'agression microbienne sur les surfaces muqueuses.

Pour la réalisation de notre étude, nous avons effectué des prélèvements sanguins sur quatre patients atteints de la MB et sur quatre sujets sains. La collecte du sang est faite sur tube hépariné.

Les sérums des patients Behçet et des sujets sains ont été récupérés sur tubes secs.

Plaque d'Elisa sandwich (Immunotech, France) ; anticorps monoclonaux de souris anti- immunoglobuline (anti-IgM, anti-IgG, anti-IgA) adapté à l'immunonéphélémétrie Laser.

Il s'agit d'un dosage de type sandwich. Dans les puits d'une plaque de micro titration recouverts d'un premier anticorps monoclonal anti IFNã sont incubés les échantillons à doser ou le standard ainsi que le deuxième anticorps couple à la peroxydase.

Après incubation l'activité enzymatique est révélée par le substrat chromogène. L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en IFNã présents dans les échantillons ou le standard.

Dans les puits d'une plaque de microtitration recouverte d'un 1premier anticorps monoclonal anti IFNã sont incubés les sérums avec le standard à raison de 50ìl IFNã.

Après 2h d'incubation sous agitation à température ambiant et lavage, 50ìl d'anticorps biotinylé ainsi que 100ìl de streptavidine couplé à la peroxydase sont ajouté aux différents puits.

Après une deuxième incubation pendant 30 min sous agitation à température ambiante et lavage, l'activité enzymatique est révélée par addition du substrat chromogène TMB à raison de 100ìl par puits.

La réaction chromogène se développe à l'obscurité pondant 30min, elle est ensuite arrêtée avec une solution d'acide sulfurique 2N.

L'absorbance est lue à 450 nm contre le blanc substrat, l'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en IFNã présente dans l'échantillon et le standard.

III.2.2. Etude de la production des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA) :

III.2.2.1. Dosage des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA) par Immunonéphélémétrie Laser :

L'immunonéphélémétrie Laser est une absorption de la lumière par les complexes Ag-Ac en excès d'anticorps, selon la courbe d'Heidel Berger.

La réaction immunologique de dosage des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA) par immunonéphélémétrie Laser est comme suit :

Après dilution au 1/20 du sérum qui contient des immunoglobulines sériques à doser, 10ìl sont mis en contact avec l'antisérum renferment les anticorps monoclonaux anti-immunoglobulines (anti-IgM, anti-IgG, anti-IgA) en présence de 150ìl du tampon de réaction.

Après incubation pendant 6 min et passage du faisceau lumineux (Laser), l'absorption de la lumière par le complexe Ag-Ac, en excès d'anticorps selon la courbe d'Heidel Berger, permet d'obtenir la concentration des immunoglobulines sériques en g/l.

La comparaison des moyennes a été réalisé en utilisant le test de student (t) pour les petits échantillons (<30) à un taux de risque maximum de 5%.

Nous avons entrepris une étude de la production de l'IFNã chez des patients atteints de la maladie de Behçet en activités (poussée), et chez des sujets sains, les taux de l'IFNã dans le sérum varient entre [2.6 et 6.5 UI/ml] avec une moyenne égale à [4.42#177;1.79 UI/ml].

Les taux sériques de l'IFNã ont montré une augmentation significative chez les patients atteints de Behçet en comparaison avec les sujets sains. En effet, cette production chez les patients varie entre [23 et 28 UI/ml] avec activité moyenne égale à [25#177;2.16 UI/ml] (figure 04).

2. Etude de la production des immunoglobulines sériques (IgM, IgG et IgA) in vivo :

L'étude de la production des IgM, IgG et IgA in vivo a montré une augmentation de leurs taux chez les patients Behçet par rapport aux sujets sains (figure 05).

Chez les sujets sains, les taux d'IgM dans les sérums ont une moyenne de [2.35#177;1.07 g/l], leur production est plus importante chez les patients atteints Behçet, chez les quelle nous avons observé une teneur moyenne de [4,32#177;1,53 g/l] (figure 05-a).

Les taux sériques des IgG ont montré une augmentation chez les patients Behçet par rapport aux sujets sains. Chez les patients Behçet, les taux sériques ont une moyenne de [18,51#177;2.37 g/l], celle des sujets sains est de [9,1#177;0,57 g/l] (figure 05-b).

Chez les sujets sains les taux sériques des IgA ont une moyenne de [1,16#177;0,73 g/l]. Leur production est plus importante chez les patients Behçet, elle est de [6,02#177;1,09 g/l] (figure 05-c).

Figure 04 : Activité moyenne de l'IFNã dans le sérum des patients Behçet (n=4) et des sujets sains (n=4).

Figure 05 : Teneur moyenne en immunoglobulines (Ig) sériques (IgM, IgG et IgA) chez des patients Behçet (n=4) et des sujets sains (n=4).

Notre étude portant sur l'implication de l'IFNã dans le processus auto immun accompagnant la MB a montré une augmentation significative de la production de cette cytokine in vivo chez les patients atteints de Behçet par rapport aux sujets sains (figure 04), notre résultat confirme les résultats apportés par plusieurs auteurs où la production de l'IFNã est corrélée à la phase active de la maladie (Turan B et al, 1997; Singh VK et Rai 2001).

Les processus auto-immuns accompagnés de réactions inflammatoires mettent souvent en jeu une réponse cellulaire associée à la voie Th1. L'IFNã dont la production est favorisée par l'IL12 exerce plusieurs actions au cours de ces processus, notamment des actions activatrices sur les fonctions du système monocyte/macrophage et les cellules TCD8⁺ (Abbas et al ,1996).

Ainsi, il apparait que les cytokines Th1, notamment l'IFNã jouent un rôle crucial dans l'immunopathogénèse associée à l'évolution de la pathologie (Guenane et al, 2006 ; Djaballah-Ider, 2008).

Les résultats relatifs à l'étude de la production des immunoglobulines sériques chez les patients atteints de la MB indiquent une élévation du taux des IgM, IgG et IgA au cours de la pathologie considérée par rapport aux sujets sains (figure 05-a, b et c). Ce qui suggère l'implication non négligeable du lymphocyte B et de la réponse humorale au cours de la maladie de Behçet, en particulier dans la relation existante entre l'expression CD19 et la production des 3 isotypes d'immunoglobulines mesurées chez les patients (Djaballah-Ider, 2008). Cette relation implique l'existence du profil mixte Th1/Th2 chez les malades atteints de Behçet.

En effet, plusieurs anomalies de la réponse humorale ont été rapportées (Otmani, 2003).

Par ailleurs, les commutations de classe d'immunoglobuline induite par les cytokines Th1/Th2 sont à considérer (Djaballah-Ider, 2008), ce qui engendre la diversité isotypique observée, nos résultats appuient cette donnée.

Notre étude a contribué à la mise en évidence d'un profil mixte Th1/Th2 dans l'orientation des réponses immunitaires rencontrées au cours de la maladie de Behçet.

Les résultats relatifs à la production de l'IFNã confirment l'implication des cytokines Th1 dans l'hyper activation des cellules T associée à la maladie de Behçet.

Notre étude à montré également, le rôle non négligeable du lymphocyte B dans les mécanismes immunopathologiques associés à la maladie de Behçet en relation avec la diversité isotypique (IgM-IgG-IgA) observée chez les patients Behçet en activité, ce qui confirme l'implication d'un profil mixte Th1/Th2 au cours de cette maladie.

L'approfondissement de l'étude des réponses immunitaires cellulaire et humorale rencontrés au cours de la maladie de Behçet, par l'étude des marqueurs de surface caractéristiques des cellules lymphocytaires conforterait nos résultats.

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Contribution à l'étude de la production de l'IFN&#947; et des immunoglobulines circulantes (IgM, IgG et IgA) chez des patients atteints de la maladie de Behçet

I. Introduction:

Chapitre II Généralités

Contribution à l'étude de la production de l'IFNγ et des immunoglobulines circulantes (IgM, IgG et IgA) chez des patients atteints de la maladie de Behçet