TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoà¯que à travers les régulations post-transcriptionnelle et transcriptionnelle

Diplôme d'Etudes Approfondies

« Biologie des Cellules Sanguines »

TLS, une protéine du spliceosome, est impliquée dans le mécanisme d'action de l'acide rétinoïque

à travers les régulations post-transcriptionnelle

et transcriptionnelle

Eric Le Corvec

Université Paris 7 Denis Diderot

Juillet 2002

Laboratoire de Biologie Cellulaire Hématopoïétique

EMI 00-03, Univ. Paris 7 EA 316, Saint-Louis UF474

Institut Universitaire d'Hématologie, Hôpital Saint-Louis

75475 Paris Cedex 10

Directeur du laboratoire et maître de stage

Christine Chomienne

Laurent Delva

Je remercie chaleureusement Christine Chomienne de m'avoir permis de réaliser ce DEA.

Je remercie tout spécialement Laurent Delva qui m'a fourni aide et conseils, et sans qui ce travail n'aurait pu être possible.

Je remercie Gilles Despouy pour son soutien moral et scientifique.

Je remercie Nicole Balitrand pour ses conseils avisés.

Je remercie Sylvie Deshaie pour tout ce qu'elle m'a apporté pendant l'année.

Merci amical à Alexandra Mazharian pour sa bonne humeur.

Enfin, je voudrais remercier toute l'équipe du LBCH pour leur accueil et leur sympathie.

RESUME

Les régulations transcriptionnelle et post-transcriptionnelle sont impliquées fortement dans la diversification de l'expression protéique.

Le fait que TLS soit surexprimée dans 60% des LAM et qu'il interagisse avec RXR, l'un des principaux partenaires du RANC, nous permet d'émettre l'hypothèse que TLS serait liée à la voie de signalisation de l'AR dans les cellules hématopoïétiques. TLS, une protéine ubiquitairement exprimée, intervient dans de nombreux mécanismes moléculaires. De nombreuses études montrent qu'elle est liée à la machinerie transciptionnelle aussi bien qu'à celle de l'épissage.

Nous avons initié l'étude de l'action de TLS et de l'AR sur l'activité transcriptionnelle dans les cellules myéloblastiques HL-60. L'appartenance de TLS au complexe transcriptionnel des récepteurs à l'acide rétinoïque est évaluée par la technique de retard sur gel avec les deux récepteurs nucléaires aux rétinoïdes (RAR et RXR). De plus, le rôle de TLS et de l'AR sur l'épissage a été étudié par une technique d'analyse in vivo, sur l'épissage alternatif en 5' du minigène E1A dans les cellules hématopoïétiques K562 en absence ou en présence d'acide rétinoïque.

Nos travaux ont permis de caractériser un rôle de co-activateur de la transcription par les récepteurs aux rétinoïdes en présence d'acide rétinoïque dans les cellules HL-60 et Cos-6, son appartenance au RANC et un rôle de facteur d'épissage favorisant la sélection du site 5' distal d'épissage du minigène E1A dans les cellules myéloïdes K562. Nous avons montré que TLS agit aussi avec la voie de signalisation des rétinoïdes qui accentuent les effets observés de TLS sur l'épissage.

L'acide rétinoïque est ainsi impliqué à la fois dans le transcriptome et le spliceosome à travers TLS. Ainsi, c'est la première fois que la voie de signalisation des hormones est impliqué dans l'épissage et la transcription à travers un facteur d'épissage.

LISTE DES ABREVIATIONS

ABL : ABeLson

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

ADNc : ADN complémentaire

AF : Activation function

AR : Acide Rétinoïque

ARN : Acide RiboNucléique

ARN polII : ARN ploymérase II

ARNpré-m : ARN pré-messager

ATRA : All-Trans Retinoic acid

AR 9-cis : Acide Rétinoïque 9-cis

BCR : Breakpoint Cluster Region

CHOP : C/EBP HOmologous Protein

DBD : DNA Binding Domain

DMSO : DiMethyl SulfOxide

DR : Direct Repeat

E1A : Enhancer 1 Adenovirus

ER : Estrogen Receptor

ERG : ETS-Related Gene

EWS : EWing Sarcomas

GR : Glucocorticoid Receptor

hnRNP : heterogeneous nuclear

RiboNucleoProtein

LAM : Leucémie Aiguë Myéloïde

LBD : Ligand Binding Domain

NPM : NucleoPhosMin

NuMA : Nuclar Matrix Apparatus

PCR : Polymerisation in Chain Reaction

PLZF : Promyelocytic Leukemia Zinc Finger

PML : ProMyelocytic Leukemia

RANC : Retinoic Acid-dependent Nuclear Complex

RAR : Retinoic Acid Receptor

RARE : Retinoic Acid Response Element

RGG : Arginine-Glycine-Glycine

RNP-CS : RNP-Consensus Sequence

RRM : RNA Recognition Motif

RT : Reverse Transcriptase

RT-PCR : RT suivie d'une PCR

RXR : Retinoid X Receptor

snRNP : small nuclear RiboNucleoProtein

TAF : TBP Associated Factor

TBP : TATA Binding Protein

TLS : Translocated in LipoSarcomas

TR : Thyroid Receptor

VDR : Vitamin D Receptor

SOMMAIRE

RESUME 1

SOMMAIRE 3

I - INTRODUCTION 4

BUT DU PROJET 9

II - MATERIELS ET METHODES 10

A) MATERIELS : 10

a) Lignées cellulaires : 10

c) Agents inducteurs : 10

d) Plasmides : 10

e) Oligonucléotides : 11

B) METHODES 11

a) Cultures cellulaires 11

b) Préparation de l'ADN plasmidique 11

c) Transfections cellulaires 11

d) Epissage in vivo 12

e) Test de transactivation 13

f) Technique de Western Blot 13

g) Technique du retard sur gel 14

III- RESULTATS 15

1. TLS est un co-activateur du RANC 15

2. TLS fait parti du RANC 17

3. Analyse in vivo de l'activité de TLS et de l'acide rétinoïque sur l'épissage alternatif en 5' de E1A 19

IV - DISCUSSION 23

V - REFERENCES 28

I - INTRODUCTION

Un des principaux thèmes d'études de notre laboratoire concerne l'étude de l'hématopoïèse et des leucémies, dans un but de diagnostic, de pronostic et de ciblage thérapeutique. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent la différenciation des cellules myéloïdes est un élément essentiel.

L'hématopoïèse est un processus actif, hautement régulé, de prolifération et de différenciation des précurseurs et des progéniteurs hématopoïétiques. Au sein du compartiment actif des cellules souches, un programme de différenciation cellulaire se met en place. Dans un premier temps, la cellule souche perd sa capacité d'auto-renouvellement, puis progressivement sa capacité de prolifération. La cellule engagée dans ce processus va s'orienter vers l'une des voies de différenciation hématopoïétique (granulo-monocytaire, mégacaryocytaire, érythroïde ou lymphocytaire).

Les signaux, intra- ou extra-cellulaires, qui mettent en cycle la cellule souche et qui gouvernent secondairement les premières étapes de son déterminisme sont peu connus. Deux modèles sont actuellement proposés pour rendre compte de ce phénomène. Le premier est dit « modèle stochastique » dans lequel ces étapes se font en absence de tout signal extérieur, de façon intrinsèque au programme génétique. Le deuxième modèle est dit « modèle déterministe », où la cellule reçoit de l'extérieur, de façon extrinsèque, un signal qui va déclencher le programme génétique de différenciation. Quel que soit le modèle considéré, ces mécanismes conduisent de façon ultime à l'activation de facteurs de transcription qui activent les gènes responsables de la différenciation cellulaire (Felsenfeld et coll., 1996). C'est vraisemblablement la combinatoire des facteurs de transcription exprimés par la cellule qui va aboutir à l'expression préférentielle des gènes spécifiques de lignée. En d'autres termes, c'est l'expression génique qui influe sur la différenciation.

Il a été démontré que les rétinoïdes stimulaient de façon préférentielle la granulopoïèse (Douer et coll., 1982 ; Gratas et coll., 1993). Les rétinoïdes agissent en se fixant sur des récepteurs spécifiques qui sont les récépteurs nucléaires aux rétinoïdes. Les récepteurs nucléaires (Figure 1) appartiennent à une famille de facteurs de transcription qui régulent l'expression des gènes en fonction de la fixation d'un ligand. Les membres de la superfamille des récepteurs nucléaires incluent les récepteurs aux hormones stéroïdiennes, tels que les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR) et aux oestrogènes (ER), des récepteurs pour des hormones non stéroïdiennes comme le récepteur aux hormones thyroïdiennes (TR), le récepteur à la Vitamine D3 (VDR), les récepteurs aux rétinoïdes, et également des récepteurs pour divers métabolites lipidique comme les acides gras et les prostaglandines (Green et Chambon, 1986).

La superfamille des récepteurs nucléaires comprend également une grande famille de récepteurs dits orphelins lorsque le ligand n'a pas encore été identifié ou n'existe pas.

A

B

C

E/F

AF-1

AF-2

Activation

indépendante du ligand

DBD

Dimérisation

LBD

Activation dépendante du ligand

Dimérisation

D

Figure 1. Structure générale des récepteurs nucléaires

Deux classes de récepteurs aux rétinoïdes ont été identifiées : les récepteurs à l'acide rétinoïque (RAR) et les récepteurs au rétinoïde X (RXR). Trois types de RARs (, et ) codés par des gènes distincts localisés sur des chromosomes différents sont présents chez l'Homme, chez la Souris, puis dans d'autres espèces (Giguère et coll., 1987 ; Petkovich et coll., 1987 ; Krust et coll., 1989 ; Zelent et coll., 1989). Les RARs sont capables de fixer deux métabolites actifs de la Vitamine A, l'acide rétinoïque tout-trans (ATRA) et l'acide rétinoïque 9-cis (Allegretto et coll., 1993 ; Allenby et coll., 1993). La comparaison des séquences protéiques des différents RARs et des autres membres de la superfamille des récepteurs nucléaires a permis de les subdiviser en différents domaines possédant des fonctions distinctes. Ces domaines sont plus ou moins conservés d'un récepteur à l'autre et d'une espèce à l'autre (Kastner et coll., 1994). La deuxième classe de récepteurs aux rétinoïdes, les RXRs, lie spécifiquement et uniquement l'acide rétinoïque 9-cis. Les gènes codant pour les trois types de RXRs (, et ) ont été clonés chez la Souris et chez l'Homme. Dans le domaine d'activation des récepteurs nucléaires, on trouve deux séquences portant des fonctions activatrices : AF-1 (domaine A/B), indépendant du ligand et AF-2 (domaine E/F), dépendant du ligand. Ces deux domaines (mais principalement AF-2) peuvent servir au recrutement des co-activateur et des co-répresseurs (Kastner et coll, 1994). La structure des RARs est divisée en six régions fonctionnelles de A à F alors que les RXRs ne possédent pas de région F. Les différents types de RXRs présentent une forte identité de séquence dans leurs régions C et E, mais diffèrent fortement au niveau de leurs régions A/B et D. Cette différence est ainsi spécifique d'un type donné de RXR (Chambon, 1996).

Les récepteurs nucléaires exercent leur action par différents mécanismes. Ils peuvent activer ou réprimer des gènes cibles en se fixant directement sur des séquences spécifiques d'ADN appelées éléments de réponse sous la forme d'homo-dimère (exemple des récepteurs stéroïdiens et des RXRs) ou d'hétéro-dimères (exemple des RARs, du VDR et des TRs) avec les RXRs comme partenaires. Ou en fixant d'autres classes de facteurs de transcription (Chambon, 1996). Certains récepteurs nucléaires tels que le TR et le RAR, peuvent réprimer des gènes cibles en absence ou en présence du ligand. Ces effets sont liés à l'interaction des récepteurs nucléaires avec des classes de protéines intermédiaires dont la fonction est soit d'activer (les co-activateurs), soit de réprimer (les co-répresseurs) la transcription. Le complexe transcriptionnel des récepteurs nucléaires à l'AR est dénommé RANC. analyse des régions promotrices des gènes cibles de l'acide rétinoïque a permis de décrire des éléments de réponse, les RARE (Retinoic Acid Response Element). Ces éléments de réponse sont constitués de deux séquences hexa-nucléotidiques conservées PuG(C/T)TCA disposées en répétitions directes (DR), en palindromes ou inversées et séparées par un nombre de nucléotides variant de 1 à 5 (Giguère, 1994). Ainsi, un espacement de 1 nucléotides (DR1) entre les deux motifs consensus AGGTCA définit un élément de réponse de l'homo-dimère RXR-RXR, un espacement de 5 nucléotides (DR5) entre les deux motifs aboutit à un RARE.

L'altération de RAR provoque des perturbations au niveau des mécanismes de remodelage de la chromatine. Ces altérations sont dues aux gènes de fusion impliquant le gène RAR lors de translocations chromosomiques responsables de la leucémie aiguë promyélocytaire (LAM3 selon la classification FAB). Il s'agit de la première pathologie maligne humaine répondant à une thérapeutique différenciatrice (pour revue voir Chomienne et coll., 1996 ; Fenaux et coll., 1994). Elle présente ainsi une caractéristique unique par rapport aux autres sous-types de leucémies aiguës (LAM, anomalie de la myélopoïèse).

De façon intéressante, il a été révélée que dans 60% des LAM, TLS, une protéine ubiquitaire, était très fortement exprimée (Aman et coll., 1996). D'autre part, des interactions directes entre TLS et le récepteur aux rétinoïdes RXR ont été démontrées (Power et coll., 1998). Ces deux observations nous incitées à étudier les liens éventuels entre TLS et les voies de signalisation aux rétinoïdes dans un contexte hématopoïétique normal et altéré.

Le gène TLS fut, en effet, d'abord identifié dans une tumeur maligne à partir de la translocation t(12;16) comme gène codant pour la partie N-terminale de TLS/CHOP, une oncoprotéine de fusion qui est exprimée invariablement associée au liposarcome myxoïde humain (Crozat et coll., 1993 ; Rabbits et coll., 1993). D'autres translocations chromosomiques (à l'origine de sarcomes humains et de leucémies), fusionnent soit TLS soit un gène similaire, EWS à un grand nombre de facteurs de transcription (Zinszner et coll., 1994). Le point commun de ces diverses oncoprotéines de fusion est la présence du domaine N-terminal de TLS ou de EWS. Ce domaine joue un rôle essentiel dans la transformation confirmé par des expériences de transformation utilisant des lignées de souris (Ichikawa et coll., 1999) ou des cellules normales hématopoïétiques (Pereira et coll., 1998).

De nombreuses expériences ont permis de mettre en évidence certains rôles de TLS, notamment la réalisation de deux lignées de souris nullizigotes pour TLS. Les souris homozygotes portant une mutation induite de TLS sont stériles avec une importante augmentation d'axes chromosomiques non appariés ou mésappariés dans les spermatocytes préméïotiques. Ces résultats montrent un rôle de TLS dans l'appariement de l'ADN homologue et dans la recombinaison. L'analyse de ces Souris indique que TLS est essentielle pour la survie du nouveau-né, influence le développement lymphocytaire, a un rôle dans la réponse proliférative des lymphocytes B à des stimuli mitogènes, et est nécessaire pour le maintien de la stabilité génomique (Hicks et coll., 2000). La capacité de TLS à se lier à l'ADN est entre autre induite par sa phosphorylation par la PKCII qui est permise par l'activité tyrosine kinase de BCR/ABL. Ces résultats suggèrent que TLS joue un rôle de régulateur dans la leucémogénèse causée par BCR/ABL, favorisant l'indépendance envers les facteurs de croissance et empêchant la différenciation, en modulant l'expression de récepteurs de cytokines (Perroti et coll., 1998) confirmant que sa surexpression dans les LAM puissent être une des causes des désordres observés.

TLS interagit aussi avec l'ARN polII par son domaine N-terminal et est impliquée dans la formation du complexe TFIID. Il pourrait ainsi agir comme un régulateur de la transcription basale participant à la reconnaissance de promoteur transcriptionnel et à l'initiation de la transcription (Yang et coll., 2000). De plus, TLS interagit avec RXR et TR par leur domaine N-terminal (Powers et coll., 1998). Des facteurs d'épissage interagissent aussi avec TLS, l'impliquant dans ce mécanisme. TLS interagit avec Spi-1/PU.1 une protéine ETS capable de réguler la transcription et la maturation ARN dans les cellules myéloïdes (Hallier et coll., 1998). Trois protéines SR, SC35, TASR-1 et TASR-2 interagissent avec TLS par son domaine C-terminal.

Figure 2 . TLS est une hnRNP et fait partie de la famille de EWS et hTAFII68.

L'étude de TLS a permis de préciser sa structure (Figure 2). TLS appartient à une famille de protéines incluant EWS (Delattre et coll., 1992) et TAFII68 (Bertolotti et coll., 1996). Le domaine N-terminal des protéines de cette famille est riche en glutamine, sérine et tyrosine, qui sont les acides aminés trouvés dans les domaines d'activation de la transcription. Dans des chimères oncogèniques, l'addition du domaine N-terminal de TLS aux régulateurs transcriptionnels CHOP, FLI-1 ou ERG-1 génère des protéines dont l'activité transcriptionnelle diffère de celle de ces constituants respectifs. De plus, le domaine N-terminal de TLS présent dans ces chimères peut avoir un effet dominant négatif sur la fonction de TLS (provenant de la lignée germinale) comme suggère la récente identification de déterminants oncogéniques dans le domaine N-terminal de TLS. Le domaine C-terminal contient plusieurs motifs : une séquence consensus de ribonucléoprotéine (RRM : ou RNP-CS), des répétitions arginine-glycine-glycine (RGG 2/3), étant la signature des protéines de liaison à l'ARN (Burd et coll., 1994) et un doigt de zinc C₂C₂. TLS lie l'ARN in vivo ou in vitro (Zinszner et coll., 1997b). In vitro, les ARNs sélectionnés par TLS partagent un motif GGUG. TLS reconnaît un ARN contenant ce motif dans un extrait cellulaire. Chacun des domaines de liaison à l'ARN (les trois boîtes RGG et le motif de reconnaissance de l'ARN) contribuent à la spécificité de l'interaction TLS-ARN (Lerga et coll., 2001). TLS est aussi appelée FUS ou hPOMp75. Cette dernière dénomination a été donnée lorsqu'il fut montré que TLS se lieny à l'ADN simple et double brins. TLS favorise l'hybridation de brins complémentaire d'ADN et l'incorporation d'un oligonucléotide d'ADN simple brin dans une super hélice d'ADN pour former une « D-loop », suggérent que TLS soit impliquée dans la recombinaison homologue (Baetchtold et coll., 1999).

Figure 3. Réaction de transestérification dans le mécanisme de l'épissage de l'ARN pré-m.

Chez les Eucaryotes supérieurs, l'expression génique implique la transcription, le « 5' capping », l'épissage de l'ARN pré-m, le « 3' processing », l'exportation de l'ARNm et éventuellement la traduction dans le cytoplasme (Misteli et coll, 2000). L'épissage (dérivation d'un terme de marine qui signifie mettre bout à bout les extrêmités de deux cordages) consiste en une réaction de transestérification éliminant certaines séquences d'un ARN pré-m (les introns) et en laissant d'autres séquences (les exons). Des séquences consensus ont été identifiées aux jonctions exons/introns, elles sont définies comme les sites d'épissage donneur en 5' de l'intron (dinucléotide GU), et accepteur, à l'extrêmité 3' de l'intron (dinucléotide AG) (Breatnach et Chambon, 1981). Les fonctions des snRNA U1, U2, U4, U5, et U6 dans l'épissage sont liées à leur inclusion au sein de complexes composés de snRNA et de nombreuses autres protéines, appelées les snRNP. L'agencement des cinq snRNP avec une cinquantaine de protéines sur la matrice de l'ARN pré-m constitue un complexe ribonucléoprotéique dynamique, le « spliceosome ». Les protéines SR participent à ce complexe, ce sont des facteurs d'épissage essentiels caractérisés par un motif riche en dipeptide sérine-arginine ayant un rôle dans la définition des exons et la sélection des sites alternatifs d'épissage (Valcarcel et coll., 1996). Enfin, la capacité à sélectionner différentes combinaisons d'exons lors de l'épissage, afin de générer des protéines de fonctions distinctes. Ce phénomène d'épissage alternatif est indispensable au développement de nombreux organismes. Environ 60% des gènes seraient exprimés selon un tel mécanisme (Croft et coll., 2000).

TLS fait partie de la famille hnRNP. Et elle a été identifiée comme la hnRNP p2 dans un complexe protéique assemblé sur l'ARN pré-m des adénovirus. TLS est engagée dans un complexe avec les hnRNPs A1 et C1/C2 et associée avec plusieurs snRNP du « spliceosome ». TLS est complexée avec des transcrits de l'ARN polII dans des extraits de cellules de HeLa irradiées (Perroti et coll., 1998). En outre, un inhibiteur de l'ARN polII induit la relocalisation de TLS du noyau au cytoplasme, dépéndant de la présence de son domaine C-terminal. Toutes ces proptiétés sont caractéristiques des hnRNPs. TLS fut trouvée associée avec le dinucléotide AG durant l'étape de reconnaisance du site 3' d'épissage et participe à la sélection du site 5' d'épissage alternatif dans l'ARN pré-m du minigène E1A. TLS peut recruter par son domaine C-terminal, deux régulateurs d'épissage de la famille des protéines SR. Ainsi, TLS est un de facteur d'épissage.Lorsqu'elle est surexprimée dans des cellules érythroïdes, TLS induit de préférence l'utilisation du site 5' distal d'épissage, durant la maturation de l'ARN pré-m de E1A (Hallier et coll., 1998). Cette préférence est contrebalancée par Spi-1, suggérant que TLS peut faire partie d'un réseau de protéines impliquées dans la régulation de la maturation ARN.

Plusieurs pathologies liées à des altérations de l'épissage ont été caractérisées. Certaines affections comme les amyotrophies spinales héréditaires ou les maladies neurodégénératives liées à la protéine tau, représentent de véritables problèmes de santé publique et donnent lieu à des coopérations fructueuses entre laboratoires hospitaliers et universitaires (Philips et Cooper, 2000). Pour exemple de pathologies impliquant l'épissage alternatif, on retrouve Spi-1/PU.1 dans l'érythroleucémie de Friend et CD44 dans certaines transformations tumorale (Stickeler et coll., 1999).

Le rôle de TLS dans la régulation transcriptionnelle n'est pas encore clairement élucidé. TLS augmente la transactivation dirigée par NFB induite par des stimuli physiologiques tels que le TNF, IL-1 et la surexpression d'une kinase induisant NFB. TLS augmente l'activité du promoteur NFB-dépendant d'un gène d'adhésion intercellulaire et du gène de l'IFN. Ces résultats suggèrent que TLS agit comme un co-activateur de NFB (Uranishi et coll., 2001).

BUT DU PROJET

Le fait que TLS soit surexprimée dans 60% des LAM et qu'il interagisse avec RXR, l'un des principaux partenaires du RANC, nous permet d'émettre l'hypothèse que TLS serait liée à la voie de signalisation de l'AR dans les cellules hématopoïétiques. Nous nous proposons d'étudier deux fonctions de TLS qui pourraient être mises en jeu dans les LAM, en tant que co-activateur de la transcription et son rôle de facteur d'épissage. L'action de TLS (en présence d'AR) comme co-activateur de la transcription est testée dans deux modèles cellulaires, HL-60 et Cos-6, par le dosage de l'expression d'un gène cible sous la dépendance d'un promoteur fixant le RANC. L'appartenance de TLS au RANC est observée par la mise en présence du RANC (RAR, RXR, DR5 avec ou sans AR) et de TLS. L'effet de TLS et de l'AR sur l'épissage sont analysés qualitativement par l'obtention de profil d'épissage alternatif du minigène E1A et l'étude quantitative des isoformes produites.

II - MATERIELS ET METHODES

A) MATERIELS :

a) Lignées cellulaires :

Trois lignées cellulaires ont été utilisées :

- La lignée HL-60 fut obtenue à partir de cellules d'un patient atteint d'une leucémie aiguë myéloblastique de type 2 selon la classification FAB (French-American-British). Les cellules HL-60 ont la caractéristique d'être bi-potentielles, c'est à dire de se différencier soit vers la voie granulocytaire, soit vers la voie monocytaire, selon que l'ATRA ou la VD3 sont utilisées (Breitman et coll., 1980).

- La lignée K562 fut obtenue à partir de cellules d'un patient atteint d'une leucémie chronique myéloïde. La population cellulaire a été identifiée comme indifférenciée et de série granulocytique.

- La lignée Cos-6 provient d'un rein de Singe.

b) Anticorps :

Plusieurs anticorps ont été utilisés : l'anticorps monoclonal de Souris anti-myc (anti myc-TLS, IgG1, Kappa, Roche Molecular Biochemicals), l'anticorps polyclonal de Lapin Anti-RXR (RXR 444, don de Cécile Rochette-Egly et Pierre Chambon), l'anticorps polyclonal de Lapin Anti-RAR  (RAR 115, don de Cécile Rochette-Egly et Pierre Chambon) et l'anticorps polyclonal de Lapin Anti-TLS (don de Françoise Moreau-Gachelin).

c) Agents inducteurs :

L'ATRA (Hoffmann La Roche) est dissout dans le DMSO à une concentration de 10^-2 M, conservé à -80°C à l'abri de la lumière, dilué dans du RPMI pour obtenir une concentration de 10^-4 M, stocké à -20°C et utilisé dans les milieux de culture à la concentration finale de 10^-6 M. L'AR  9-cis est réalisé de la même façon et utilisé à la concentration finale de 10^-6 M.

d) Plasmides :

- Le plasmide Tkgal est un plasmide dans lequel est cloné l'ADNc de la -galactosidase sous le contrôle d'un fragment délété du promoteur TK du virus de l'Herpès (don de H. de Thé).

- Le plasmide RARE est un plasmide pXp2, dans lequel l'ADNc de la luciférase est sous le contrôle du promoteur du gène RAR2 (inséré en amont du promoteur, don de H. de Thé).

- Le vecteur d'expression pCS3-MT (Myc-Tag) contient le promoteur/enhancer du cytomégalovirus simien IE94, le promoteur SP6 et six copies de l'épitope Myc 9E10 (don de Françoise Moreau-Gachelin).

- pCS3-MT-TLS code pour une protéine contenant l'épitope Myc et les acides aminés de TLS de 1-526 (don de Françoise Moreau-Gachelin).

- pCS3-MT-E1A fut généré par insertion du fragment EcoRI-XbaI de E1A du plasmide Sp4 dans le site EcoRI-XbaI du vecteur pCS3-MT (don de Françoise Moreau-Gachelin).

- Le pSG5-hRAR et le pSG5-mRXR sont des plasmides d'expression contenant l'ADNc des récepteurs nucléaires RAR et RXR (don de Cécile Rochette-Egly et Pierre Chambon).

- Le CMV-luc est un plasmide puC18 de 6 kb, sans "polylinker", dans lequel est cloné l'ADNc du gène luciférase sous le contrôle du promoteur du cytomégalovirus, qui est un promoteur fort (don de H. de Thé).

e) Oligonucléotides :

Dans la technique de retardement sur gel :

DR5: 5'-GATCAGGGTTCACCGAAAGTTCACTCGCATATATTAG-3' (Eurogentec).

Dans la technique de RT : amorce RT : 5'-GGAGAGCTTGGGCGACC-3 ' (Genset).

Dans la technique de PCR : amorce PCR-E1A : 5'-ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3': (Genset).

B) METHODES

a) Cultures cellulaires

Les cellules de lignées HL-60 et K562 sont ensemencées à la concentration de 3x10⁵ cellules par ml et les cellules Cos-6 à la concentration de 4x10⁵ cellules par ml.

Les cellules HL-60 et K562 sont cultivées en RPMI 1640, additionné de sérum de veau foetal (SVF, décomplémenté par la chaleur (20 min. à 56°C)) respectivement à 15 et 10 %, de glutamine 2 mM et de Pénicilline/Streptomycine à 100 ug/ml. Les cellules sont maintenues en phase exponentielle de croissance par une dilution, deux fois par semaines.

Les cellules adhérentes Cos-6 sont cultivées en DMEM, additionné à 6 % de SVF, de glutamine 2 mM et de Pénicilline/Streptomycine à 100 ug/ml. Les cellules sont maintenues en phase exponentielle de croissance par une dilution, deux fois par semaines, après un lavage avec le milieu sans sérum et un décollement par deux fois une addition de 1 ml de trypsine pendant 5 min. à 37°C.

b) Préparation de l'ADN plasmidique

L'ADN plasmidique est obtenu par culture de bactéries préalablement transformées par les plasmides d'intérêt, dans du milieu LB plus ampicilline 1X. L'ADN plasmidique est préparé selon le protocole de purification plasmidique (Plasmid Purification, Qiagen). Il subit ensuite une précipitation au chlorure de césium, cette étape augmente la pureté de l'ADN mais n'est pas obligatoire. La qualité de cet ADN est analysée par spectrophotométrie pour évaluer la quantité et par migration sur gel d'agarose 1 % pour évaluer la qualité.

c) Transfections cellulaires

1) Transfection transitoire de cellules Cos-6 par phosphate de calcium

Vingt quatre heures avant la transfection, les cellules sont mises dans des puits de culture de 6 cm de diamètre à une concentration de 600000 dans 5 ml de milieu. Le jour suivant, le milieu est remplacé par 4 ml de milieu frais. Une solution de 1 ml contenant 5 à 30 ug d'ADN plasmidique dans 450 ul de H₂O, 50 ul de CaCl₂ (2,5 M) et 500 ul de HBS 2X (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄ 12 mM, Glucose 12 mM, Hépès 50 mM) préalablement incubée 30 min. à température ambiante est ajoutée sur les cellules. Elles sont remises dans l'étuve 12 heures, puis lavées au PBS 1X. Du milieu frais est ajouté et ainsi que le ligand, éventuellement. Les cellules sont de nouveau incubées de 24 heures pour un dosage de la luciférase à 2 jours pour une extraction protéique à 37°C. Avant l'extraction des protéines, les cellules sont lavées au PBS 1X.

2) Transfection transitoire de cellules HL-60 par électroporation

Les cellules sont passées la veille à la concentration habituelle correspondant au type cellulaire et les cuves à éléctroporation sont préalablement refroidies à 4°C. Chaque cuve est utilisée pour 30x10⁶ cellules. Trois heures avant la transfection, les cellules sont mises à 1x10⁶ par ml puis incubées à 37°C. Puis elles sont centrifugées, lavées et regroupées à 4°C dans un volume d'OPTIMEM-1 équivalent à 10 ml pour 100x10⁶ cellules. Elles sont ensuite reprises dans un volume contenant 100 ul d'OPTIMEM-1 par cuve. Après en avoir placé 100 ul dans chaque cuve, le mélange est incubé pendant 10 min. à 4°C. Les cellules sont ajoutées dans les cuves, à une solution plasmidique contenant 100 ul d'OPTIMEM-1 par cuve. L'électroporation est effectuée dans un électroporateur dont les paramètres sont : C= 960 uF et V=250 V, elles sont ensuite mises à incuber à température ambiante pendant 30min. Les cellules sont récupérées avec 1 ml de milieu complet préalablement chauffé à 37°C. Les cellules sont incubées à 37°C pendant trois heures, puis remises en culture.

3) Transfection transitoire de cellules K562 par la lipofectamine

L'ADN plasmidique est préparé dans un volume de 100 ul par puits avec 5 % de lipofectamine plus et complété par 95 ul d'OPTIMEM-1 qui est laissé incubé pendant 15 min. Une solution de 12,5 ul de lipofectamine et de 87,5 ul d'OPTIMEM-1 par puits est préparée. Les deux solutions sont mélangées dans des tubes stériles en polypropylène, en ajoutant la solution plasmidique goutte à goutte. Ce mélange est incubé une heure à température ambiante. Les cellules sont conditionnées au nombre de 2x10⁶ par puits dans 0,8 ml d'OPTIMEM-1 (la concentration initiale des cellules dans leur milieu était de 500000 par ml) et incubées une heure à 37°C. Les 200 ul préparés sont déposés goutte à goutte dans chaque puits. Puis les cellules sont incubées deux heures à 37°C et enfin 3,5 ml de milieu sont ajoutés et le ligand éventuellement.

d) Epissage in vivo

Les cellules sont récoltées 24 heures après la transfection. La co-transfection avec le plasmide pCMV-luciférase permet la standardisation de la RT en fonction des différences observées dans l'efficacité de transfection. Une fraction aliquotée de ces cellules est utilisée pour mesurer l'activité luciférase et le reste est utilisé pour effectuer une extraction totale des ARNs. Les ARNs totaux sont préparés à partir des cellules en utilisant le protocole de purification d'ARN et d'après les instructions du fournisseur (RNeasy, Qiagen) et traité deux fois par la Dnase I (Qiagen). La qualité des ARNs obtenus est observée par migration sur un gel d'agarose dénaturant. Les isoformes de l'ARN E1A sont analysées par RT-PCR comme décrit précédemment (Hallier et coll., 1998). Un microgramme d'ARN est rétro-transcrit par la SuperscriptII transcriptase reverse du virus de la leucémie murine de Moloney (Gibco-BRL) en présence de 50 uM de dNTP et 2 picomoles du primer 3'RT E1A dans une solution de 8 ul. Environ un dixième de l'ADNc est utilisé pour la réaction d'amplification (PCR) réalisée avec la Taq polymérase ADN (Perkin Elmer) en présence de l'amorce 5'E1A marquée à son extrémité 5' par la T4 polynucléotide kinase (Boehringer) et de l'ATP P³² (Amersham) comme précédemment décrit (Hallier et coll., 1998). Le minimum de cycles PCR est utilisé (18 à 22 cycles) afin de détecter le signal dans une fenêtre de détection adéquate. Les réactions de contrôle de la RT-PCR contiennent une matrice ARN n'ayant pas subi de transcription inverse. Les produits de la RT-PCR de E1A sont mis à migrer sur un gel de polyacrylamide/urée 6 % dénaturant, autoradiographiés et quantifiés avec un système Biorad.. L'expression des protéines codées par les plasmides est vérifiée par la technique du Western Blot effectuée sur des échantillons de cellules transfectées d'où viennent les ARNs totaux.

e) Test de transactivation

La veille de la transfection, les cellules Cos-6 sont mises en puits, dans 5ml de DMEM-6% SVF décomplémenté à raison de 0,6x10⁶ par puits. Le jour suivant, le milieu est changé pour 4 ml de milieu frais. Dans chaque puits, sont ajoutés une solution de 1 ml préalablement incubée à température ambiante comprenant une solution plasmidique (TKGal, RARE-Luciférase,...), 450 ug d'eau bi-distillée en plus de 50 ul de CaCl₂ (2,5 M) et 500 ul de HBS 2X (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na₂HPO₄ 1,2 mM, Glucose 12 mM, Hépès 50 mM).

Les cellules HL-60 sont électroporées avec une solution plasmidique équivalente.

Après une incubation de 12 heures à 37^oC, les cellules sont lavées 2 fois au PBS 1X. Un tampon de lyse (200 ul) est ajouté dans chaque puits et les cellules sont décollées à l'aide d'un grattoir. Les cellules sont récupérées dans des tubes Eppendorff, vortexées et centrifugées 2 min. à 12000g et à 4^oC. L'activité de la luciférase (selon le protocole de Luciferase Assay System, Promega, Madison, EUA) dans le lysat est mesurée dans un luminomètre et exprimée en unité arbitraire. L'activité de la -Galactosidase (selon le protocole de BM Chemiluminescence ELISA Substrate -Gal, Boehringer Mannheim, Mannheim, République Fédérale d'Allemagne) est également mesurée afin de normaliser les mesures obtenues de l'activité luciférase.

f) Technique de Western Blot

Des extraits protéiques totaux sont réalisés. Les cellules sont lavées deux fois au PBS 1X, le culot est repris dans 300ul de tampon d'extraction (Hepès 20 mM pH 8, NaCl 450 mM, EDTA 0,4 mM et glycérol 25%) contenant des inhibiteurs de protéases (pepstatine, leupeptine, aprotinine). Pour la lyse des cellules, trois bains successifs dans l'azote et à 37°C sont effectués. Après centrifugation (15min. à 14000 rpm), le surnageant correspondant à l'extrait total est prélevé, constitué en fractions aliquotes et congelé à -80°C.

Après une dénaturation de 10 min. à 100^oC, les échantillons de protéines sont déposés sur un gel dénaturant d'acrylamide 12 %. La migration se fait en 2 étapes, tout d'abord à 80 V pendant 15 min. puis à 125 V pendant une heure. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert à 600 mA pendant 60 min. au froid. Pour utiliser les anticorps anti-RAR et anti-RXR, la membrane est lavée deux fois avec du PBS 1X puis saturée avec du lait 5 % pendant 2 heures à température ambiante. Durant toute la nuit, la membrane est incubée à 4^oC avec l'anticorps primaire anti-RAR dilué au 1/100^è et anti-RXR dilué au 1/100^è. Lavée 5 fois 10 min. avec du PBS 1X, la membrane est re-saturée avec du lait (2,5 %) pendant 10 min. puis incubée avec l'anticorps secondaire pendant 30 min. (Protéine A diluée au 1/10000^è). Puis, 5 lavages sont effectués au PBS 1X contenant 0,01 % de Tween.

Pour l'anticorps anti-myc, la membrane est saturée avec du PBS Tween 20 à 0,1 % pendant 2 heures à température ambiante. Plusieurs lavages au PBS Tween sont faits pendant deux min. La membrane est incubée à 4^oC toute la nuit avec l'anticorps primaire anti-myc dilué au 1/10000^è. Lavée plusieurs fois pendant 5 min. avec 500 ml de PBS Tween, la membrane est incubée avec l'anticorps secondaire pendant une heure (anti-kappa de souris dilué au 1/1500^è). Puis les membranes sont lavées avec 1l de PBS Tween pendant au moins trois fois 15min..

Enfin, la membrane est mise en présence d'une solution de détection (ECL, Amersham, Piscataway, NJ, EUA) durant une minute. La radiographie est faite en exposant un film à des temps variables (Hyperfilm ECL, Amersham, Piscataway, NJ, EUA).

g) Technique du retard sur gel

La sonde DR5, qui correspond à l'élément de réponse RARE du promoteur de RAR, est marquée à son extrémité 5' en incubant pendant 60 min. à 37^oC: 30 ng de la sonde, du tampon kinase 10X, 3 l d'ATPP³², 1 l de T4 polynucléotide kinase (5 unités). Après avoir purifié la sonde marquée sur une colonne (centri.spin-40, préalablement hydratée avec 0,5 ml de tampon TE 1X pendant 30 min. et centrifugée 2 min. à 700 g à température ambiante) en la centrifugeant 2 min. à 700 g à température ambiante, le contrôle de l'activité spécifique est réalisé grâce à un compteur à scintillation. La sonde double brin est élaborée en ajoutant à la sonde marquée 60 ng du brin complémentaire, du tampon kinase 10X et 150 mM de NaCl. La solution est dénaturée à 100^oC puis progressivement refroidie à 37^oC.

Les extraits protéiques et les anticorps sont incubés 20 min. sur la glace avec une solution contenant 2 ul de tampon Darnell (KCl 400 mM, Hepès 200 mM, MgCl₂ 10 mM, EGTA 1 mM, DTT 5 mM, Ficoll 4%, pH 7,5), 1 ul de poly dI-dC (1 ug/ul) et 40000 cpm de la sonde radiomarquée. Les extraits sont ensuite déposés sur un gel de polyacrylamide 4 % et migrés à 200 V durant 82 min. Le gel est séché à vide pendant 120 min à 80°C. Une autoradiographie est réalisée avec un écran amplificateur en présence d'un film Kodak X-Omat AR à -80⁰C durant 12 heures.

III- RESULTATS

1. TLS est un co-activateur du RANC

Premièrement, nous avons analysé l'effet d'une surexpression transitoire de TLS sur l'expression d'un gène rapporteur (luciférase) sous le contrôle du promoteur RARß2 (Figure 4A). Nous avons utilisé comme modèle cellulaire les cellules hématopoïétiques HL-60. Ces cellules sont électroporées en présence de Tkßgal, pour évaluer l'efficacité de transfection et normaliser les résultats, de ßRARE-luc, utilisé comme gène rapporteur pour évaluer l'activité transcriptionnelle et de différentes quantités de vecteur d'expression de TLS, comme indiquées. pCS3, un plasmide contrôle est utilisé de telle façon que toutes les transfections aient la même quantité totale de plasmide d'expression (Figure 4). Les cellules sont récoltées 24 h après et l'activité luciférase est mesurée. Les valeurs représentent les moyennes des doublets réalisés. Des résultats similaires furent obtenus dans plusieurs expériences indépendantes.

Les résultats exprimés correspondant à l'augmentation de l'activité de la luciférase par rapport à un témoin négatif (cellules transfectées avec pCS3 seul, en absence de ligand).

Lors de la transfection en présence d'AR seul (1'), une augmentation de l'activité luciférase est observée. La co-transfection par pCS3-MT-TLS seul et RARE-luc (2 et 3) n'a pas d'effet sur l'induction de l'activité luciférase, sauf en présence d'AR (ATRA 10^-6 M) (2' et 3', multiplié par 25, en présence de 5 ug et 10 uG de TLS (Figure 4B). Ces résultats suggèrent que TLS augmente l'activité transcriptionnelle induite par les récepteurs endogènes dans les cellules HL-60.

Afin de déterminer que la co-activation par TLS agit par et grâce au RANC, nous avons utilisé des cellules Cos-6 possédant peu de récepteurs aux rétinoïdes endogènes que nous avons transfectées avec les plasmides d'expression de RAR et de RXR. Les cellules Cos-6 sont donc co-transfectées au chlorure de calcium avec les plasmides TKgal et RARE, comme décrit précédemment.

Figure 4 . TLS augmente l'activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires à l'acide rétinoïque dans les cellules HL-60. A, schéma descriptif de la construction utilisée dans le test de transactivation. B, L'activation transcriptionnelle du RARE a lieu avec l'AR seul ou avec TLS de façon dépendante de l'AR dans les cellules HL-60.

Dans la Figure 5, les contrôles (1 et 4) indiquent la transactivation basale du gène rapporteur. Lors de la transfection en présence d'AR seul (1' et 4', multiplié par 40) ou avec TLS (2', 3', 5', 6' et 7'), une induction est observée. L'induction est optimale avec 2 ug de TLS (3' et 5', multiplié par 85). TLS est donc un co-activateur du complexe transcriptionnel des récepteurs RAR et RXR, dépendant de l'AR. A des quantités plus importantes, 5 ug et 10 ug de TLS (6' et 7'), une diminution de l'induction en présence d'AR, inférieure au niveau atteint en absence de TLS, est observée. Cette diminution pourrait être dû à un effet de « quenching » ou à l'effet de TLS qui, en grandes quantités, empêcherait RXR de se lier à l'ADN.

L'ensemble de ces résultats indiquent que la protéine TLS est un co-activateur de la transcription par les récepteurs à l'AR. TLS semble donc impliquée dans la voie de signalisation de l'AR.

Figure 5 A et B. TLS agit comme co-activateur du RANC, de façon dose dépendante. Les deux expériences sont réalisées indépendamment.

2. TLS fait parti du RANC

L'effet de TLS sur la transcription passant par la voie de signalisation de l'AR suggère que TLS puisse faire partie du RANC, comprenant les récepteurs nucléaires. Afin de déterminer l'appartenance de TLS au RANC, des expériences de retard sur gel ont été réalisées.

Des extraits protéiques de Cos-6 transfectés par chlorure de calcium avec les plasmides d'expression de RAR, RXR et TLS sont utilisés dans les expériences de retard sur gel.

Ces extraits protéiques totaux de Cos-6 sont préalablements vérifiés par Western Blot après immunoblotting avec des anticorps spécifiques, dont l'anti-myc pour la protéine étiquetée TLS (Figure 6).

Figure 6 : Analyse par Western Blot de l'expression protéique des Cos-6 transfectées

La technique de retard sur gel est réalisée avec les extraits protéiques totaux testés précédemment en présence ou en absence de TLS (Figure 7).

RXR RAR

DR5

Figure 7. schéma descriptif de la construction utilisée dans le retard sur gel et de la fixation du RANC

Le signal en 1 correspond à la fixation de RAR et RXR sur le DR5. Le complexe observé est ainsi constitué des récepteurs nucléaires et est appelé RANC. Le signal 2 indique que RXR en fait partie. L'intensité et le retard des bandes 3 et 4 indiquent que TLS fait partie du RANC. A partir de 1 ul (bande 4), plus la quantité de TLS est augmentée, plus le complexe semble déstabilisé (bande 5 et 6). La quantité maximale de TLS pour sa participation au RANC est de 1 ul d'extraits protéiques totaux. Au delà de cette confirmation et en moyennant des expériences de contrôles des phénomènes de compétition ou d'allostérie, TLS pourrait interférer avec le complexe, pouvant empêcher RXR de se lier à l'ADN.

En conclusion, ces résultats préliminaires suggèrent fortement que TLS augmenterait la transcription de gènes cibles de l'AR de manière dépendante du ligand dans les cellules myéloïdes et que ceci serait lié à une participation directe de TLS dans le complexe transcriptionnel RANC. Les expériences dans les cellules Cos-6 montrent que cette régulation par TLS et l'AR pourrait être un phenomène général.

Figure 8. Retard sur gel réalisé avec RAR et RXR, en présence ou absence de TLS.

L'effet de la dose de TLS sur le RANC est déterminé.

3. Analyse in vivo de l'activité de TLS et de l'acide rétinoïque sur l'épissage alternatif en 5' de E1A

A la lumière des résultats obtenus, il est clair que TLS agit sur la voie de signalisation aux rétinoïdes au moins par son activité transcriptionnelle.

Etant donné que TLS peut jouer un rôle de facteur d'épissage en favorisant la sélection du site 5' distal d'épissage de l'ARN pré-m du minigène E1A dans les cellules érythroïdes murines IW1-32, nous avons étudié le rôle de TLS sur l'épissage de l'ARN pré-m du minigène E1A dans un modèle hématopoïétique humain, la lignée myéloïde K562.

L'ARN pré-m E1A contient des sites 5' d'épissage qui mènent à la formation de plusieurs isoformes principales d'ARN (dont les 13S, 12S et 9S). Ces isoformes peuvent être mises en évidence et quantifiées par PCR à l'aide d'amorces spécifiquements choisies (Figure 9).

Figure 9. Représentation schématique de l'épissage alternatif des transcrits de E1A. Les isoformes de l'ARN pré-m de E1A et la taille correspondante des produits de RT-PCR sont montrés. Les amorces pour l'analyse en RT-PCR sont indiquées par des flèches.

Afin d'étudier le rôle éventuel de TLS ou de l'AR sur l'épissage en 5' du minigène E1A, nous avons co-transfecté transitoirement les cellules K562 par la lipofectamine avec les plamides d'expression de E1A, de pCS3 (pour uniformiser les quantités de plasmide utilisés), de TLS (les quantités utilisées sont indiquées) et de CMV-luc (pour mesurer l'efficacité de la transfection). Lorsque la luciférase s'exprime, les ARNs sont extraits, puis rétrotranscrits. Puis une PCR est réalisée. La détection des produits de PCR est faite après séparation sur un gel PAGE-urée par autoradiographie (Figure 10). Enfin, l'analyse quantitative des résultats est obtenu par le système Molecular Analyst de Biorad (Figure 11).

Après s'être assuré de l'efficacité de la transfection, il convient d'obtenir les conditions expérimentales adéquates pour s'assurer de la détection de toutes les isoformes. Il s'agit de faire varier soit la quantité de produits de RT utilisé pour la PCR, soit le nombre de cycles de la PCR, soit l'exposition de l'autoradiographie. Chaque expérience est faite en doublet et reproduite pour s'assurer de la reproductibilité des résultats obtenus. L'étude est basée sur le choix du site 5' d'épissage du minigène E1A que l'on déduit de l'expression en pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S. Il est, de plus, impératif de visualiser une bande correspondant à la forme non épissée de E1A pour que les résultats soient interprétables.

En comparant les résultats sans AR (1) aux résultats avec l'AR (2), il est possible d'affirmer, sous réserve de contrôles supplémentaires (entre 40 et 60 % de 9S) qu'il ne semblerait pas que l'AR seul ait un effet significatif sur l'épissage de E1A dans K562.

Par contre, les résultats en présence de TLS sont reproductibles et confirment que dans les cellules K562, la protéine TLS permet un épissage préférentiel de l'isoforme 9S au détriment des isoformes 13S et 12S. Ce phénomène serait augmenté en présence d'AR. Les résultats (3) montrent que TLS seule favorise la formation de l'isoforme 9S (75 % de 9S), alors que lorsque l'AR est utilisé avec TLS, l'isoforme 9S est considérablement augmentée (90 % de 9S).

Ces résultats indiquent que TLS agit sur la sélection du site 5' distal d'épissage, favorisant la formation de l'isoforme 9S du minigène E1A, phénomène accentué par l'AR. Ainsi, ces résultats suggèrent que TLS agit sur l'épissage dans les cellules hématopoïétiques humaines et que l'AR intervient sur l'épissage à travers TLS.

En conclusion, ces résultats montreraient pour la première fois que l'AR serait impliqué directement dans le contrôle post-transcriptionnel à travers la protéine TLS.

Figure 10. L'épissage alternatif in vivo du minigène E1A dans les cellules K562.

L'intensité des bandes correspondant aux différentes isoformes de E1A pour chaque profil est quantifiée par densitométrie. Les résultats sont exprimés en pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S. Les études sont faites en doublets. Le RT- représente le contrôle négatif de la RT, elle a été réalisée sans enryme RT et aucun ADN n'est révélé. Les ARNs extraits et utilisés sont ainsi exempts d'ADN.

Figure 11. Quantification des isoformes des ARN pré-m de E1A par un logiciel Molecular Analyst de Biorad . Le pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S est représenté.

IV - DISCUSSION

Ces travaux de recherche concernent l'étude du rôle de TLS dans les voies de signalisation de l'acide rétinoïque. TLS est une protéine bi-fonctionnelle dans le mécanisme d'action de l'AR au niveau de la régulation transcriptionnelle et de la régulation post-transcriptionnelle par l'AR. En effet, des expériences de transactivation et de retard sur gel mettent en évidence que TLS participe au complexe transcriptionnel de l'hétérodimère RXR-RAR, appelé RANC permettant d'augmenter la transactivation dépendante de l'AR sur les promoteurs de gènes cibles. Dans un premier temps, des techniques de transfection transitoire dans des cellules Cos-6 et dans les cellules myéloblastiques HL-60 démontrent que TLS est capable d'augmenter l'activité transcriptionnelle du promoteur naturel de RAR sensible à l'action de l'acide rétinoïque en présence d'acide rétinoïque. Il avait été précédemment mis en évidence que TLS possédait une activité transcriptionnelle per se. En effet, la partie N-terminale de TLS impliquée dans la protéine de fusion TLS/ERG est considérée comme un pré-requis pour le facteur de transcription ERG altéré dans son potentiel leucémogène en augmentant son activité transcriptionnelle et/ou en changeant sa spécificité au niveau des gènes cibles (Zinszner et coll., 1994 ; Ichikawa et coll. , 1999). En outre, il a été mis en évidence que la partie N-terminale de TLS fusionnée au domaine de liaison de l'ADN de Gal4 possède une forte activité transcriptionnelle (Uranishi et coll., 2001).

Afin de déterminer si TLS faisait partie du RANC, des expériences de retard sur gel ont été effectuées en utilisant comme sonde oligonucléotidique DR5. A cette fin, des extraits de cellules Cos-6 transfectées par RAR, RXR ou TLS ont été utilisées. Les résultats démontrent que TLS fait partie de RANC. Une autre étude réalisée in vitro montre que cette interaction est directe et indépendante de la présence de l'acide rétinoïque et semble spécifique aux récepteurs à l'acide rétinoïque RXR, aux glucocorticoïdes, aux oestrogènes, et à l'hormone thyroïdienne (Powers et coll., 1998). Cette interaction directe est indépendante de la présence du ligand. Cette observation est due au fait que le complexe se forme entre le domaine de liaison de l'ADN (domaine C) et la région D du récepteur nucléaire avec la partie N-terminale de TLS (Powers et coll., 1998). La région C, composée de 66 acides aminés, est la plus conservée parmi tous les membres de la superfamille des récepteurs nucléaires. Elle contient deux structures de ^« doigt à zinc ^» et correspond au domaine de liaison du récepteur nucléaire à l'ADN. La région D, appelée également zone charnière, se situe entre le domaine de liaison à l'ADN et la région E. Elle est subdivisée en trois sous-régions (D1, D2 et D3) dont la région D1 N-terminale, la plus conservée, contient de nombreux acides aminés basiques qui correspondraient à un signal de localisation nucléaire. La région centrale D2 est plus variable. Il est intéressant de noter que l'interaction de TLS avec le domaine de liaison à l'ADN de RXR n'altère pas la liaison du récepteur nucléaire sur son élément de réponse spécifique.

La fonction co-activatrice de TLS au niveau du complexe transcriptionnel des récepteurs à l'acide rétinoïque pourrait sembler paradoxale dans le fait que l'interaction de TLS avec RXR implique son domaine de liaison de l'ADN. Cependant, cette interaction n'est pas déstabilisatrice du complexe protéine/ADN. Bien au contraire, puisqu'il est établi que cette interaction protéine/protéine soit stabilisatrice du complexe RXR-ADN (Powers et coll., 1998). De plus, cette interaction n'empêche pas le changement de conformation des récepteurs nucléaires. Ainsi, TLS par son action stabiliserait le complexe co-activateur des récepteurs à l'acide rétinoïque. Les principaux complexes co-activateurs des récepteurs nucléaires comprennent le complexe Brg (SWI/SNF), les co-intégrateurs CBP et p300, la famille des protéines p160, la protéine p/CAF et les complexes TRAP/DRIP/ARC.

TLS a déjà été impliquée dans le complexe transcriptionnel d'un autre facteur de transcription, NFB. Ainsi, TLS augmente la transactivation dépendante de NFB induite par des stimuli physiologiques tels que TNF et l'IL-1 (Uranishi et coll., 2001). TLS agit donc en tant que co-activateur de divers facteurs de transcriptions.

Enfin, TLS partage des caractéristiques structurales avec hTAFII68. Ces protéines ont été retrouvées associées avec les complexes TFIID (Bertolotti et coll., 1997 et 1998) et sont impliquées dans l'activation transcriptionnelle (Prasad et coll., 1994 ; Zinszner et coll., 1994 ; Bertolotti et coll., 1999 ; Ichikawa et coll., 1999). TLS interagit in vivo avec TFIID (Uranishi et coll., 2001). De plus, TLS est associée à l'ARN polII via son domaine N-terminal (Yang et coll., 2000). L'ensemble de ces interactions pourrait permettre à TLS de faire le lien moléculaire entre des facteurs de transcription et le complexe d'initiation de la transcription.

L'ensemble de ces études implique de façon indéniable TLS dans la régulation transcriptionnelle au niveau des voies de signalisation des rétinoïdes.

La seconde partie du projet de recherche concerne le lien éventuel entre les voies de signalisation des rétinoïdes et la régulation post-transcriptionnelle à travers la modulation de l'épissage alternatif. En effet, le fait que TLS, facteur d'épissage, soit impliquée dans les voies de signalisation de l'AR à travers son rôle direct dans la coactivation transcriptionnelle dépendante du RANC incite à étudier le rôle de l'acide rétinoïque et de ses récepteurs dans l'épissage.

Les résultats expérimentaux montrent que TLS agit in vivo sur la sélection du sites 5' d'épissage alternatif de l'ARN pré-m E1A dans les cellules hématopoïétiques K562. La sélection du site 5' distal de E1A correspondant à la formation de l'isoforme 9S est favorisée au détriment de celle des sites proximaux 12S et 13S.

Certaines données nous aiguillent sur le rôle de TLS dans la régulation de l'épissage alternatif in vivo. TLS est associée aux RNPs en formant in vivo un complexe avec la hnRNP A1, un facteur d'épissage capable de favoriser la sélection du site 5' distal d'épissage pendant un épissage alternatif de n'importe quel ARN pré-m (Uranishi et coll., 2001). Il a été précédemment montré que TLS agissait sur la sélection du site distal de E1A dans les cellules érythroblastiques de Souris IW1-32 (Hallier et coll., 1998). Les expériences effectuées sur les cellules K562 transfectées par E1A permettent de mettre en évidence une augmentation du taux d'isoforme 9S en présence d'AR et de TLS. L'interférence fonctionnelle entre TLS et l'acide rétinoïque peut être due à des interférences moléculaires, c'est à dire des interactions physiques protéine/protéine. Cette hypothèse peut s'appuyer sur l'interaction directe montrée par des travaux précédents. Par conséquent, ces résultats identifient l'acide rétinoïque en tant qu'acteur impliqué dans la régulation de l'épissage. C'est la première fois qu'il est mis en évidence l'action d'une hormone sur l'épissage. Ces travaux permettent de définir un nouveau niveau de régulation des voies de signalisation des rétinoïdes.

Le fait que TLS interagisse avec RXR, TR et GR permet de raisonnablement penser que ce phénomène se retrouve à un niveau plus général.

L'épissage de l'ARN, étape critique de l'expression des gènes, est de plus en plus considéré comme un événement co-transcriptionnel. Des évidences expérimentales indiquent désormais que les étapes de transcription, le « capping » et la polyadénylation, sont intimement liées à l'ARN polII à travers son association avec les facteurs impliqués dans ces mécanismes moléculaires (Cho et coll., 1997 ; Hirose et coll., 1998). Les protéines de régulation de l'épissage, les protéines SR, sont associées à l'ARN polII. Cependant, les moyens par lesquels cette association s'effectue n'étaient pas identifiés. Le co-activateur transcriptionnel p52 est capable d'interagir avec la protéine SR, ASF/SF2. p52 agit ainsi en tant qu'adaptateur afin de coordonner la transcription et l'épissage (Ge et coll., 1998). TLS interagit aussi avec l'ARN polII et les protéines SR (Yang et coll. , 2000). TLS pourrait donc agir en tant que molécule recruteuse des facteurs de régulation de l'épissage SR vers l'ARN polII, couplant ainsi la transcription avec l'épissage. TLS pourrait aussi agir directement sur l'épissage par son interaction avec l'ARN (Lerga et coll., 2001).

TLS contient trois domaines potentiellement impliqués dans la liaison à l'ARN, RGG1, RRM et RGG2-3. Le mécanisme impliqué dans la reconnaissance de l'ARN par TLS est encore inconnu. La structure secondaire de l'ARN représente une part importante des interactions protéine/ARN. Les séquences sélectionnées se fixent à TLS avec des affinités de l'ordre de 250 nM à 600 nM, le Kd de 250 nM correspondant au complexe ggugARN/TLS (Lerga et coll., 2001). Par conséquent, TLS semble être une protéine possédant une faible affinité pour sa séquence ARN. Ainsi, il n'est pas exclu que le Kd du complexe TLS/ggugARN déterminé in vitro soit éloigné du Kd d'un complexe ARN/protéine au niveau du spliceosome. Cependant, une faible affinité d'un facteur d'épissage pour sa séquence ARN cible pourrait représenter une condition compatible avec l'assemblage du « spliceosome » qui se déroule à travers l'échange et le replacement d'un grand nombre de protéines au niveau du substrat,l'ARN pré-m.

Les fonctions de TLS dans la régulation de la transcription et dans l'épissage permettent d'envisager les conséquences d'une altération de TLS dans certaines pathologies. Dans les cellules leucémiques myéloïdes possédant la translocation t(16;21) et dans les cellules de liposarcome dans la translocation t(12;16), un seul allèle est interrompu alors que l'autre allèle est intact (Crozat et coll. , 1993 ; Rabbitts et coll., 1993 ; Yamamoto et coll., 1997). Ces observations suggèrent un rôle de protéine de fusion générée de type dominante négative. La protéine de fusion TLS/ERG, observée dans la leucémie myéloïde humaine t(12;16), pertuberait l'épissage in vivo de E1A observé dans des cellules HeLa (Yang et coll., 2000). Il est à noter que TLS n'était pas considérée capable d'agir sur E1A dans ces cellules, ce qui semble erroné à partir d'autres observations effectuées (F. Moreau-Gachelin, communication personnelle). Néanmoins, TLS est capable d'inhiber la fonction des TASR sur l'épissage de l'ARN pré-m E1A (Yang et coll., 2000). De plus, il est intéressant de noter que l'épissage de CD44 est altéré par la présence de la protéine de fusion TLS/ERG dans des clones stables générés à partir de cellules de la lignée K562 (Yang et coll., 2000). Le gène CD44 code pour une molécule d'adhésion constituée de dix exons constitutifs et dix exons variables. Différentes combinaisons formées par les exons variables est à l'origine d'une grande variété d'isofomes d'épissage de CD44 qui diffèrent au niveau de leur domaine extracellulaire. L'épissage anormal de l'ARN pré-m CD44 a été retrouvé dans diverses tumeurs solides et des leucémies (Cooper et coll., 1995). En outre, Il a été suggéré que les variations en taux protéique des SR selon les différentes étapes du développement du cancer du sein puissent être directement liées aux variations des diverses isoformes de CD44 (Stickeler et coll. , 1999). Deux mécanismes sont envisagés pour expliquer l'effet dominant négatif de TLS/ERG sur l'épissage de CD44. Le premier considère que TLS s'accrochant aux isoformes spécifiques de CD44, TLS/ERG bloquerait cette voie de régulation, à l'origine d'une dégradation prématurée de l'ARN pré-m de CD44 non épissé complètement. Dans le second mécanisme, si l'une des voies de régulation est bloquée et qu'une autre voie de régulation de l'épissage alternatif existe, l'inhibition de la première voie par TLS/ERG pourrait inciter l'épissage de CD44 à travers une autre voie de régulation, augmentant ainsi le risque de générer un épissage aberrant.

Si TLS est exprimée de façon ubiquitaire, il est intéressant de noter des différences d'expression dans les cellules hématopoïétiques normales et pathologiques. Les cellules souches hématopoïétiques purifiées de sang de cordon ont des taux inférieurs de TLS comparées aux cellules myéloïdes. D'autre part, une expression importante de TLS fut mise en évidence dans des cellules de LAM (Mills et coll., 2000). Il est intéressant de noter que TLS a été également identifiée par son taux d'expression diminué dans les cellules HL-60 traitées par l'acide rétinoïque pendant une heure. De plus, l'expression de TLS est fortement diminuée dans les cellules HL-60 au cours de la granulopoïèse induite par le DMSO ou l'ATRA. Il existe une spécificité à la granulopoïèse puisque la différenciation monocytaire induite par le TPA ou la vitamine D3 n'agit pas sur l'expression de TLS (Mills et coll., 2000). Cette diminution d'expression est associée avec la baisse de la prolifération cellulaire dans les diverses LAM. L'ensemble de ces observations suggère que l'expression de TLS est un régulateur clef de la myélopoïèse où un fort taux d'expression de TLS favorise la prolifération cellulaire au détriment de la différenciation.

Les perspectives de ces travaux s'articulent sur deux axes. Le premier concerne les mécanismes moléculaires fondamentaux qui impliquent TLS dans les voies de signalisation de l'acide rétinoïque. Nous envisageons d'étudier TLS dans la régulation de l'épissage constitutif et l'épissage alternatif en 3' d'épissage. L'effet de l'AR sur l'épissage de E1A sera aussi étudié à travers les rôles de RAR et RXR. Il s'agit aussi de déterminer avec précision l'association de TLS dans le complexe transcriptionnel de l'AR. Ainsi, des expériences d'identification des interactions directes entre TLS et RAR seront effectuées sachant qu'elles ont été mises en évidence avec RXR (GST pull down et co-immunoprécipitation). Nous voulons étudier la coordination de l'épissage et de la transcription pour savoir si ces mécanismes sont dépendants ou indépendants l'un de l'autre (une construction réunissant les gènes E1A et la luciférase sous la dépendance d'un promoteur muté sensible à l'AR, ne permettant pas au RANC de se fixer pour augmenter la transcription). Le rôle biologique de TLS sera déterminé par son invalidation transitoire (RNAi). Le deuxième axe consiste à confirmer le lien entre TLS et la pathologie. Il s'agit de comprendre les conséquences de l'altération de l'expression de TLS et son ciblage dans le cadre d'une nouvelle prospective thérapeutique et diagnostique.

V - REFERENCES

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