II - MATERIELS ET METHODES
A) MATERIELS :
a)
Lignées cellulaires :
Trois lignées cellulaires ont été
utilisées :
- La lignée HL-60 fut obtenue à partir de
cellules d'un patient atteint d'une leucémie aiguë
myéloblastique de type 2 selon la classification FAB
(French-American-British). Les cellules HL-60 ont la caractéristique
d'être bi-potentielles, c'est à dire de se différencier
soit vers la voie granulocytaire, soit vers la voie monocytaire, selon que
l'ATRA ou la VD3 sont utilisées (Breitman et coll., 1980).
- La lignée K562 fut obtenue à partir de
cellules d'un patient atteint d'une leucémie chronique
myéloïde. La population cellulaire a été
identifiée comme indifférenciée et de série
granulocytique.
- La lignée Cos-6 provient d'un rein de Singe.
b) Anticorps :
Plusieurs anticorps ont été
utilisés : l'anticorps monoclonal de Souris anti-myc (anti myc-TLS,
IgG1, Kappa, Roche Molecular Biochemicals), l'anticorps polyclonal de Lapin
Anti-RXR (RXR 444, don de Cécile Rochette-Egly et Pierre Chambon),
l'anticorps polyclonal de Lapin Anti-RAR (RAR 115, don de Cécile
Rochette-Egly et Pierre Chambon) et l'anticorps polyclonal de Lapin Anti-TLS
(don de Françoise Moreau-Gachelin).
c)
Agents inducteurs :
L'ATRA (Hoffmann La Roche) est dissout dans le DMSO à
une concentration de 10-2 M, conservé à -80°C
à l'abri de la lumière, dilué dans du RPMI pour obtenir
une concentration de 10-4 M, stocké à -20°C et
utilisé dans les milieux de culture à la concentration finale de
10-6 M. L'AR 9-cis est réalisé de la
même façon et utilisé à la concentration finale de
10-6 M.
d)
Plasmides :
- Le plasmide Tkgal est un plasmide dans lequel est
cloné l'ADNc de la -galactosidase sous le contrôle d'un fragment
délété du promoteur TK du virus de l'Herpès (don de
H. de Thé).
- Le plasmide RARE est un plasmide pXp2, dans lequel l'ADNc de
la luciférase est sous le contrôle du promoteur du gène
RAR2 (inséré en amont du promoteur, don de H. de Thé).
- Le vecteur d'expression pCS3-MT (Myc-Tag) contient le
promoteur/enhancer du cytomégalovirus simien IE94, le promoteur SP6 et
six copies de l'épitope Myc 9E10 (don de Françoise
Moreau-Gachelin).
- pCS3-MT-TLS code pour une protéine contenant
l'épitope Myc et les acides aminés de TLS de 1-526 (don de
Françoise Moreau-Gachelin).
- pCS3-MT-E1A fut généré par insertion du
fragment EcoRI-XbaI de E1A du plasmide Sp4 dans le site EcoRI-XbaI du vecteur
pCS3-MT (don de Françoise Moreau-Gachelin).
- Le pSG5-hRAR et le pSG5-mRXR sont des plasmides
d'expression contenant l'ADNc des récepteurs nucléaires RAR et
RXR (don de Cécile Rochette-Egly et Pierre Chambon).
- Le CMV-luc est un plasmide puC18 de 6 kb, sans "polylinker",
dans lequel est cloné l'ADNc du gène luciférase sous le
contrôle du promoteur du cytomégalovirus, qui est un promoteur
fort (don de H. de Thé).
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