RXR RAR
DR5
Figure 7. schéma descriptif de la construction
utilisée dans le retard sur gel et de la fixation du RANC
Le signal en 1 correspond à la fixation de RAR et RXR
sur le DR5. Le complexe observé est ainsi constitué des
récepteurs nucléaires et est appelé RANC. Le signal 2
indique que RXR en fait partie. L'intensité et le retard des bandes 3 et
4 indiquent que TLS fait partie du RANC. A partir de 1 ul (bande 4), plus la
quantité de TLS est augmentée, plus le complexe semble
déstabilisé (bande 5 et 6). La quantité maximale de TLS
pour sa participation au RANC est de 1 ul d'extraits protéiques totaux.
Au delà de cette confirmation et en moyennant des expériences de
contrôles des phénomènes de compétition ou
d'allostérie, TLS pourrait interférer avec le complexe, pouvant
empêcher RXR de se lier à l'ADN.
En conclusion, ces résultats préliminaires
suggèrent fortement que TLS augmenterait la transcription de
gènes cibles de l'AR de manière dépendante du ligand dans
les cellules myéloïdes et que ceci serait lié à une
participation directe de TLS dans le complexe transcriptionnel RANC. Les
expériences dans les cellules Cos-6 montrent que cette régulation
par TLS et l'AR pourrait être un phenomène
général.
Figure 8. Retard sur gel réalisé avec
RAR et RXR, en présence ou absence de TLS.
L'effet de la dose de TLS sur le RANC est
déterminé.
3. Analyse in vivo de l'activité de
TLS et de l'acide rétinoïque sur l'épissage alternatif en 5'
de E1A
A la lumière des résultats obtenus, il est clair
que TLS agit sur la voie de signalisation aux rétinoïdes au moins
par son activité transcriptionnelle.
Etant donné que TLS peut jouer un rôle de facteur
d'épissage en favorisant la sélection du site 5' distal
d'épissage de l'ARN pré-m du minigène E1A dans les
cellules érythroïdes murines IW1-32, nous avons
étudié le rôle de TLS sur l'épissage de l'ARN
pré-m du minigène E1A dans un modèle
hématopoïétique humain, la lignée
myéloïde K562.
L'ARN pré-m E1A contient des sites 5' d'épissage
qui mènent à la formation de plusieurs isoformes principales
d'ARN (dont les 13S, 12S et 9S). Ces isoformes peuvent être mises en
évidence et quantifiées par PCR à l'aide d'amorces
spécifiquements choisies (Figure 9).
 Figure 9. Représentation schématique de
l'épissage alternatif des transcrits de E1A. Les isoformes de
l'ARN pré-m de E1A et la taille correspondante des produits de RT-PCR
sont montrés. Les amorces pour l'analyse en RT-PCR sont indiquées
par des flèches.
Afin d'étudier le rôle éventuel de TLS ou
de l'AR sur l'épissage en 5' du minigène E1A, nous avons
co-transfecté transitoirement les cellules K562 par la lipofectamine
avec les plamides d'expression de E1A, de pCS3 (pour uniformiser les
quantités de plasmide utilisés), de TLS (les quantités
utilisées sont indiquées) et de CMV-luc (pour mesurer
l'efficacité de la transfection). Lorsque la luciférase
s'exprime, les ARNs sont extraits, puis rétrotranscrits. Puis une PCR
est réalisée. La détection des produits de PCR est faite
après séparation sur un gel PAGE-urée par autoradiographie
(Figure 10). Enfin, l'analyse quantitative des résultats est obtenu par
le système Molecular Analyst de Biorad (Figure 11).
Après s'être assuré de l'efficacité
de la transfection, il convient d'obtenir les conditions expérimentales
adéquates pour s'assurer de la détection de toutes les isoformes.
Il s'agit de faire varier soit la quantité de produits de RT
utilisé pour la PCR, soit le nombre de cycles de la PCR, soit
l'exposition de l'autoradiographie. Chaque expérience est faite en
doublet et reproduite pour s'assurer de la reproductibilité des
résultats obtenus. L'étude est basée sur le choix du site
5' d'épissage du minigène E1A que l'on déduit de
l'expression en pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S. Il est, de plus,
impératif de visualiser une bande correspondant à la forme non
épissée de E1A pour que les résultats soient
interprétables.
En comparant les résultats sans AR (1) aux
résultats avec l'AR (2), il est possible d'affirmer, sous réserve
de contrôles supplémentaires (entre 40 et 60 % de 9S) qu'il ne
semblerait pas que l'AR seul ait un effet significatif sur l'épissage de
E1A dans K562.
Par contre, les résultats en présence de TLS
sont reproductibles et confirment que dans les cellules K562, la
protéine TLS permet un épissage préférentiel de
l'isoforme 9S au détriment des isoformes 13S et 12S. Ce
phénomène serait augmenté en présence d'AR. Les
résultats (3) montrent que TLS seule favorise la formation de l'isoforme
9S (75 % de 9S), alors que lorsque l'AR est utilisé avec TLS, l'isoforme
9S est considérablement augmentée (90 % de 9S).
Ces résultats indiquent que TLS agit sur la
sélection du site 5' distal d'épissage, favorisant la formation
de l'isoforme 9S du minigène E1A, phénomène
accentué par l'AR. Ainsi, ces résultats suggèrent que TLS
agit sur l'épissage dans les cellules
hématopoïétiques humaines et que l'AR intervient sur
l'épissage à travers TLS.
En conclusion, ces résultats montreraient pour la
première fois que l'AR serait impliqué directement dans le
contrôle post-transcriptionnel à travers la protéine
TLS.
Figure 10. L'épissage alternatif in
vivo du minigène E1A dans les cellules K562.
L'intensité des bandes correspondant aux
différentes isoformes de E1A pour chaque profil est quantifiée
par densitométrie. Les résultats sont exprimés
en pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S. Les études sont faites
en doublets. Le RT- représente le contrôle négatif de la
RT, elle a été réalisée sans enryme RT et aucun ADN
n'est révélé. Les ARNs extraits et utilisés sont
ainsi exempts d'ADN.
Figure 11. Quantification des isoformes des ARN
pré-m de E1A par un logiciel Molecular Analyst de Biorad . Le
pourcentage des isoformes 13S, 12S et 9S est représenté.
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