Antibiorésistance des bacilles à gram négative non fermentant ressponssable des mammites en élevages bovins laitiers dans la wilaya de Chlef

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République Algérienne Démocratique et Populaire

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Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

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Université Hassiba Benbouali de Chlef

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Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

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Département de Biologie

N° d'ordre : /20

MÉMOIRE

En vue de l'obtention du diplôme de Master

Domaine : Sciences de la nature et de la vie
Filière : science biologique.
Spécialité:Biologie Moléculaire des Micro-organismes

Antibiorésistance des Bacilles à Gram négatif non fermentants responsables des mammites en élevage Bovin

Présenté par :

? SAHLI SALIHA .

? MENACER KHEDIDJA.

Soutenu publiquement le : 22/06/2022. Devant le jury:

Mr Sebaihia.M PROF

Université Hassiba Benbouali de Chlef Présidente

Mm Souna.D

Université Hassiba Benbouali de Chlef Encadreur :

MCA

Mm Ziani .M

Université Hassiba Benbouali de Chlef Examinatrice

MCA

Mr El salhi .M

Invité

Chlef

Vétérinaire

Année universitaire : 202119/2022

Remerciement

Louange à DIEU de nous avoir accordé la santé et les moyens de réaliser ce travail.
En premier lieu, nous tiens à remercier vivement madame Souna Djahida
Docteure, à l'Université de Chlef, Directrice de thèse, qui nous avons honoré d'avoir
Accepté l'encadrement de ce travail, en étant toujours prêts à répondre à nos interrogations
Et à soutenir notre travail.
En témoignage de notre reconnaissance.
Nous remercions vivement ...
Monsieur Sebaihia Mohammed, Professeur, à l'Université de Chlef, d'accepter
La présidence de notre jury de thèse, Hommages respectueux.
Madame Ziani M, Docteure, à l'Université de Chlef, d'avoir accepté d'examiner notre thèse,
Sincères remerciements.
Monsieur El Salhi Mohammed, Docteur en médecine vétérinaire, qui nous
a fait l'honneur d'être membre de notre jury de thèse et pour ces conseils et son aident du travaille
au niveau des Fermes, Sincères remerciements.

Nous tiens à exprimer notre reconnaissance au Laboratoire pédagogique de biologie moléculaire
au Travers d'ingénieure madame, Mekrafe S pour leurs accueils, qualité humaine, et les moyens de
mener à bien ce travail.
Nous remercie tous les éleveurs des bovins laitier dans la wilaya de chlef pour nous aident de faire
ce travail.
Nous remercie très sincèrement tous ceux qui de près ou de loin ont contribué à la réussite
De ce travail..

Dédicace

Au nom de Dieu le Miséricordieux
D'abord et avant tout je remercie ALLAH de réussi à compléter ce travail.
JE DEDIE CE MODESTE TRAVAIL
À ma maman, pour toute la complicité qui nous unie, depuis mon enfance
jusqu'à ce jour. Ce travail est une maigre récompense à ce que je te dois.
À mon cher Papa «M'hammed», tu es toujours présent dans ma vie et je
T'aime beaucoup.
A ma binôme Khadidja
À mes soeurs : Rokaya ,Rahma
À mes chers amies: Saida; Fatima ; Douae; Chiama; Imane, Chanaz, Ikram
À toute ma famille et tous mes collègues sans exception.

Dédicace

ááå ÏãÍáÇ

Tous mes remerciements et mes appréciations seront À ma mère l'être le

plus cher de ma vie
À mon père qui m'a fait de moi une femme
À l'honnête Saliha ma cher binôme, amie et soeur
À mes cher soeurs Fatima Rafika et surtout Djihane
À mon cher frère Abd El Basset et les petits de la famille Menacer

Meriem El Batoul et Youssef
À mes chers amies :Houria, Djamila, Yasmine, Wafa, Siham et Wafa
À tous ma famille surtout ma tante Fatma et mon oncle Ahmed
À tous mes collègues sans exception
Enfin, à tous ceux qui ont collaboré à la réalisation de ce travail, en

guise

De reconnaissance

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Résumé

RESUME

La mammite est devenue un problème de sécurité alimentaire à travers le monde. Le présent travail a pour but d'étudier l'Antibiorésistance des bacilles à Gram négatif non fermentants responsables de mammites en élevages bovins laitiers dans la wilaya de Chlef. L'étude a été réalisée pendant 3 mois sur 200 vaches laitières en période de lactation de différentes races chez 29 fermes de bovins. La positivité du California mastitis test (CMT) est constatée dans 63% des cas. L'examen bactériologique a révélé un pourcentage d'échantillons positifs de 50,39% sur milieu des bacilles à Gram négatif. 21,87% des isolats sont des bacilles à Gram négatif non fermentants, avec une dominance de l'espèce Burkholderia cepacia (50%),suivi par les espèces du genre Pseudomonas avec 42,85% (trois souche Pseudomonas aeroginosa (21,28%), 2 souches Pseudomonas luteola (14,28) et une souche Pseudomonas fleurescens (7,14%)) et une souche de Chryseobacteruim indologène (7,14% ).Le test de sensibilité aux antibiotiques a été réalisé par la méthode de diffusion sur gélose Muller-Hinton vis-à-vis de sept antibiotiques : Les résultats montrent une forte résistance vis-à-vis de la plupart des antibiotiques testés sauf pour l'amikacine qui présente une sensibilité totale .La caractérisation génotypique d'antibiorésistance des bacilles à Gram négatif non fermentants a confirmé la présence du gène bla VIM chez quatre souches.

la mise en place de programme de contrôle de la mammite contagieuse et de biosécurité est essentielle dans les troupeaux laitiers en Algérie.

II

Mots Clé : Mammite ,Bovins, Chlef, Antibiorésistance, Bacilles à Gram négatif non fermentants

Abstract

Abstract

Mastitis has become a food safety problem throughout the world. The present work aims to study the antibiotic resistance of non-fermenting Gram-negative bacilli responsible for mastitis in dairy cattle farms in the wilaya of Chlef. The study was carried out during 3 months on 200 lactating dairy cows of different breeds in 29 cattle farms.The positivity of the California mastitis test (CMT) was found in 63% of cases. Bacteriological examination revealed a percentage of positive samples of 50.39% on Gram-negative bacilli medium. 21.87% of the isolates were non-fermenting Gram-negative bacilli, with a dominance of Burkholderia cepacia species (50%), followed by species of the genus Pseudomonas with 42.85% (three Pseudomonas aeroginosa strains, 2 Pseudomonas luteola strains and one Pseudomonas fleurescens strain) and one Chryseobacteruim indologen strain (7.14%). Antibiotic susceptibility testing was performed by the Muller-Hinton agar diffusion method against seven antibiotics: The results show a high level of resistance against most of the antibiotics tested except for amikacin which is fully susceptible. Genotypic characterization of antibiotic resistance in non-fermenting Gram-negative bacilli confirmed the presence of the bla VIM gene in four strains. The implementation of contagious mastitis control and biosecurity programs is essential in Algerian dairy herds.

III

Key words: Mastitis, Bovine, Chlef, Antibiotic resistance, Non-fermenting gram-negative bacilli.

Table des Matières

TABLE DES MATIERES

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RESUME...................................................................................................4

ABSTRACT................................................................................................ III

LISTE DES ABREVIATION 4

LISTE DES ANNEXES 4

LISTE DES FIGURES 4

LISTE DES TABLEAUX 4

INTRODUCTION.......................................................................................... 01 PARTIE 01 : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE 01: BACILLES GRAM NEGATIF NON FERMENTANTS

1. Généralité sur les bacilles Gram négatif non fermentants............................................. 04

1.1. Définition des bacilles à Gram négatif non fermentants (BGN nf) 04

1.2. Caractères morphologiques et culturaux 04

1.3. Principaux germes isolés ... 05

1.3.1. Pseudomonas aeruginosa........................................................................... 05

1.3.2. Acinetobacter 05

1.3.3. Brucella 06

1.3.4. Le Complexe Burkholderia cepacia 06

1.3.5. Stenotrophomonas maltophilia 08

1.3.6. Chryseobacterium indologenes 08

CHAPITRE 02 : MAMMITES EN ELEVAGE BOVIN LAITIER

1. Généralités sur les mammites des bovins laitiers......................................................11

2. Différentes mammites rencontrées en élevage bovin laitier.......................................11

2.1. Mammites Latentes.................................................................................... 11
2.2. Mammites Subcliniques................................................................................. 11

2.3. Mammites cliniques.................................................................................... 12
2.3.1. Mammites aiguës....................................................................................... 12

2.3.2. Mammites suraiguës.................................................................................... 12

Table des Matières

2.3.3. Mammite chronique .. 13

3. Etiologie des mammites rencontrées en élevage du bovins Laitiers 13

4. Bactéries Mammo-pathogènes (agents pathogènes responsables de mammites) .. 13

5. Principaux facteurs de risques 15

6. Diagnostic des Mammites en élevage bovin laitier 16

6.1. Le Taux cellulaire du Tank TCT 16

6.2. Le CCSI ou Comptage Cellulaire Somatique Individuelle 16

6.3. Le Test CMT ou Test de Mammite de Californie 16

6.4. D'autres tests de détection de mammites 16

7. Guérison spontanée 17

8. Traitement . 17

9. Effets de la mammite sur la santé humaine 18

CHAPITRE 03 : ANTIBIORESISTANCE

1. Antibiotiques 19

1.1. Définition des antibiotiques 19

1.2. Classification et action des antibiotiques 19

1.3. Les antibiotiques en médecine vétérinaire 21

1.4. Antibiothérapie des Mammites en élevage bovins laitiers dans le monde 22

1.4.1 Traitement antibiotique des vaches en lactation 22

1.4.2 Traitement antibiotique des mammites en première intention 22

1.4.3 Plans de traitement au Tarissement 22

1.4.4 Antibiotiques utilisables en lactation 22

1.4.5 Antibiotiques utilisables au tarissement 22

2. Antibiorésistance 23

2.1. Types de résistance 23

2.1.1. Résistance naturelle 23

2.1.2. Résistance acquise 23

Table des Matières

2.1.3. Résistance croisée et co-résistance ... 24

2.2. Vois d'acquisition des gènes de résistance . 24

2.3. Antibiorésistance chez certain bactéries à Gram négatifs non fermentants . 24

2.3.1. Pseudomonas aeruginosa 24

2.3.2 . Acinetobacter baumannii 25

2.3.3 . Chryseobacterium indologenes 25

2.4 . Utilisation des antibiotiques chez les animaux et le développement de la résistance 25

PARTIE 02 : PARTIE EXPERIMENTALE

1. Matériel . 28

1.1. Animaux 28

1.2. Fiche d'enquête . 30

1.3. Matériel de prélèvements 30

1.4. Matériel de Laboratoire 30

1.3.1. Milieux de culture 30

1.3.2. Tests biochimiques et réactifs . 30

1.3.3. Solutions .. 30

1.3.4. Enzymes, Tampons et amorces 31

1.3.5. Antibiotiques 31

2. Méthodes .. 31

2.1. Prélèvements 31

2.2. Test de mammite de Californie (CMT) 32

2.3. Enrichissement 32

2.4. Isolement et purification 32

2.5. Conservation des souches 33

2.6. Coloration de Gram 33

2.6.1. Principe 33

2.6.2. Technique 33

2.6.3. Lecture ... 34

Table des Matières

2.7. Test d'oxydase 34

2.7.1. Principe 34

2.7.2. Technique 34

2.8. Galerie API 20NE 34

2.8.1 Principe 34

2.8.2. Technique 34

2.8.3. Lecture .. 35

2.9. Antibiogramme 35

2.9.1. Principe 35

2.9.2 Technique . 36

2.9.3. Lecture 37

2.10. Recherche de gènes de résistance par PCR 37

2.10.1. Extraction de l'ADN par Choc thermique 37

2.10.2. Dosage d'ADN par la spectrophotométrie 37

2.10.3. Amplification de l'ADN par PCR 38

2.10.4. Electrophorèse sur Gel d'agarose .. 39

PARTIE 03 : RESULTATS

1. Prélèvement 43

2. Identification des Germes responsable de mammites 49

3. Antibiorésistance des bacilles à Gram négatif non fermentants . 54

4. Dosage d'ADN par spectrophotométrie 55

5. Recherche des gènes de résistance 57

PARTIE 04 : DISCUSSION 59

CONCLUSION 63

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 67

ANNEXES

IV

Liste des Abréviations

LISTE DES ABREVIATIONS

AK : Amikacine

AR : action rapide.

ATM : Aztréonam

BET : Bromure d'éthédium

BGN : Bacilles à Gram négatif

BGNF : Bacilles à Gram négatif fermentants

BGNnF : Bacilles à Gram négatif non fermentants

CA-SF : Comité de l'Antibiogramme de la Société Francaise de Microbiologie
CAZ : Céftazidime

CCSI : Comptage Cellulaire Somatique Individuelle
CIP : Ciprofloxacine

CMT : California mastitis test

GNI : Gélose Nutritive Incliné

HL : hors lactation.

IMP : Imipénème

LA : longue action

MCF : McFarland

MH : Mueller-Hinton

NiT : Nitrate

PLP : penicillin binding proteins

PM : Poids moléculaire

PRL : Pipéracilline

QAD : Quartier Antérieur Droit

QAG : Quartier Antérieur Gauche

QPD : Quartier Posterieur Droit

QPG : QuartierPosterieur Gauche

R : Résistane

S : Sensible

TAE : Tris Acide Acétique Glacial EDTA

V

Liste des Abréviations

TCC : Ticracilline / Acide clavulanique

TCT : Taux cellulaire du Tank

TDA : Tris Acide Acétique Glacial EDTA

UV : Ultra-Violet

VI

Liste des Annexes

LISTE DES ANNEXES

Annexe 01 Questionnaire

Annexe 02 Compositions chimiques des milieux de culture

Annexe 02 Tableau de lecture API 20 NE

Annexe 03 Comité de l'antibiogramme de la société française de microbiologie

Annexe 04 Tableau de préparation de tampon TAE

Annexe 05 Catalogue d'identification de Galerie API 20NE

Annexe 06 Résultats d'antibiogramme

VII

Liste des Figures

LISTE DES FIGURES

Figure 01. Cibles des principaux antibiotiques . 19

Figure 02. Cycle de? lactame . 20

Figure 03. Classification des?-lactamines ... 21

Figure 04. Voies d'acquisition de résistance aux antibiotiques 24

Figure 05. Localisation géographique de différentes fermes dans la wilaya de Chlef . 28

Figure 06. Disposition des antibiotiques sur les boîtes d'antibiogrammes .. 37

Figure 07. Test CMT positif du lait .. 44

Figure 08. Résultat de CMT de 200 vaches laitières 44

Figure 09. fréquence de mammites en fonction des mois de prélèvements .. 45

Figure 10. Fréquence de mammites en fonction des communes de la wilaya de Chlef 45

Figure 11. Fréquence des cas de mammites en fonction de stade de lactation .. 46

Figure 12. Fréquence de mammites en fonction de rang de lactation . 46

Figure 13. Fréquence de mammites en fonction de l'Age de bovins 47

Figure 14. Fréquence de mammites en fonction de déférentes races des bovins 47

Figure 15. Fréquence de mammites en fonction de l'état des étables 48

Figure 16. Fréquence de mammites en fonction du Score d'hygiène de vache . 48

Figure 17. Résultat des échantillons des prélèvements analysés 49

Figure 18. Répartition des bacilles à Gram négatif .. 49

Figure 19. Répartition des espèces identifiées . 50

Figure 20. Aspects des colonies des BGNnFsur milieu Mac Conkey 52

Figure 21. Résultat de la coloration de Gram . 52

Figure 22. Test oxydase positif . 53

Figure 23. Identification biochimique des BGNnF par les Galerie API 20 NE et API 20E

54

Figure 24. Profil d'antibiogramme de P. aeruginosa.................................................. 55

Figure 25. Pourcentage de Résistance des bacilles à Gram négatif non fermentants aux

des antibiotiques 56

Figure 26. Résultats de la PCR blaTEM 57

Figure 27. Résultats de la PCR blaVIM 58

VIII

Liste des Tableaux

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 01. Déférentes espèces de complexe B.cepacia............................................. 07

Tableau 02. Principaux caractéristiques des bactéries contagieuses et environnementales retrouvées dans les infections intra-mammaires chez la vache

laitière 14

Tableau 03. Type d'activité et modalités d'action des principales classes

d'antibiotiques 20

Tableau 04. Liste des fermes sélectionnée pour prélèvements . 29

Tableau 05 Lecture et interprétation du test CMT 32

Tableau 06. Produits du mix pour la PCR 38

Tableau 07. Les amorces d'oligonucléotidiques utilisées pour la PCR 38

Tableau 08. Subdivision des Prélèvement réalisé dans les communes de wilaya de chlef 43

Tableau 09. Fréquence des isolats identifiée 50

Tableau 10. Répartition des espèces identifiées en fonction de site de prélèvement 51

Tableau 11. Résultats de dosage d'ADN par spectrophotomètre 57

1

Introduction

Introduction Général

Une mammite est une inflammation d'un ou de plusieurs quartiers de la mamelle, provoquée majoritairement par une infection bactérienne. Elle se rencontre généralement chez les vaches en lactation (Gambo et Agnem, 2001). Elle a bien évidemment un impact financier pour l'éleveur (lait non produit ou non commercialisé, réforme des vaches incurables, et coût des soins) mais aussi un impact sur la santé publique par l'utilisation quasi systématique d'antibiotiques.

L'Algérie est le premier consommateur laitier du Maghreb et le troisième importateur mondial de la poudre de lait après l'Italie et le Mexique. La consommation moyenne de lait est de 147 L/habitant/an (Hamlaoui, 2017). Les effectifs bovins représentent 1,9 millions de têtes dont 52% de vaches laitières en Algérie (Ferreira et al., 2013).

Considérant les vaches produisent environ 84 % de la production mondiale totale de lait, la mammite bovine menace l'industrie laitière notamment en raison de son incidence et de son impact économique sur la production et la qualité du lait (Halasa et al., 2007). Elle représente aussi le premier poste de consommation d'antibiotiques avec deux traitements par vache et par an en moyenne, et la première source de pollution du lait par des antibactériens (Barrot Debreil, 2008).

La mammite, problème radicale qui apparait dans chaque élevage de bovin (Descoteaux, 2004), il s'agit d'une inflammation intra-mammaire dont l'origine la plus fréquente est la pénétration d'une bactérie dans un quartier par le canal du trayon (Remy, 2010). Ces maladies multifactorielles se rencontrent généralement chez les vaches en lactation (Frihi et Hadjadj, 2019). La principale cause de la mammite est l'invasion et la colonisation de la glande mammaire par des agents pathogènes opportunistes (Keane, 2019 ; Burvenich et al., 2003).Ces derniers recourent à stratégies originaux pour persister dans la glande mammaire, comme la formation de biofilm (Melchior, 2011). Parmi ces pathogènes, les bacilles à Gram négatif non fermentants (pathogènes mineures)qui possèdent un niveau de résistance naturelle élevé d'une part, en relation avec différents mécanismes de résistance : sécrétion d'enzymes, imperméabilité membranaire et efflux et d'autre part, leurs capacité d'acquérir de nouveaux mécanismes de résistance (Lepape, 2007). L'émergence rapide de la résistance bactérienne aux nouveaux composés antimicrobiens soulève des inquiétudes concernant la stratégie de traitement des infections causées par ces pathogènes.

La plupart des élevages en Algérie ne sont soumis à aucun contrôle laitier régulier, par conséquent, la fréquence des mammites cliniques et subcliniques est élevée (Beroual, 2003). Pour cela notre objectif de travail est de rechercher la présence des bacilles à Gram négatif non fermentants responsable de mammites en élevage bovin au niveau de différentes fermes dans la wilaya de Chlef.

2

Introduction

Ainsi, d'étudier la sensibilité des souches isolées vis-à-vis de différentes familles d'antibiotiques selon les étapes suivantes:

> Réalisation des prélèvements aux niveaux de 33 fermes dans la wilaya de Chlef ;

> Détection rapide des mammites par le Test CMT;

> Isolement et purification des bacilles à Gram négatif non fermentants responsables de

mammites ;

> Identification des souches par galerie API 20NE et API 20 E ;

> Détermination de profil d'Antibiorésistance des germes isolés par antibiogramme ;

> Recherche des gènes de résistance (blaTEM et blaVIM) de quelques souches sélectionnées.

3

4

Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

2. Généralité sur les bacilles à Gram négatif non fermentants 2.1. Définition des bacilles à Gram négatif non fermentants (BGNnf)

Les bacilles Gram-négatifs non-fermentaires (BNGnf) sont un groupe hétérogène de microorganismes aérobies strictes, qui n'ont pas la capacité de fermenter les hydrates de carbone pour obtenir de l'énergie (Deliberali et al., 2011; Radice et al., 2011). Ces organismes sont omniprésents dans la nature, notamment dans le sol et l'eau. Dans l'environnement hospitalier, ils peuvent être isolés à partir d'instruments tels que les humidificateurs des machines à ventilation, les matelas et d'autres équipements ainsi qu'à partir de la peau des corps médicales Ils sont apparus comme d'importants pathogènes opportunistes dans la population croissante de patients immunodéprimés (Mellmann et al., 2009), chez les animaux ces derniers sont pathogènes (exemple : Pseudomonas aeruginosa) (Avril et al ., 2000).

Il existe plus de 120 espèces classées comme pathogènes, parmi lesquelles Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia et Burkholderia cepacia (Deliberaliet al., 2011; Radice et al., 2011).

Parmi les bacilles à Gram négatif, 10 à 15% sont des BNGnf dont les 3/4 appartiennent à l'espèce Pseudomonas aeruginosa. Les autres espèces appartiennent aux genres: Stenotrophomonas, Burkholderia, Acinetobacter et Achromobacter (Martin, 2011).

Ces bactéries acquièrent une résistance élevée à une grande variété de médicaments, notamment les pénicillines, les céphalosporines, les aminoglycosides, les tétracyclines, les fluoroquinolones, le trimétropim-sulfaméthoxazole, les carbapénèmes et les polymixines (Grillo et al., 2013).

L'analyse du degré de sensibilité et de résistance des bacilles Gram négatif non fermentants est essentielle pour une meilleure compréhension de l'épidémiologie des infections causées par ces microorganismes, en plus de contribuer à la proposition de nouveaux schémas thérapeutiques pour les combattre plus efficacement (Menezes et al.,2004 ; McGowan,2006 ;Pontes et al.,2006).

2.2. Caractères morphologiques et culturaux

Les bacilles à Gram négatif se présentent sous forme de bacilles longs et fins à extrémité effilée `Bâtonnets' (Pseudomonas) (Hafiane et Ravaoarinoro, 2008), mais également sous forme de diplobacilles à extrémité arrondie avec des formes coccoïdes `coccobacilles' et longues (Acinetobacter) (Doughariet al., 2011). Ils sont mobiles grâce à la présence d'un flagelle (Pseudomonas) (Hafiane et Ravaoarinoro, 2008), ou immobile (Acinetobacter) (Roca et al., 2012).

5

Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

En général, les bacilles à Gram négatif non fermentants croissent sur milieux simples comme la gélose Trypto-Caséine Soja (TSA) et la gélose lactosée de Drigalski. Certaines de ces bactéries élaborent des pigments :

? La pyocyanine, pigment bleu-vert, de Pseudomonas aeruginosa ;

? Des pigments allant du jaune pâle au jaune orangé peuvent être produits par diverses espèces au

sein des genres Pseudomonas, Flavobacterium et Xanthomonas (Diop, 2001).

2.3. Principaux germes isolés

2.3.1. Pseudomonas aeruginosa

Ce sont des bacilles à Gram négatif, aérobies stricts, possèdent une oxydase, non fermentaires, mobiles par une ciliature polaire, respirant ou non les nitrates, oxydant ou non le glucose. Les espèces les plus fréquemment isolées en milieu médical sont : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas putida (Schuster, 2001).

Ces bactéries occupent des niches écologiques variées, mais se retrouvent plus particulièrement dans les milieux humides tels que les eaux douces, les eaux de mer et les eaux thermales. Elles sont considérées comme une flore commensale chez l'homme ou l'animal. Certaines jouent un rôle pathogène dont P. syringae chez les plantes et P. aeruginosa chez l'homme et l'animal (Avril et al.,2000).

Les Pseudomonas sont peu virulents pour l'individu normal, par contre ils sont considérés comme des agents infectieux redoutables lorsque les défenses immunitaires du sujet sont altérées (Avril et al.,2000).

P. aeruginosa dispose d'un impressionnant arsenal de facteurs de virulence, qui lui permet de combattre les défenses de l'hôte tell que le flagelle, les pili, la production d'alginate, le lipopolysaccharide, les facteurs de sécrétion de type III, les protéases sécrétées, les facteurs d'oxydation et les toxines (Pier et Ramphal, 2005),La détection du quorum peut réguler l'expression des facteurs de virulence (Heurlieret al., 2006).

2.3.2. Acinetobacter

Les bactéries du genre Acinetobacter appartiennent à la famille des Moraxellaceae et Acinetobacter baumannii est l'espèce la plus fréquemment identifiée dans les infections humaines .Ce sont des coccobacilles, courts, Gram négatif, non sporulées, parfois capsulés, immobiles (mais pouvant présenter une mobilité par saccade résultant de la présence de fimbriae polaires) (Peleget al.,2008).

Acinetobacter baumannii est également largement répandu dans l'environnement. Il est généralement non pathogène chez les individus sains, sauf peut-être en tant qu'agent d'infection des

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Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

plaies (Jones et al., 2006 ; Davis et al., 2005),Au cours de la dernière décennie, il est devenu une cause croissante d'infection opportuniste grave. Un grand nombre de souches de cette espèce qui provoquent des épidémies ont impliqué des souches multirésistantes, notamment aux carbapénèmes et à l'amikacine, à la colistine et à la tigécycline. L'amikacine, la colistine et la Tigécycline représentant parfois la seule option thérapeutique restante (Bogaerts et al., 2006 ; Coelho et al., 2006).

Acinetobacter ssp est un germe ubiquitaire retrouvé dans les sols, l'eau potable, les eaux de surface ainsi que dans diverses denrées alimentaires (Lambert, 2007).Les facteurs de virulence sont limités, ce qui correspond au potentiel invasif limité de l'organisme. Il ne produit pas de cytotoxines et son lipopolysaccharide à un potentiel endotoxigène incertain. Sa survie accrue est due à la combinaison de la production de bactériocines, de la présence d'une capsule et d'une viabilité prolongée dans des conditions sèches (Wendt et al., 1997).

2.3.3. Brucella

Les Brucella sont de petits bacilles à Gram négatif, aérobies stricts, oxydase positifs, catalase positive. Ce sont des coccobacilles de 0,5 à 1,5 ìm de long et 0,5 à 0,7 ìm de diamètre, non capsulés, qui comprennent trois espèces principales Brucella melitensis, Brucella abortus et Brucella suis, qui sont responsables d'une maladie animale transmissible à l'homme, la brucellose (Fièvre de Malte) (Denis et al.,2007).

Les Brucella sont responsables d'infections génitales avec avortement chez les femelles et lésions testiculaires chez le mâle. Ils pénètrent dans l'organisme par plusieurs voies: cutanée, digestive, respiratoire, puis gagnent par voie lymphatique le premier relais ganglionnaire. Elles se multiplient et disséminent dans tout l'organisme par voie lymphatique et sanguine, ces germes sont phagocytés plus au moins rapidement par les macrophages puis détruits avec libération d'antigène et d'endotoxine (Khetab et al.,2010).

2.3.4. Le complexe Burkholderia cepacia

Bacille à Gram négatif non fermentant, aérobie strict, mobile grâce à plusieurs flagelles polaires, présentant une oxydase lente, Burkholderia cepacia a été décrit pour la première fois en 1950 par Walter Burkholder comme une bactérie phytopatogène isolée à partir d'un bulbe d'oignon dont il causait la porriture (cepa = oignion).En 1977, Vandamme et al., ont montré que l'espèce Burkholderia cepacia était en fait un ensemble de cinq génomovars désigné sous le nom de (complexe B. cepacia), dont seulement trois individualisés en espèces (B.multivoran, B. stabilis et B. vietnamiensis) (Vandamme et al.,1997).Le terme génomovars est utilisé pour différencier des souches phénotypiquement similaires mais génotypiquement hétérogènes. Ainsi, les génomovars

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Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

présentent des génotypes spécifiques mais ne peuvent être distingués par les tests biochimiques usuels employés en laboratoire (Courtney et al.,2004), Actuellement, le complexe cepacia présente neuf génomovars (tableau 1).Les souches sont des bactéries ubiquistes dans l'environnement. Elles sont retrouvées dans le sol, sur les végétaux et dans l'eau.

Tableau 1.Déférentes espèces de complexe B.cepacia (Courtney et al., 2004)

Génomovar	Nom
Génomovar I	B. cepacia sensa stricto
Génomovar II	B.multivorans
Génomovar III	B. cenocepacia
Génomovar IV	B. stabilis
Génomovar V	B.vitenamiensis
Génomovar VI	B. dolosa
Génomovar VII	B. ambifaria
Génomovar VIII	B. anthina
Génomovar IX	B.pyrrocinia

Un certain nombre de facteurs de virulence potentiels ont été identifiés, bien qu'il n'ait pas été prouvé que tous ces facteurs avaient un impact sur la santé (la pathogenèse de la maladie humaine) (Mahenthiralingam et al., 2005). Ces facteurs comprennent les résistances antimicrobiennes intrinsèques (par exemple aux polymyxines et aux aminoglycosides), la capacité à former des biofilms, des pili (Jones et al., 2001). Le complexe B. cepacia est impliqué dans trois groupes d'infections :

? Infections nosocomiales (bactériémies, infections respiratoires, abcès...) ;

? Infections sévères chez les immunodéprimés (bactériémies chez les drépanocytaire...) ;

? Colonisation ou infection respiratoire dans le cadre de mucoviscidose (Segonds et Chabanon,

2001).

2.3.5. Stenotrophomonas maltophilia

Le genre Stenotrophomonas est classé dans la famille des Xanthomonadaceae (ordre des Xanthomonadales, classe des Gammaproteobacteria) et comporte à ce jour quatre autres espèces. S. maltophiliaest une bactérie ubiquiste retrouvée au sein de divers environnemet et occupant des

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Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

niches écologiques à l'interieur et à l'exterieur de l'hopitale. Cette espèce est présente dans le sol, les végétaux(blé, canne à sucre, tournesol...) et divers sources d'eaux (eaux de surface, puits,eaux usées... ). Elle a été également ésolée à partir de lait cru de vache et de brebis, de lait pasteurisé et d'aliments réfrigérés. Chez l'homme sain, cette espèce peut etre isolée des fèces, de la gorge ou des mains, mais le portage semble peut fréquent chez l'animal, S. maltophilia a été mise en évidence chez des poissons, dans les fèces de lapins de lézard et de grenouilles, dans le cloaque des serpents et dans l'intestin des rongeurs de laboratoire (Denton et Kerr, 1998).

La transmission nosocomiale de S.maltophiliaest rare et la plupart des infections sont dues à des souches uniques. Il est associé à une importante morbidité et de mortalité chez les patients immunodéprimés (Nseir et al.,2006).

Les facteurs de virulence comprennent une gamme d'exoenzymes tels que la DNase, RNase, la fibrinolysine, les lipases, l'hyaluronidase, la protéase et l'élastase. Les bactériémies liées aux cathéters veineux centraux et aux pneumonies nosocomiales sont les deux manifestations les plus fréquentes de l'infection vraie due à S. maltophilia. Des taux de mortalité de 10 à 60 % chez les patients présentant une bactériémie due à S. maltophilia ont été rapportés (Pathmanathan et Waterer,2005; Feldman et al., 2002).

1.3.6 Chryseobacterium indologenes

Les espèces de Chryseobacterium sont des bacilles Gram-négatifs oxydase-positifs et ne fermentant pas le glucose qui sont largement distribués dans la nature, et peuvent être isolés des milieux aquatiques, du sol, des plantes et de certains produits alimentaires (Zamora et al., 2012). Chryseobacterium indologenes (anciennement Flavobacterium indologenes) est l'espèce cliniquement la plus importante du genre, provoquant des pneumonies, des bactériémies, des septicémies ainsi que des infections intra-abdominales et des voies biliaires. Principalement pathogène opportuniste, C. indologenes infecte les nouveau-nés et les hôtes immunodéprimés de tous les groupes d'âge (Reynaud et al., 2007 ; Smith et al., 2012). Cependant, le potentiel épidémiologique de cet organisme ainsi que les sources d'infections ne sont pas encore clairs. Bien que peu fréquentes, des infections nosocomiales acquises par des dispositifs médicaux contenant des fluides et des sources d'eau contaminées dans les hôpitaux ont été signalées (Bayraktar et al., 2007 ; Lin et al., 2010).

La connaissance de leur distribution dans l'environnement marin est également rare et seules quelques études ont documenté la présence de C. indologenes, principalement dans les crevettes

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Chapitre 01 : Bacilles à Gram négatif non fermentant

(Matyar et al., 2008 ; Uyaguar et al., 2009) et les phoques (Bogomolni et al., 2008 ; Rose et al., 2009).

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

1. Généralités sur les mammites des bovins laitiers

Une mammite est l'inflammation d'un ou de plusieurs quartiers de la mamelle. L'étiologie principale est infectieuse. Elle se traduit dans la majorité des cas par une réponse inflammatoire de type cellulaire impliquant une augmentation de la concentration en cellule dans le lait (Barone, 2001). C'est une inflammation du tissu de la mamelle qui affecte la production de lait et entraîne des changements pathologiques tels que le gonflement, la douleur, l'oedème, l'inflammation et la fibrose de la mamelle (Shaheen et al., 2016).

Cette maladie résulte de l'invasion des tissus de la mamelle par des espèces procaryotiques (bactéries) et eucaryotiques (mycoses et algues), suivie d'une infection des glandes mammaires (Bradley, 2002).La mammite est considérée comme l'une des pathologies les plus importantes, fréquentes et coûteuses affectant les vaches laitières (Boutet et al., 2005 ;Bradley, 2002),et la plus pénalisante pour les élevages laitiers (Remy, 2010) en fonction de l'agent pathogène responsable (Gröhn et al., 2004).

De nombreux problèmes de santé peuvent également résulter de la moindre qualité de la matière première. En effet, la présence de bactéries dans le lait suite à la traite d'animaux infectés peut entraîner la contamination tout au long de la chaîne de production laitière, provoquant des intoxications alimentaires (Saidiet al., 2021).

2. Les différentes mammites rencontrées en élevage bovin laitier 2.1. Mammites Latentes

Lors d'une mammite latente, la vache n'exprime pas de signe clinique et son lait n'est pas modifié. En effet, malgré la présence du pathogène la mamelle ne réagit pas. Ces mammites sont pourtant extrêmement dangereuses puisqu'elles peuvent entraîner rapidement une contamination de tout le troupeau laitier sans que l'éleveur ne s'en aperçoive (Remy, 2010).

2.2. Mammites Subcliniques

La mammite subclinique est une évolution de la mammite latente, mais elle peut aussi correspondre à une mammite clinique traitée mais dont le traitement n'a pas réussi à éliminer totalement le pathogène. Ces derniers caractérisés par une absence de signes cliniques et par une modification de la composition chimique du lait (baisse des taux de caséine et de lactose, augmentation des taux d'électrolytes). L'inflammation due à l'infection s'accompagne essentiellement d'un afflux de

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

cellules somatiques dans le lait du quartier infecté, particulièrement les polynucléaires. Neutrophiles. Le comptage cellulaire dans le lait dépasse alors 300 000 cellules/ml contre moins de 150 000 cellules/ml chez une primipare saine et moins de 200 000 cellules/ml chez une multipare saine (Remy, 2010; Institut de l'élevage, 2008). Les variations sont uniquement microscopiques et la mammite reste asymptomatique (Bardiau etal.,2014 ).

2.3. Mammites cliniques

La mammite clinique se manifeste par une modification de la sécrétion lactée (lait aqueux, présence de grumeaux....) avec présence des signes primordiaux de l'inflammation (douleur, rougeur, chaleur, gonflement). Dans certains cas, la mammite clinique peut être accompagnée de symptômes généraux tels que la fièvre, la déshydratation de l'animal et faiblesse (Desteaux, 2004).Il est important de noter qu'une mammite subclinique peut devenir clinique si l'immunité de la vache ne parvient plus à assurer une stase bactérienne. De même une mammite clinique peut devenir subclinique si le traitement administré ne parvient pas à éliminer la totalité des pathogènes impliqués (Remy, 2010).La mammite clinique peut être suraigüe, aigue ou chronique :

2.3.1. Mammites aiguës

La douleur et la chaleur associées au quartier caractérisent les douze premières heures de l'infection, vingt-quatre heures après l'entrée des germes, apparaît l'altération du lait et du tissu mammaire : un oedème interstitiel dû aux toxines et à la migration leucocytaire se forme. On note par ailleurs une hyperthermie modérée autour de 39-39,5°C (Remy, 2010).Elles peuvent survenir à tous les stades de la lactation; toutes les bactéries peuvent provoquer ce type d'inflammation de la mamelle (Victor, 2007).

2.3.2. Mammites suraiguës

La mammite suraiguë se caractérise par la rapidité de leur apparition et de leur évolution, souvent mortelles en l'absence de traitement, surviennent généralement quelques jours après le vêlage. Elles peuvent revêtir deux formes chez les bovins, la forme paraplégique et la forme gangréneuse. La forme paraplégique est associée le plus souvent aux coliformes. Elle est caractérisée par une agalaxie brutale, une toxémie, une hyperthermie, une hypocalcémie, de la tachycardie, de l'anorexie, l'atonie du rumen et de la diarrhée. Le quartier atteint est chaud, enflé et douloureux. Le lait peut être blanc avec une consistance aqueuse ou devenir jaune et séreux avec des caillots observables à l'épreuve du bol à fond noir (Remy, 2004; Green et al.,1998).

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

2.3.3. Mammite chronique

Elle est le plus souvent secondaire à une mammite aiguë. Les symptômes locaux sont discrets, lentement le quartier évolue vers l'atrophie du fait de l'installation de zones de fibrose cicatricielle. La mamelle devient noueuse à la palpation. La sécrétion n'est souvent modifiée qu'en début de traite. L'évolution est lente vers le tarissement de la sécrétion au bout de plusieurs mois. Tous les germes donnant des mammites peuvent être isolés (Noireterre, 2006).

3. Etiologie des mammites rencontrées en élevage du bovins Laitiers

Les mammites sont presque exclusivement d'origine bactérienne. Exceptionnellement, elles peuvent être causées par des champignons, des parasites, des agents chimiques, un traumatisme (comme un choc violent ou une agression de la peau du quartier ou du trayon), ou une sténose (engendrée par un dysfonctionnement de la machine à traire ou un papillome) (Remy, 2010).

4. Bactéries Mammo-pathogènes (agents pathogènes responsables de mammites)

À ce jour, plus de 140 espèces potentiellement pathogènes de bactéries (dont Mycoplasma), de champignons, d'algues et de virus sont à l'origine de la mammite bovine (Watts, 1988 ; Petrovski et al., 2011).

Les bactéries responsables de mammites peuvent être distinguées en deux groupes. Le premier groupe est constitué par des bactéries qui vivent sur la vache et se transmettent d'animal à animal ou d'un quartier à un autre à l'occasion du processus de la traite. Ces bactéries sont à l'origine de l'apparition dans les élevages laitiers de mammites contagieuses. Le deuxième groupe des bactéries responsables de mammites est constitué des germes qui vivent dans l'environnement de la vache. Ces germes contaminent directement la mamelle entre les traites (lors du couchage) par simple contact avec la litière qui est une source majeure de contamination favorable à la multiplication des germes dans le cas où l'environnement des animaux est mal entretenu.(Georges et al., 2008).

Parmi les bacilles à Gram négatif qui provoquent la mammite, il s'agit principalement des bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae et à la famille des Pseudomonadaceae (plus particulièrement Pseudomonas aeruginosa) (Spiers et al., 2000).

Les bactéries impliquées dans les mammites bovines ont été classées en fonction de leur impact sur la santé du pis. On distinguait alors les bactéries pathogènes mineures, responsables d'une réaction inflammatoire légère, et des bactéries pathogènes majeures responsables quant à elles de réactions

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

inflammatoires sévères pouvant entraîner la mort de la vache (Vanderhaegen et al., 2014 ; Reyher et al., 2010) (tableau 02).

Tableau02. Principaux caractéristiques des bactéries contagieuses et environnementales retrouvées
dans les infections intra-mammaires chez la vache laitière(Blowey et Edmonson, 2010)

Propriétés	Bactéries contagieuses	Bactéries environnementales
Espèces	Staphylococcus aureus Staphylocoques à coagulase négative Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Corynebacteriumbovis Mycobacterium bovis	Streptococcus uberis Streptococcus dysgalactiae coliformes (Escherichia coli et Klebsiellaspp.) Staphylocoques à coagulase négative Trueperellapyogenes Bacillus cereus Pasteurella
Source(s)d'infection	Principalement par les autres quartiers infectés mais aussi par la peau des trayons et du pis	Environnement contaminé : litière, eau, plantes, fumier, mouches et peau de la vache
Mode de transmission	Transmission d'une vache à l'autre durant la traite par l'intermédiaire d'un vecteur	Contamination des trayons entre les traites par contact direct avec environnement contaminé
Type de mammite	Mammite souscliniqueMajoritaire Comptage Cellulaire Somatique augmenté	Mammite clinique majoritaire Comptage Cellulaire Somatique pouvant être très élevé au moment de la mammite mais redevenant rapidement normal

Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

5. Principaux facteurs de risques (Serieys, 2015)

? La température de la litière : elle ne doit pas excéder 40 °C à 10 cm de profondeur, soit 30°C en surface. Plus élevée, elle deviendra très favorable au développement des germes d'environnement

? Les manchons trayeurs : une collerette de manchon usée, un manchon rayé constituent une niche pour les germes, permettent leur transmission. Des manchons mal adaptés favorisent l'agression du trayon.

? L'anneau de compression sur le haut du trayon : s'il est normal en début de lactation, il devient un indicateur de risque, puis un facteur de risque si plus de 10% des vaches sont atteintes. Il indique un phénomène de « grimpage » des faisceaux responsable d'une traite incomplète. Ce phénomène peut être associé à des faisceaux trop légers, un vide trop élevé, ou des manchons inadaptés. L'anneau de compression peut, au contraire, être la conséquence d'une surtraite.

6. Diagnostic des Mammites en élevage bovin laitier

Un bon diagnostic de l'infection et de l'agent pathogène en cause, et cela de façon rapide, permettra d'adapter le traitement et d'obtenir un taux de guérison élevé. Différents outils sont à la disposition du vétérinaire mais également du producteur (Viguier et al., 2009 ; Wallace, 2007). On peut citer certain méthodes de diagnostic :

6.1. Le Taux cellulaire du Tank TCT

Il donne une idée de la situation sanitaire du troupeau laitier. Il correspond en quelque sorte à une moyenne des Concentrations Cellulaires Somatiques Individuelles (CCSI) des vaches du troupeau (Noireterre, 2006).

6.2. Le CCSI ou Comptage Cellulaire Somatique Individuelle

Le Comptage Cellulaire Somatique Individuelle correspond à la moyenne des taux cellulaires des quatre quartiers d'une vache (Pezon et Gremy, 2015 ;Noireterre, 2006).

Une relation linéaire inverse a été définie entre un CCS faible (par exemple <100 000 cellules ml-1) et une qualité de lait élevée, ainsi qu'un CCS élevé (par exemple >200 000 cellules ml-1) et une qualité de lait en déclin (Sharma et al., 2011 ; Bradley, 2002).

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6.3. Le Test CMT ou Test de Mammite de Californie

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

Le test CMT est également appelé test au Leucocytes. C'est un test très simple, directement réalisable en salle de traite par l'éleveur et peu onéreux. Le résultat est visible à l'oeil nu et n'est donc pas quantitatif contrairement au TCT et aux CCSI (Salat, 2014 ; Dudouet, 2004).

Le CMT, lorsqu'il est réalisé régulièrement, présente les mêmes indications que le comptage cellulaire individuel. Il a l'avantage, par rapport à ce dernier, d'être moins coûteux, de pouvoir être réalisé par tous les éleveurs et de fournir une image plus précise des infections en donnant des résultats quartier par quartier. Il peut également être utilisé pour vérifier, voire sélectionner les animaux à traiter au moment du tarissement. Dans la pratique, le CMT constitue donc la méthode de choix pour la détection des mammites par l'éleveur (Gambo et AgnemEtchike, 2001).

6.4. D'autres tests de détection de mammites

Les autres tests courants de détection de la mammite bovine sont la conductivité électrique, le pH, le NaOH (test du côté blanc), la mesure de la N-acétyl-â-D-glucosaminidase, la déshydrogénase du lactate, la culture bactérienne du lait et le test immuno-enzymatique du lait ainsi que le test de réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Mahmoud, 2013).

D'autres techniques de biologie moléculaire développées pour le diagnostic de la mammite bovine incluent la détection basée sur la protéomique, les biopuces et les biocapteurs (Deb et al., 2013).

7. Guérison spontanée

Il est possible, suivant l'état immunitaire de la vache, d'obtenir une guérison spontanée de l'infection. Les polynucléaires neutrophiles contrôlent les bactéries dans 20% des cas (Remy, 2010).

8. Traitement

Actuellement, il n'existe pas de procédure universelle pour traiter les mammites. Pour la plupart des campagnes de traitement, le traitement recommandé dépend de l'étendue de la détérioration de la santé de la mamelle (Preez, 2000).

Il n'est pas inutile de rappeler que la réussite d'une antibiothérapie est liée à une intervention précoce de traitement dès l'apparition des premiers symptômes pour éviter l'extension ou la persistance de l'infection et augmenter les chances de réussite thérapeutique (Faroult et Seryes, 2005).

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Chapitre 02 : Mammites en Elevage Bovin Laitier

Un traitement se doit d'être aussi précoce que possible et son choix dépendra des symptômes présentés par l'animal. On privilégiera le traitement en lactation pour les mammites cliniques. Les vaches infectées pendant la lactation devront impérativement faire l'objet d'un traitement au tarissement. On peut y voir deux raisons. La première est une plus grande efficacité curative et la seconde se base sur le fait que les vaches infectées pendant la lactation présentent également un risque plus élevé de nouvelles infections pendant le tarissement (Mcdougal, 2009).

9. Effets de la mammite sur la santé humaine

La mammite clinique et la mammite subclinique sévère n'endommagent pas seulement les tissus de la mamelle et la production de lait et causent des dommages financiers en affectant la santé des animaux, mais elles constituent également une menace sérieuse pour la santé humaine en affectant

négativement la qualité nutritionnelle du lait (Gurjar et al., 2012 ; Schukken et al.,
2009 ;Gröhnet al., 2004).

Des souches de bactéries résistantes sont continuellement développées en raison de l'utilisation d'antibiotiques et leur transfert à l'homme ne peut être ignoré (Virdis et al., 2010).Le lait mastiqué obtenu à partir de l'animal laitier traité aux antibiotiques peut être la source de la résistance aux antimicrobiens chez l'homme. Pour garantir la sécurité et la qualité du lait, l'utilisation excessive d'antibiotiques doit être contrôlée (Syuhada et al., 2016).

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Chapitre 03 : Antibiorésistance

1. Antibiotiques

1.1. Définition des antibiotiques

Le terme d'antibiotique vient du grec « bios » qui signifie la vie et « anti » qui signifie contre. Le rôle d'un antibiotique vient de son nom : c'est donc littéralement « agir contre la vie ». Donc les antibiotiques sont toute substance antibactérienne d'origine biologique, synthétique ou semi-synthétique(Guillemot et al., 2006 ; Muylaert et al., 2012), capable d'inhiber sélectivement certaines voies métaboliques des bactéries, sans exercer habituellement d'effets toxiques pour les organismes supérieurs (Lavigne et al., 2008).

C'est en 1941 que fut utilisé pour la première fois un antibiotique « la pénicilline », découverte en 1928 par le bactériologiste anglais Alexander Fleming pour traiter un patient atteint de septicémie à staphylocoques (Besassier et al., 2005).

1.2. Classification et action des antibiotiques

Les antibiotiques constituent un important groupe de médicaments pour la médecine. À coté de leurs propriétés de lutter contre les infections humaines dues aux bactéries pathogènes, ils sont également utilisés en médecine vétérinaire (Emmanuel,2003). Les antibiotiques agissent à un niveau précis dans les structures bactériennes et chaque famille possède son site d'action propre(Figure 1).

b) Espèce périplasmique

3)Dihydroptéoratesynthétase (Sulfamides)

4) Fixation à la sous-unité 50 S
duribosome (macrolides,
synergistines,lincosamides,

7) Membranes cytoplasmiques (polymyxines)

6) Acides nucléiques (quinolones, rifamycines, nitro-imidazolés)

5) Fixation à la sous-unité 30 S du ribosome (aminosides,

???-lactamine (PLP) 2)Glycopeptides(Dala)

a)Paroi bactérienne

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Figure 1. Cibles des principaux antibiotiques (Benlmouden et Hakkou, 2007)

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Chapitre 03 : Antibiorésistance

Tableau 3. Type d'activité et modalités d'action des principales classes d'antibiotiques (Demoré et

al., 2012)

Familles et classes	Action d'antibiotiques	Concentration ou temps dépondant	Effets inoculum	Effet post antibiotique
Pénicillines	Bactéricide	Temps dépondant	Oui	Faible ou nul
Céphalosporines	Bactéricide	Temps dépondant	Oui	Faible ou nul
Carbapénèmes	Bactéricide	Concentration dépondant	Non	Oui
Monobactames	Bactéricide	Temps dépondant	Oui	Faible ou nul
Glycopeptides	Lentement Bactéricide	Temps dépondant	Oui	Non
Polymyxines	Bactéricide	Concentration dépondant	Oui	Non
Fluoroquinolones	Bactéricide	Temps et Concentration dépondant	Non	Oui
MLK	Bactériostatique	Temps dépondant	Oui	Non
Synergistines	Bactéricide	Temps dépondant	Oui	Bactériopause
Aminosides	Bactéricide	Concentration dépondant	Non	Oui
Tétracycline	Bactériostatique	Concentration dépondant	Non	Non

On distingue plusieurs familles d'antibiotiques, pour certaines divisées en sous-classes (Tableau 4), permis lesquelles les â-lactamines sont les antibiotiques les plus utilisés dans la pratique clinique courante (Rodriguez-Villalobos et Struelens, 2006).Cette famille comprend un grand nombre de molécules, toutes caractérisées par la présence d'un cycle J3-lactame (Figure 2) indispensable à l'activité antibiotique, une faible toxicité, associées à un mode d'action fort complexe sur des protéines de la membrane cytoplasmique, dénommées protéines liant la pénicilline (PLP) ou penicillinbindingproteins (Cavallo et al., 2004). La figure 3 présente les principaux classes de cette famille.

Figure 2. Cycle J3-lactame (Bessard, 2004)

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Chapitre 03 : Antibiorésistance

Figure 3. Classification des ?-lactamines (Cavallo et al., 2004)

1.3. Les antibiotiques en médecine vétérinaire

Les antibiotiques sont la seconde classe de médicaments utilisés en médecine vétérinaire. Ils sont utilisés depuis les années 50 chez les animaux producteurs de denrées alimentaires (Sanders, 2005). C'est des substances antimicrobiennes utilisés en médecine humaine et vétérinaire appartiennent aux mêmes familles, à l'exception de quelques sous familles spécifiques de la médecine humaine, ont pour objectifs la maîtrise des maladies, la restauration ou le maintien du bien-être animal et la prévention de la transmission des agents pathogènes aux autres animaux voire à l'homme (Schwarz et al., 2001 ; Phillips et al., 2004). La caractéristique principale des antibiotiques est leur grande spécificité d'action car ils agissent sur des cibles cellulaires structurales ou métaboliques spécifiques des procaryotes. Cette caractéristique leur permet d'être efficace à de faibles concentrations et d'être, la plupart du temps, non toxiques pour les espèces animales (Guillemot et al., 2006 ; Collectif, 2008).

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Chapitre 03 : Antibiorésistance

1.5. Antibiothérapie des Mammites en élevage bovins laitiers dans le monde

Le plan de traitement proposé par le vétérinaire praticien se base sur le modèle épidémiologique du troupeau établi à partir des documents de l'élevage et d'un sondage bactériologique (Angoujard, 2015).

1.4.1. Traitement antibiotique des vaches en lactation

IL existe 3 types de préparations antibiotiques intra-mammaires dans le commerce (Hamlaoui, 2017):

? AR: action rapide. Ces traitements sont administrés en cas de mammite aiguë en lactation.

? LA: longue action. Ces traitements sont indiqués en cas de mammite chronique en lactation.

? HL: hors lactation. Ces traitements sont destinés aux mammites subcliniques ou chroniques en cours ou au moment du tarissement.

1.4.2. Traitement antibiotique des mammites en première intention

Ce traitement utiliser généralement vis-à-vis les mammites en premier choix. Il est administré par voie locale (intra-mammaire) avec un antibiotique à spectre large Gram- et Gram+. Le Choi de l'antibiotique repose tout d'abord sur le spectre d'activité, par exemple : â-lactamines et aminosides(Hamlaoui, 2017).

1.4.3. Plans de traitement au Tarissement

Les deux plans de traitement principal pendant le tarissement sont l'antibiothérapie systématique (consiste à traiter toutes les vaches au tarissement avec un antibiotique à spectre large). Elle est utilisée quand la prévalence des mammites apparues au cours de la lactation est moyenne à élever) et l'association d'une obturation du trayon systématique avec une antibiothérapie sélective (l'utilisation des antibiotiques pendant le tarissement et la lactation suivante). Toutes les vaches auront une obturation du trayon mais seules les vaches infectées auront une antibiothérapie avec un spectre large) (Angoujard, 2015).

1.4.4. Antibiotiques utilisables en lactation

Il existe actuellement trois spécialités d'antibiotiques destinées au traitement des mammites subcliniques en lactation parmi eux :Stop M(une pénicilline G), Pirsue (Pirlimycine) et Gentamam (la Gentamicine et la Cloxacilline) (Rattez, 2017).

1.4.5. Antibiotiques utilisables au tarissement

De nombreuses classes d'antibiotiques sont utilisées : les pénicillines M à spectre étroit, les céphalosporines de deuxièmes générations à large spectre, les céphalosporines de dernières

23

Chapitre 03 : Antibiorésistance

générations au spectre extrêmement large, les ansamycines et également les aminosides avec un spectre extrêmement large (Rattez, 2017).

2. Antibiorésistance

La résistance aux antibiotiques est une réponse physiologique des bactéries à tout usage d'antibiotique et c'est la capacité d'une bactérie spécifique à survivre en présence d'un antibiotique qui a été initialement efficace pour traiter les infections causées par la bactérie (D'Costa et al., 2011 ; Chancey et al., 2012 ; Magiorakos et al., 2012).

2.1. Types de résistance

2.1.1. Résistance naturelle

La résistance naturelle d'une bactérie est une caractéristique propre a une espèce bactérienne, qu'est partagée par toutes les souches normales de cette espèce, elle délimite le spectre naturel de l'antibiotique et constitue une aide à l'identification (Rebiahi,2012).

2.1.2. Résistance acquise

Contrairement à la résistance naturelle, la résistance acquise intéresse certaines souches au sein d'une espèce bactérienne normalement sensible à cet antibiotique (El bouderkaoui, 2015).

La résistance acquise résulte de mécanismes qui sont liés à l'ADN de la bactérie et sont donc caractérisés par des mutations ou des transferts de gènes résistant d'une bactérie résistante vers une bactérie sensible, via un plasmide, un transposon ou un intégrons.

Les plasmides présentent un «génome cargo », quant à lui, rassemble des gènes apportant un phénotype qui peut se révéler avantageux pour la cellule hôte, comme des gènes de résistance ou de virulence(Anders et al.,2009; Barcia et al., 2011; Harrison et Brockhurst, 2012).

Les transposons sont, eux aussi, des éléments transposables (mobiles par transposition puisque codent une transposase). Ce dernier compose par un site d'insertion ne possèdent pas de gènes de résistance aux antibiotiques, mais peuvent intervenir dans leur expression (Toleman et al.,2006).

Les intégrons sont des systèmes génétiques de capture et d'expression de cassettes codant des résistances aux antibiotiques. Ces éléments ne sont, par eux-mêmes, ni mobiles, ni transférables, mais sont souvent associés à des éléments génétiques mobiles et/ou transférables tels que les transposons (Tolemanet al.,2006; Mazel, 2006; Schlüter et al., 2007).

24

Chapitre 03 : Antibiorésistance

2.1.3. Résistance croisée et Co-résistance

La résistance croisée résulte d'un seul mécanisme biochimique et concerne des antibiotiques appartenant à la même famille. La Co-résistance est liée à plusieurs mécanismes (plusieurs gènes de résistance impliqués) et concerne des antibiotiques appartenant à différentes familles (SekhriArafa, 2011).

2.2. Vois d'acquisition des gènes de résistance

Une bactérie peut devenir résistante à un antibiotique par mutation survenant au niveau du gène codant pour la cible de l'antibiotique au sein du chromosome.

Une bactérie peut également acquérir du matériel génétique étranger par incorporation de segments d'ADN libre dans leur chromosome (transformation). Des gènes de résistance peuvent aussi être transférés lors d'une infection par un bactériophage (transduction) et lors de phénomène de conjugaison de transposons conjugatifs et de plasmides. Ces mouvements intercellulaires représentent la transmission horizontale (Boerlin et Reid-Smith, 2008) (Figure 4).

Figure 4. Voies d'acquisition de résistance aux antibiotiques, d'après(Levy, 2007) 2.3. Antibiorésistance chez certain bactéries à Gram négatifs non fermentant

2.3.1. Pseudomonas aeruginosa

Les infections à P.aeruginosa chez l'animal sont rapportées, telles que certains cas de mammites bovines (Mekic et al., 2011). En effet, P.aeruginosa présente la particularité d'être naturellement multi-résistante à de nombreux antibiotiques grâce à l'usage mal raisonné d'antibiotiques qui peut

25

Chapitre 03 : Antibiorésistance

donc conduire à la sélection de cette espèce bactérienne, qu'il devient ensuite très difficile à éliminer.

P.aeruginosa possède une membrane externe faiblement perméable, ce qui lui confère une résistance naturelle à de nombreux antibiotiques, dont la plupart des â-lactamines hydrophiles (Carpentier et al., 2003).

La résistance acquise de cette bactérie consiste à la résistance enzymatique par : les ß-lactamases (Philippon, 2005), l'hyperproduction de céphalosporinase chromosomique de classe C (Poirel, 2006) et les carbapénèmases de classe B (Queenan et Bush, 2007).

2.3.2 . Acinetobacter baumannii

A.baumannii produit naturellement une céphalosporinase de type AmpC qui est normalement exprimé à bas niveau, et ne diminue pas l'efficacité des céphalosporines à large spectre (céphalotine) ou des carbapenems. L'insertion d'une séquence spécifique ISAba1 en amont du gène bla ampC favorise l'expression de cette â-lactamase de type AmpC en fournissant des séquences promoteur ce qui entraîne la résistance à la ceftazidime (Nordmann et al., 2009).

Dans un autre cas cette bactérie possède une pompe à efflux AdeABC dont les substrats sont : aminoglycosides, tétracyclines, érythromycine, chloramphénicol, triméthoprime, fluoroquinolones, â-lactamines, et encore récemment, la tigécycline (Wieczorek et al., 2008).

2.3.3. Chryseobacterium indologenes

Le choix d'agents antimicrobiens efficaces contre les infections à C.indologenes est difficile en raison de l'étendue de sa résistance aux antibiotiques. Des souches cliniques résistantes à presque toutes les pénicillines, aux céphalosporines à faible spectre et, surtout, aux carbapénèmes ont été signalées (Hsueh et al., 1997 ; Bellais et al., 1999 ; Kirby et al., 2004 ; Sader et Jones, 2005 ;

Chou et al,. 2011 ; Chen et al., 2012).Ce phénotype semble être intrinsèque à cette bactérie et
associé à la production de ce phénotype semble être intrinsèque à cette bactérie et associé à la production de Métallo-â-Lactamases (LBM)codés par le chromosome qui présentent une grande hétérogénéité moléculaire et biochimique (Bellais et al., 2000 ; Perilli et al., 2007 ; Lin et al., 2008).

2.4. Utilisation des antibiotiques chez les animaux et le développement de la résistance

L'utilisation d'antibiotiques dans la production animale est blâmée pour contribuer à la résistance bactérienne croissante aux antibiotiques chez les humains. Cependant, presque tous les

26

Chapitre 03 : Antibiorésistance

microorganismes ciblés par les agents antimicrobiens possèdent la capacité d'y devenir résistants (Kuipers et al., 2016).

27

28

Matériel et Méthodes

1. Matériel 1.1. Animaux

Notre étude s'est déroulée durant la période allant du mois de Février jusqu'au mois d'Avril 2022. Elle a porté sur un effectif de 200 vaches laitières en lactation, de différentes races et à différents stades de lactation. Ces vaches ont été choisies après l'observation de l'état général de l'animal. Elles appartiennent à plusieurs élevages bovins laitiers situés dans différent communes de la wilaya de Chlef (figure 05, Tableau 05). Les animaux sont en stabulation entravée dans la majorité des élevages et tous les aspects de bien-être des animaux ne sont pas respectés (mauvaise conception de l'habitat, sol glissant, litière insuffisante, aération déficiente, humidité...).

W

1 ferme

N

S

1ferme

1 ferme

E

2 fermes

1 ferme

1ferme

3 fermes

4fermes

5ferme

3 fermes 1 ferme

1ferme

4fermes

1 ferme

Figure 05.Localisation géographique de différentes fermes dans la wilaya de Chlef

29

Matériel et Méthodes

Tableau 04. Liste des fermes sélectionnée pour prélèvements

Ferme sélectionnée	Nombre des prélèvements
Ferme Amour	10
Ferme El nakhla	6
Ardh baidha	23
El brancia	15
Mihoubi	3
Chegga	5
Medjadja	1
Sendjass	7
Haouche el ghaba	22
Oulad Mghazi	8
Harchoun	3
Sidi Saleh	11
El ghorf	4
El glaftia	3
Hdjer el Baidhe	2
Oulad bekhaira	3
Oulad Abess	1
Yarmoul	4
Zemoura	2
Ouad sli	1
Hranfa	5
Siahi	1
Chettia	3
Mouamnia	5
Bsakra	10
Boukaaben	14
Taougrit	7
Zebouja	1
Oum Droue	20
Totale :29	200

30

Matériel et Méthodes

1.2. Questionnaire

Cette partie permet l'évaluation des mammites sur le terrain et de récolter toutes les informations en

relation avec le sujet. Pour cela, nous avons fait recours à un questionnaire (fiche d'enquête)

(Annexe 01) qui a porté sur les principaux points suivants :

> Estimation de la fréquence des mammites dans les élevages visités ;

> L'effet des différents paramètres sur l'apparition des mammites (type d'élevage, état de propreté,

nature du sol, équipements et alimentation...) ;

> Détermination des différentes molécules d'antibiotiques utilisées et de la présence d'une

éventuelle Antibiorésistance.

1.3. Matériel de prélèvements

Le matériel nécessaire pour le prélèvement est :

> Glacière isotherme avec pains de glace ;

> Pots de prélèvement stériles ou des tubes à vis stériles ;

1.4. Matériel de laboratoire

1.4.1. Milieux de culture (Annexe 02)

> Mueller Hinton Agar ;

> Bouillon nutritif ;

> Mac Conkey agar ;

> Gélose nutritive ;

1.4.2. Tests biochimiques et réactifs

> Galerie API 20NE et API 20E^. ;

> Test d'oxydase (disques d'oxydases) ;

> Réactif CMT ;

> Réactif Nit 1, Nit 2, James; VP 1, VP 2 et TDA .

1.4.3. Solutions

> Eau physiologique ;

> Solution d'EDTA 0,5 M, pH 8 ;

> Solution de BET (10 mg/ml) ;

> Solution de violet de gentiane ;

> Solution de lugol (solution d'iodo-iodurée) ;

> Solution de fuchsine .

31

Matériel et Méthodes

1.4.4. Enzymes, Tampons et amorces

> Taq polymérase (5ug/ul) ;

> Tampon TAE 0.5X ;

> DNTP (10 umol) ;

> Amorces : TEM-F ,TEM-R, VIM-F,VIM-R..

1.4.5. Antibiotiques

> Ticarcilline/ acide clavulanique (75/10) ;

> Pipéracilline (75ug) ;

> Imipénème (10ug) ;

> Céfoxitine (30ug) ;

> Aztréonam (30ug) ;

> Amikacine (30ug) ;

> Ciprofloxacine (5ug).

2. Méthodes

Pour une vache donnée, nous considérons 2, 3 ou 4 quartiers atteints comme un seul prélèvement

(un seul cas de mammite).

2.1. Prélèvements

Les prélèvements du lait ont été réalisés au niveau des élevages, selon les étapes suivants :

> Désinfecter les mains de l'opérateur et porter des gants à usage unique ;

> Laver les trayons avec l'eau ;

> Désinfecter les trayons dans l'ordre suivant : quartier postérieur gauche (QPG), quartier antérieur

gauche (QAG), quartier postérieur droit (QPD) et quartier antérieur droit (QAD) ;

> Essuyer avec compresse stérile ;

> Eliminer les premiers jets du lait, ouvrir le pot stérile d'une main en gardant le capuchon

disponible entre le pouce et l'index, puis prélever environ 10à 15 ml du lait. Ce pot est

immédiatement refermé pour éviter la contamination ;

> Marquer et identifier chaque pot avec des étiquettes portant les abréviations du matricule de

vache, du lieu de prélèvement et du quartier mammaire gauche ou/et droit (QPG, QAG, QPD ou

QAD) ;

> Placer les pots dans la glacière et acheminer vers le laboratoire. Les échantillons analysés ont été

conservés à +4°C.

32

Matériel et Méthodes

2.2. Test de mammite de Californie (CMT) (Dudouet, 2004 ; Salat, 2014)

Le test CMT est également appelé test au teepol® ou Leucocytest. C'est un test très simple, directement réalisable en salle de traite par l'éleveur et peu onéreux, Le résultat est lisible à l'oeil nu et n'est donc pas quantitatif.

Le test CMT est un test rapide, pas cher et simple pour le dépistage de la mammite subclinique dans des conditions de terrain. Le principe du test repose sur l'utilisation d'un corps tensio-actif, le teepol à 10% et d'unindicateurdepH,lepourpredebromocrésolàproportionégale,mélangéedansunverrede montre avec 2 ml de lait. Le teepol est un détergent qui fait éclater les cellules somatiques et réagit avec leur ADN en formant un gel dont la viscosité d'autant plus élevée que la teneur encellule est importante. Ce détergent permet l'appréciation visuelle de la viscosité du précipitéobtenuquipermettrad'apparierleniveaud'inflammationdemamelle.Lebromocrésol,indicateur depH,changedecouleur en fonction de l'acidité du mélange (Tableau 5).

Tableau 5. Lecture et interprétation du test CMT

Score	Interprétation	Réaction visible
0	Négatif	Mélange fluide
1	Trace	Floculat très fin qui disparait après agitation
2	Fiable positif	Floculat très net sans tendance à la gélification
3	Distinct positif	Floculat épais avec d'un gel
4	Forte positif	Viscosité fortement augmentée. Un gel cohésif et solide, avec une surface convexe

2.3. Enrichissement

Cette étape consiste à ensemencer 1 ml du lait à l'aide d'une micropipette dans un tube de 5 ml de bouillon nutritive et incuber à 37°C pendant 24.

2.4. Isolement et purification

L'isolement a été réalisé par ensemencement de la culture d'enrichissement (dans le bouillon nutritif) par épuisement dans un milieu sélectif des bacilles à Gram négatif non fermentants : le milieu Mac Conkey puis incubation les boites pendant 24 heures à 37°C.

La purification s'est effectuée par le réensemencement de chaque colonie suspecte sur les mêmes milieux sélectifs. La pureté des souches est révélée par des colonies homogènes ayant le même aspect phénotypique (couleur, taille et forme).

33

Matériel et Méthodes

2.5. Conservation des souches

Les souches ainsi ré-isolées et purifiées sont repiquées dans des tubes de gélose nutritive inclinée (GNI), incubées à 37°C pendant 24 heures puis conservées au réfrigérateur à une température de 4°C.

2.6. Coloration de Gram

Apres vérification de leur pureté, les isolats bactériens ont été soumis aux examens microscopiques après la coloration de Gram.

2.6.1. Principe

Le but de cette coloration est de déterminer la morphologie et l'aspect pariétal des bactéries à Gram négatif non fermentants.

2.6.2. Technique

A. Réalisation de frottis

> Sur une lame, déposer une goutte d'eau physiologique stérile ;

> Ajouter à l'aide d'anse de platine stérilisée une fraction de colonie bien isolée ;

> Étaler et fixer à la chaleur (au-dessus de flamme de bec bunsen) ;

> Poser la lame séchée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.

B. Réalisation de la coloration

Voici succinctement les différentes étapes de cette coloration :

> Coloration par le violet de gentiane : Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau de robinet ;

> Mordançage au lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 30 secondes, Rincer à l'eau de robinet ;

> Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte un mélange alcool acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10secondes). Rincer sous un filet d'eau de robinet ;

> Recoloration à la fuchsine : laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau de robinet ;

> Sécher la lame et observer au microscope optique à objectif 100 à l'immersion.

2.6.3. Lecture

Les bactéries Gram positif apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram négatif sont colorées en rose

34

Matériel et Méthodes

2.7. Test d'oxydase 2.7.1. Principe

Ce test permet la mise en évidence d'une enzyme la phénylène diamine oxydase de la bactérie à partir de leur culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable d'oxyder le réactif : N dimethyl para phénylène diamine qui est incolore, et en présence de l'enzyme, il libère un composé bleu violacé.

2.7.2. Technique

A l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée, une colonie est déposée sur un disque oxydase placé sur

une lame.

2.7.3. Lecture

La présence d'une cytochrome-oxydase se traduit, pendant 20 à 60 secondes, par l'apparition d'une

coloration rouge virant rapidement au violet foncé

2.8. Galerie API 20NE ( www.biomerieux.com)

2.8.1 Principe

Le principe consiste à inoculer dans les microtubes, à l'aide d'une pipette pasteur, une suspension bactérienne homogène. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs.

Cette technique est utilisé pour déterminer certains caractères biochimiques des bactéries Gram négatif non fermentants tel que : la production des sucres (mannose, glucose...), assimilation d'azote...

2.8.2 Technique

A. Préparation de la galerie

? Réunir fond et couvercle d'une boite d'incubation et répartir environ 5ml d'eau physiologie

dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide ;

? Inscrire la référence de la souche sur la languette latéral de la boite (ne pas inscrire la

référence sur le couvercle celui-ci pouvant être déplacé lors de la manipulation) ;

? Sortir la galerie de son emballage individuel ;

? Placer la galerie dans la boite d'incubation.

B. Préparation de l'inoculum

? Ouvrir une ampoule d'API NaCl 2ml de la notice du produit ou utiliser un tube contenant 2ml de la solution saline à 0,85 sans additif ;

35

Matériel et Méthodes

> A l'aide d'une pipette pasteur, prélever 1 à 4 colonies de morphologie identique, par aspiration ou par touche successives, utiliser préférentiellement des cultures jeunes (18-24) heures ;

> Réaliser une suspension d'opacité «égale à 0,5 de Mc Farland, cette suspension doit être utilisée extemporanément.

C. Inoculation de la Galerie

> Remplir les tubes (et non les cupules) des tests NO3 à PNPG avec la suspension précédent en utilisant la pipette ayant servi au prélèvement, pour éviter la formation des bulles au fond des tubes, poser la pointe de la pipette sur le côté de la cupule, en inclinant légèrement la boite d'incubation vers l'avant ;

> Remplir tubes et cupules des tests GLU à PAC en veillant à créer un niveau horizontal ou légèrement convexe, mais jamais concave, des cupules incomplètement remplier ou trop remplier peuvent entrainer des résultats incorrect ;

> Remplir d'huile de paraffine les cupules des trois tests (GLU- ADH- URE) pour former un ménisque convexe ;

> Refermer la boite d'incubation et incuber à 29C° pondant 24 heures.

4.8.3. Lecture

Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture (Annexe 03).

> Noter sur la fiche les résultats de toutes les réactions spontanées (GLU, ADH, URE, ESC, GEL, PNPG).

> La révélation des 2 testes NO3 et TRP doit se faire en mettant les tests d'assimilation à l'abri d'une contamination par l'aire, pour cela placer le couvercle de la boite d'incubation au-dessus de ces tests pendant la période de révélation ;

> Ajouter une goutte de réactifs NIT1 et NIT 2 dans la cupule NO3 ;

> Ajouter une goutte de réactif JAMES dans la cupule TRP.

2.9. Antibiogramme (Comité de l'antibiogramme de la société française de microbiologie, 2021)

2.9.1. Principe

L'antibiogramme a été réalisé selon la méthode de diffusion sur milieu gélosé (Muller Hinton), méthode recommandée par le CA-SFM. Cette méthode est utilisée pour déterminer la sensibilité ou la résistance des bactéries aux antibiotiques.

36

Matériel et Méthodes

2.9.2. Technique

A. Préparation de l'inoculum

> A partir d'une culture pure de 24H sur milieu d'isolement, racler à l'aide d'une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques ;

> Décharger l'anse dans 5 à 10 ml d'eau physiologique stérile à 0,9% ;

> Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland ;

> L'inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s'il est trop faible ou bien de l'eau physiologique stérile s'il est trop fort.

B. Ensemencement

> Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne ;

> L'essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le

décharger au maximum ;

> Frotter l'écouvillon sur la totalité de la surface gélosée (Muller-Hinton), sèche, de haut en bas,

en stries serrées ;

> Répéter l'opération deux fois, en tournant la boîte de 60° à chaque fois sans oublier de faire

pivoter l'écouvillon sur lui-même ;

> Finir l'ensemencement en passant l'écouvillon sur la périphérie de la gélose.

C. Application des disques

> Déposer les disques d'antibiotiques à l'aide d'une pince stérile suivant la Figure6 ;

> Presser chaque disque d'antibiotique à l'aide de pince, pour s'assurer de son application. Une fois appliqué le disque ne doit pas être déplacé ;

> Laisser les boites 20 mn à la température ambiante pour permettre une pré-diffusion de l'antibiotique, puis les incuber pendant 18-24 H à 37°C #177;1°C.

37

Matériel et Méthodes

ATM

IPM

CAZ

AK

TCC

CIP

PRL

Figure 6. Disposition des antibiotiques sur les boîtes d'antibiogrammes.

AK: Amikacine, CIP: Ciprofloxacine, PRL : Pipéracilline, CAZ : Ceftazidime, ATM : Aztréonam
IPM :Imipénème ,TCC : Ticarcilline/ acide clavulanique

2.9.4. Lecture

> Les résultats ont été interprétés selon les critères du comité de l'antibiogramme de la société

française de microbiologie (CA-SFM, 2021) ;

> Mesurer avec précision les diamètres des zones d'inhibition à l'aide d'un pied à coulisse ;

> Comparer les résultats obtenus aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture

correspondante, ensuite la bactérie est classée dans l'une des catégories: sensiblerésistante ou

intermédiaire(Annexe 4 ).

2.10. Recherche de gènes de résistance par PCR

La PCR est une technique bien établie qui amplifie, de façon sélective, certaines régions d'ADN

génomique en fonction de la liaison d'amorces qui sont propres aux régions en question (Aboura,

2010).

2.10.1. Extraction de l'ADN par Choc thermique (Perez-Hernandez et al.,2002)

> Mélanger 100ul de l'eau distillée avec une colonie ;

> Incuber au bain marie à 100°C pendant 10 min ;

> Mettre au congélateur à -4°C pendant 10 min ;

> Ré-incuber au bain marie à 100°C pendant 5 min ;

> Centrifuger le mélange 5min à 12000 rpm ;

> Récupérer le surnageant dans un nouveau Eppendorf.

38

Matériel et Méthodes

2.10.2. Dosage d'ADN par la spectrophotométrie

C'est l'une des méthodes les plus répandues pour le dosage des acides nucléiques. La spectrophotométrie mesure l'absorbance ou la densité optique (DO) des acides nucléiques à 260 nm (absorbent dans l'ultraviolet). Parallèlement, nous mesurons l'absorbance à 280 nm pour le dosage des protéines. Un rapport R est déterminé pour estimer la pureté de l'ADN :

R= DO260/DO280

? Pour une solution d'ADN pure : le ratio doit être compris entre 1,8= R = 2 ;

? Pour une solution d'ADN contaminée par les protéines : le ratio est inférieur à 1,8 ;

? Pour une solution d'ADN contaminée par les ARN : le ratio est supérieur à 2. Enfin, la concentration de la solution d'ADN est calculée par la formule suivante :

C (ng/ul) = DO260 ×50 × D

? D: dilution

2.10.3. Amplification de l'ADN par PCR

La PCR standard est effectuée pour détecter les â-lactamases de type TEM et VIM.

A. Préparation du mix

Le mélange réactionnel (24 ìl) ou le Mix se fait dans une pièce spéciale avec le port de gants pour

éviter toute contamination et qui sera par la suite distribué dans des tubes Eppendorf (Tableau 05).

Les amorces d'oligonucléotides sont énumérées respectivement sur le tableau 06.

Tableau 06.Produits du mix pour la PCR

Produit	Réaction pour un échantillon
dNTP(10 mM)	0.5ìl
Tampon 1-10X (MgCl2 20mM)	2.5 ìl
Taq (5pig/pil)	0.25 ìl
Chaque amorce (10 piM)	1.5 ìl
Eau	17.75 ìl
Volume total du mix	24 ìl

39

Matériel et Méthodes

Tableau 07.Les amorces d'oligonucléotidiques utilisées pour la PCR

Gènes cibles	Amorces	Séquences	Taille de l'amplicon (pb)
blaTEM	TEM-F	ATGAGTATTCAACATTTCCGTG	840
	TEM-R	TTACCAATGCTTAATCAGTGAG
BlaVIM	VIM-U	ATTGGTCTATTTGACCGCGTC	382
	VIM-L	TGCTACTCAACGACTGCGCG

Chaque constituant de ce mix est multiplié par le nombre d'échantillons étudiés, puis 24ul de ce mélange sont distribués dans chaque tube Eppendorf PCR stériles :

> Témoin négatif : 1ul d'eau distillé stérile plus 24ul de mix ;

> Témoin positif : 1ul de DNA positif pour 24ul du mix ;

> Echantillons : 1ul de DNA de notre échantillon est ajouté à 24ul de mix;

> Volume total : 25ul par échantillon (les témoins ou les échantillons à analyser).

Le mix et les DNA sont transférés dans des tubes Eppendorf de type « Master cycler

personnal » et sont introduits dans le thermocycleur.

B. Programmation du thermocycleur

Les réactions d'amplification sont réalisées à l'aide d'un thermocycleur : Applied Biosystems Gene

Amp, PCR système TC-3000. Cette réaction est cyclique, et elle se fait en trois étapes :

> Dénaturation : consiste à chauffer avec une température élevée pour séparer l'ADN à double

brin en brisant les liaisons hydrogènes ;

> Hybridation : une fois l'ADN séparé, on refroidit rapidement pour que les amorces se fixent à

chaque extrémité complémentaire de l'ADN à simple brin ;

> La polymérisation ou élongation : Après la fixation des amorces, l'ajout de la Taq polymérase

et de nucléotide permet la synthèse des nouveaux brins d'ADN.

Les différentes étapes sont reprises ci-dessous:

> 95°C pendant 10 min ;

> 35 cycles de :

? 95°C pendant 45 s ;

? 53°C pendant 45 s ;

? 72°C pendant 1 min ;

> 72°C pendant 10 min.

40

Matériel et Méthodes

2.10.4. Electrophorèse sur Gel d'agarose (Sambrook et Russel, 2001)

A. Principe

L'électrophorèse sur gel d'agarose est la méthode de choix pour la séparation, la purification et l'identification des fragments d'ADN et d'ARN. Sous l'influence d'un courant électrique, les acides nucléiques chargés négativement se déplacent à travers le gel d'agarose vers la borne positive (l'anode). Les molécules seront séparées dans le gel dû au fait qu'elles ne migrent pas toutes à la même vitesse.

B. Technique

1) Préparation du gel d'agarose

> Pour un gel de 1%, dissoudre par chauffage jusqu'à ébullition, 1g d'agarose (Sigma) dans 100 ml

de tampon TAE 0.5 X (Annexe 054) ;

> Refroidir la solution à 55°C dans un bain marie, puis ajouter du BET (Bromure d'éthidium)

(chaque 5 ul du BET dans 100 ml de TAE) qui va se fixer sur l'ADN (cette molécule s'intercale

entre les bases de la molécule d'ADN) et va permettre la visualisation des bandes d'ADN dans le

gel sur la table UV du transilluminateur;

> déposer le gel dans un moule dont les 2 extrémités ont été préalablement fermées par du ruban

adhésif;

> Déposer un peigne dans le gel afin de réaliser des puits;

> Laisser solidifier;

> Retirer le peigne du gel et le ruban adhésif du moule;

> Placer le moule avec le gel dans la cuve d'électrophorèse;

> Ajouter un volume de tampon TAE 0.5 X dans la cuve préalablement remplie jusqu'à ce que le

gel soit immergé (environ 1 mm au-dessus).

2) Ensemencement

> Répartir sur un morceau de Parafilm des gouttes de tampon de charge (Bleu de Bromo-phénol)

qui assure le maintien du dépôt en immersion dans le puit et permet la visualisation de la

migration;

> Mélanger à l'aide d'une micropipette, 10 ul de chaque échantillon avec le tampon de charge;

> Transférer les 5 ul des mélanges dans les puits du gel;

> Deux puits sont réservés au témoin positif et au témoin négatif et un puit au marqueur de poids

moléculaire;

> Déposer les échantillons dans les autres puits.

41

Matériel et Méthodes

3) Migration

> Fermer la cuve et brancher l'alimentation de la cuve de manière à ce que les dépôts soient de

côté cathode (-);

> Appliquer un voltage de 100 volts pendant 30 min;

> Couper l'alimentation quand le colorant a parcouru la distance requise ou laisser la migration

arriver jusqu'à 1 cm du bord de la cuve (cette ligne est appelée le front de migration);

> Débrancher le générateur de la cuve.

4) Lecture (Visualisation par Transilluminateur)

> La visualisation des bandes d'ADN du gel se fait sur la table UV du transilluminateur dans une

chambre noire;

> En fonction de la taille des fragments d'ADN étudiés, on repèrera la bande et sa taille

respectivement par rapport au témoin positif et au marqueur de PM.

42

43

Partie 03 : Résultats

1. Prélèvement

Entre la période de 17 février au 27 avril 2022, 200 prélèvements de lait mammiteux ont été effectués, à partir de 29 fermes distribuées sur 14 communes de wilaya de Chlef, dont 5 prélèvements ont été réalisés dans la commune de Medjadja , 4 prélèvements ont été réalisés à chacune des communes de Chlef et Sendjass, 3 prélèvements à Chettia et Oum Droue, 2 prélèvements à boukadir et nous avons enregistré un prélèvement dans chacune des communes de Sobha, Oulad Fares , Harcoune , Oulad Abess , Oued Sli , Hranfa , Taougrit et Zebouja (Tableau 08).

Tableau 08. Répartition des prélèvements réalisés dans les communes de wilaya de Chlef

Communes	Nombre des fermes	Nombre des prélèvement
Sobha	1	10
Medjadja	5	16
Chettia	3	29
Chlef	4	28
Senjass	4	23
Oulad fares	1	22
Oum droue	3	38
Hrchoune	1	3
Oulad Abess	1	1
Boukadir	2	16
Oued sli	1	1
Hranfa	1	5
Taougrit	1	7
Zebouja	1	1
Total	29	200

La révélation des infections mamelles se traduit par la présence d'une viscosité fortement augmentée, un gel cohésif et solide avec une surface convexe après le test de CMT. Nos résultats montrent que de 127 vaches ont présenté un test positif (Figure 07). Sur la totalité des prélèvements du lait considérés (200 vaches), nous avons trouvé 37% des échantillons qui présentent un lait normal, alors que 63% des échantillons du lait sont considérés mammiteux (Figure 08).

44

Partie 03 : Résultats

Figure 07. TestCMT positif du lait

Négative

36,5%

positive

63,5%

Figure 08. Résultat de CMT de 200 vaches laitières

Cependant, durant la période d'étude de 3 mois, les infections mammaires sont réparties différemment avec un pic au mois de Février dans lequel, on dénombre 70,07% des cas de mammites, suivi d'une décroissance régulière de taux aux mois de Mars et d'avril (Figure 09).

45

Partie 03 : Résultats

Février

74.07%

Mars

64%

Avril

57%

Figure 09. Fréquence de mammites en fonction des mois de prélèvements

Les résultats du test CMT du lait prélevé vis-à-vis les communes de la wilaya de Chlef sont représentés sur le diagramme de la Figure 10. La commune de Chettia atteint une fréquence maximale d'infection d'environ 10% suivie par les communes d'Oum Derou et de Chlef (8,5% pour chacune), Sendjess et Ouled Fares (8% pour chacune) et Medjaja (5,5%).

Alors que d'autre communes couvrent des basses fréquences d'infection dont Boukadir (4%), Sobha (3,5%), Taougrit (3%), Hrenfa (2%), Harchoune (1%) et les dernières communes Oued Sli , Zeboudja et Ouled Abbes (0,5% pour chacune).

46

Partie 03 : Résultats

12.00%

10.00%

4.00%

2.00%

6.00%

0.00%

8.00%

0.50%

8%

8.50%

10%

3.50%

8%

5.50%

0.50%

4%

8.50%

0.50%

1%

2%

3%

Figure 10. Fréquence de mammites en fonction des communes de la wilaya de Chlef

La figure 11 représente la répartition des cas de mammites en fonction du stade de lactation. Les résultats montrent une fréquence maximale de contamination dans plus de cinq mois suivant le vêlage au cours duquel on dénombre 55% du total des cas de mammites.

2-4 MOIS

39%

1 MOIS

6%

>=5 MOIS

55%

Figure 11. Fréquence des cas de mammites en fonction de stade de lactation.

Partie 03 : Résultats

La répartition des mammites en fonction du rang de lactation est représentée par la figure 12. L'incidence des mammites diminue avec le rang de lactation des animaux. Il faut signaler que cette fréquence est plus élevée chez les vaches au deuxième rang.

25.00%

20.00%

15.00%

10.00%

0.00%

5.00%

11.50%

1 2 3 4 5 6 7 8

22.50%

13.50%

7.50%

5.50%

1.50%

0.50% 0.50%

Figure 12. Fréquence de mammites en fonction du rang de lactation

Par rapport à l'âge des bovins, la fréquence de mammites est beaucoup plus enregistré chez les troupeaux appartiennent à la classe d'âge de 3 à 4 ans (Figure 13).

16% 16%
						8% 8%
7%
2%								3%		2%
									1%		1%	1%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Age

Fréquence de mammite

18% 16% 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0%

47

Figure 13. Fréquence de mammites en fonction de l'âge des bovins