Memoire Online - Etude de l'effet immunomodulateur de la membrane lamellaire d'echinoccocus granulosus sur la production du NO au cours des MICI

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE HOUARI BOUMEDIENNE

Mémoire de projet de fin d'études en vue de l'obtention du Diplôme de Master
Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie

Présenté par : Melle BENAZZOUZ Sara et Soutenu le 08 / 06 / 2015 devant le jury composé de :			Melle BOUHARA	Lynda
Présidente :	D^r	AMRI M.	MCA	(FSB/USTHB)
Promotrice :	P^r	TOUIL-BOUKOFFA C.	Professeur	(FSB/USTHB)
Co-Promotrice :	Melle	SOUFLI I.	Doctorante	(FSB/USTHB)
Examinatrice :	D^r	RAFA H.	MAA	(FSB/USTHB)
Membre invitée :	Melle	TOUMI R.	MAB	(FSB/USTHB)

de la Faculté des Sciences Biologiques de l'Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumedienne.

Nous tenons à exprimer notre profond respect et nos plus vifs remerciements à Madame TOUIL-BOUKOFFA. C., Professeur à la Faculté des Sciences Biologiques (FSB) et directrice de l'équipe Cytokines et NO synthase : Immunité et Pathogénie, de nous avoir accueillies Lynda et moi au sein de son laboratoire pour notre stage de fin d'étude, ainsi que pour la qualité de son enseignement. Madame TOUIL-BOUKOFFA nous a donné goût à la science, à l'immunologie en particulier, ainsi qu'à la recherche scientifique.

À Madame AMRI. M., pour l'honneur qu'elle nous a fait en acceptant de présider ce jury, ainsi que pour sa pédagogie et sa grande amabilité.

À Madame RAFA. H., membre de l'équipe `Cytokines et NO synthase : Immunité et Pathogénie, pour avoir accepté d'examiner ce travail, et de l'enrichir par ses propositions ainsi que pour son enseignement de qualité et sa gentillesse.

À Mesdemoiselles SOUFLI I. et TOUMI R., de nous avoir inculqué les règles de bonne pratique, de leur disponibilité ainsi que de leurs qualités humaines et pédagogiques. Merci de nous avoir consacré votre temps et votre énergie pour le bon déroulement de notre stage, pour vos conseils et la confiance que vous nous avez accordé quotidiennement. Merci encore à Mademoiselle SOUFLI pour son engagement et son soutien ainsi que pour la pertinence de ses remarques et de ses feed-back.

e dédie ce mémoire aux nombreuses personnes qui m'ont apporté leur aide et leur soutien.

À Lynda, mon binôme, mon amie surtout. Merci d'exister, d'être toi, si gentille et douce. Voilà maintenant 3ans qu'on est amie, j'espère que la vie ne nous séparera pas et même si elle nous sépare un jour, sache que je ne t'oublierai jamais.

À Chahinez, Mhamed, Narimene, Shéraz et Rania. Merci pour les bons moments passés ensemble au cours de notre stage, restez comme vous êtes.

À mes chers BPM, nous avons partagé tellement d'examens, d'exposés ainsi qu'une sortie inoubliable qui nous a soudé tous ensemble. Vous êtes les meilleurs, je vous souhaite le meilleur dans votre vie et tout ce que vous pouvez rêver. Je vous aime tous sans aucune distinction.

À Malik, merci pour ton soutien sans faille et tes encouragements tout au long de mon cursus universitaire.

À tous mes amis et plus spécialement Chérifa, ainsi qu'à tous les Bosaristes qui me sont chers.

Je dédicace ce travail à mes parents sans lesquelles je ne ferai pas partie de ce monde, merci d'être les meilleurs parents qui puissent exister.

À mon frère ainsi qu'à mes Tantes, mes oncles, mes grands-parents et mes cousins.

Ma mère qui représente mon tout, trouve en ce travail le fruit de tes sacrifices, de tes prières, de tes encouragements, mon éternele reconnaissance et mon amour infini.

Lyes pour ton soutien constant et pour le sourire que tu dessines sur mon visage.

« C'est dans l'effort que l'on trouve satisfaction et non dans la réussite. Un plein d'efforts est une pleine victoire ».

Introduction 1

Chapitre I : Généraliés

Chapitre II : Matériel et méthodes

1.	Préparation de l'extrait de la membrane lamellaire	23
2.	Induction d'une colite aigue par le DSS chez des souris BALB/c	24
3.	Prélèvements sanguins	25
4.	Préparation des macrophages péritonéaux	25
5.	Dosage du monoxyde d'azote	25
6.	Récupération et étude histologique du côlon	26
7.	Etude histologique	27
8.	Isolement et culture des cellules mononuclées du sang périphérique des patients
	atteints de MICI : Etude de l'effet immunomodulateur de la ML	28
9.	Etude statistique	29

Chapitre III : Résultats

II. Effet de l'IL-4 sur la production in vitro du monoxyde d'azote au niveau des

I. Effet de l'extrait brut de la ML sur la production du NO ex vivo au cours des

Chapitre IV : Discussion générale

Figure 3:Anatomie de l'épithélium intestinal et du système immunitaire de la muqueuse 5

Figure 4:Caractéristiques histologiques des MICI (Xavier & Podolsky ; 2007). 6

Figure 6:Les réponses immunitaires de l'hôte dirigées contre la membrane lamellaire du

Figure 8: courbe étalon de dosage du NO selon la méthode de Griess modifiée. 26

Figure 9: Effet de la ML sur les paramètres cliniques de la colite induite par le DSS 30

Figure 10:Longueur des différents colons issus des trois groupes expérimentaux 31

Figure 12: Effet de la ML sur la production in vivo du monoxyde d'azote (NO). 33

Figure 13: Effet de la ML et/ou du DSS sur la production in vitro des nitrites résiduels par

les macrophages péritonéaux. 34
Figure 14: Effet de l'Il-4 et/ou du DSS sur la production in vitro des nitrites résiduels par les

macrophages péritonéaux 34
Figure 15: Concentrations des nitrites résiduels ex vivo au niveau des PBMC de

Figure 16: effet de la ML sur la production ex vivo du NO par les PBMC de patients atteints

Figure 17: Schéma proposé pour illustrer les altérations induites par le DSS et l'effet protecteur probable de la membrane lamellaire.

Tableau 1: Testes utilisés pour le diagnostic des MICI (Hendrickson et al., 2002). 7

Chapitre I: Généralités

Chapitre II: Matériel &

Chapitre III: Résultats

Chapitre VI:

Conclusion

Introduction

Introduction :

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont des affections qui résultent d'une inflammation chronique de la paroi intestinale et sont associées à des désordres immunitaires graves caractérisés par un déséquilibre des voies de régulation immunitaires.

Les données épidémiologiques indiquent une corrélation inverse entre l'incidence des MICI et la prévalence des helminthiases. En effet, la forte prévalence des MICI dans les pays développés a été associée à un faible taux d'exposition aux helminthes. Ces données appuient l'hypothèse hygiéniste selon laquelle une moindre exposition aux entéro-pathogènes tels que les helminthes dans l'enfance conduirait à une maturation inadéquate du système immunitaire. Il en résulte le développement de maladies auto-immunes et inflammatoires (Fiasse et al., 2009).

La pathogenèse de ces maladies reste complexe et implique une large variété de molécules dont les cytokines, plusieurs études ont rapporté une surexpression des cytokines pro inflammatoires au cours des MICI, à l'origine d'une production accrue de métabolites réactifs d'oxygène et de nitrogène, dont le monoxyde d'azote (NO) (Touil-Boukoffa et al., 1998 ; Rafa et al., 2010).

Le monoxyde d'azote est un médiateur inflammatoire important produit principalement par la NO synthase inductible (NOS2), il a été associé aux lésions les plus sévères au cours des MICI et des colites expérimentales (Kolios et al., 2004; Rafa et al., 2010 ; Abdelouhab et al., 2012 ; Toumi et al., 2013), sa production est régulée positivement par les cytokines de la voie Th1 (Rafa et al., 2010).

De plus une étude récente de notre équipe a démontré une corrélation positive entre la production du NO in vivo et des cytokines de la voie Th17 (Rafa et al., 2013).

À travers ces données et à travers les travaux mettant en exergue le rôle inhibiteur de la membrane lamellaire hydatique (ML) sur la production du NO in vivo chez la souris et ex vivo chez des patients atteints d'hydatidose (Steers et al., 2001 ; Amri & Touil-Boukoffa, 2011 ; 2014), nous nous sommes penchés sur l'évaluation de l'effet de la membrane lamellaire au cours des MICI.

La première partie de notre travail a pour but d'étudier l'effet curatif de la ML extraite à partir du cestode Echinoccocus granulosus au cours d'un modèle expérimental de colite induite par le Dextran Sulfate Sodium (DSS), nous avons examiné son effet sur les paramètres cliniques, ainsi que les altérations morphologiques et histologiques induites par le DSS. De plus, nous avons évalué son impact sur la régulation de la NOS2 à travers la production du NO, in vivo et in vitro dans notre modèle d'étude.

La deuxième partie de notre travail a ciblé l'étude de l'effet immunomodulateur de la ML sur la NOS2 et ce, à travers l'évaluation de la production du NO ex vivo par les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) de patients atteints de rectocolite hémorragique et de maladie de Crohn.

Chapitre I : Généralités

1. Anatomie du côlon :

Le gros intestin entoure l'intestin grêle sur trois côtés et s'étend de la valve iléo-caecale jusqu'à l'anus en formant la dernière partie du tube digestif. Sa fonction principale consiste en l'absorption d'eau et d'électrolytes provenant des résidus alimentaires indigestibles et leur évacuation de l'organisme sous forme de fèces semi-solides (Schaffler & Menche ; 2004).

Le côlon ascendant, le côlon transverse, le colon descendant et le colon sigmoïde (Schaffler & Menche ; 2004).

2. Histologie du côlon :

Comme celle du tractus digestif, la paroi du côlon est composée principalement de quatre couches.

- La muqueuse : Au niveau de la muqueuse colique on ne trouve plus de villosités sur la paroi, mais exclusivement des cryptes. L'épithélium pavimenteux des cryptes est composé majoritairement de cellules muqueuses caliciformes et de cellules épithéliales.

- La sous-muqueuse : une mince couche de tissu conjonctif entre la muqueuse et la couche musculaire.

- La musculeuse : on trouve des fibres musculaires lisses qui sont mises en action de manière involontaire, elles sont aussi bien circulaires que longitudinales.

Chapitre I : Généralités

3. Système immunitaire de la muqueuse intestinale :

Les muqueuses de manière générale sont dotées d'un système immunitaire lymphoïde associé aux muqueuses, appelé le MALT. Le GALT ou le tissu lymphoïde associé à la muqueuse intestinal est la partie la plus large et la plus complexe du système immunitaire. Non seulement, il reconnaît plus d'antigènes que toute autre partie du corps, mais il doit aussi faire clairement la distinction entre les organismes invasifs et les antigènes inoffensifs, tels que les protéines alimentaires et les bactéries commensales. La réponse habituelle à des antigènes inoffensifs intestinaux est l'induction de la tolérance immunologique locale et systémique.

Le GALT peut être subdivisé en sites inducteurs et en sites effecteurs reliés entre eux par le système lymphatique. Le site inducteur est formé par des tissus organisés sous forme de ganglions lymphatiques mésentériques (MLN), de plaques de Peyer et de follicules lymphoïdes isolés (FLI). En revanche, le site effecteur est représenté par l'épithélium intestinal abritant des lymphocytes intra-épithéliaux (IEL) et d'un chorion fait de tissus conjonctif et très riche en cellules immunitaires, notamment les plasmocytes sécréteurs d'IgA. (Abreu, 2010). Les plaques de Peyer contiennent plusieurs types cellulaires incluant les macrophages, les cellules dendritiques, les lymphocytes B et les lymphocytes T : TCD8+, TCD4+, TCD3+ et Tãä (Jung et al., 2010).

Les réponses immunes sont initiées par la reconnaissance de motifs moléculaires conservés au sein des espèces microbiennes (PAMPs, pathogens-associated molecular patterns) par des récepteurs de l'immunité innée appelés PRR (pattern recognition receptor). Les quatre familles de PRR identifiées à ce jour comprennent des protéines transmembranaires comme les récepteurs de type Toll (TLR, Toll-Like Receptor) et les lectines de type C ainsi que des récepteurs cytoplasmiques tels que les récepteurs NOD (NLR, Nucleotide oligomerization domain -like receptor). Ces récepteurs sont exprimés par les cellules épithéliales et par les cellules présentatrices d'antigènes comme les cellules dendritiques (DC) et les macrophages.

Chapitre I : Généralités

Par ailleurs, les cellules épithéliales de l'intestin remplissent une fonction de cellules présentatrices d'antigènes grâce à l'expression des molécules du CMH I et II à leurs surfaces. Elles jouent un rôle dans les réponses immunitaires innées et adaptatives au niveau de la muqueuse intestinale en exprimant à leur surface des récepteurs de nombreuses chémokines et cytokines. Elles produisent donc de nombreux signaux immuno-régulateurs, limitant l'inflammation à un état stable.

Des IEC spécialisées, appelées cellules Microfold (cellules M) jouent un rôle important dans l'échantillonnage des agents microbiens présents dans la lumière intestinale. En effet, elles ont pour rôle la capture d'antigènes luminaux de micro-organismes à partir de la lumière intestinale grâce à leur transport vésiculaire actif (activité d'endocytose) pour la présentation au système immunitaire de la muqueuse sous-jacente. Ces cellules M sont concentrées dans les plaques de Peyer et les follicules lymphoïdes isolées (Neutra et al., 2001 ; Peterson & Artis ; 2014).

Les cellules de Paneth quant à elles, peuplent la base des cryptes de Lieberkühn dans l'intestin grêle de la plupart des mammifères. Elles jouent un rôle important dans la réponse immunitaire innée via la production de peptides antimicrobiens. Elles expriment à leur surface des PRR tels que les TLRs et des récepteurs intra-cytoplasmique tels que le NOD2. Ces récepteurs reconnaissent des motifs bactériens déclenchant une cascade de signalisation qui aboutit à l'activation du NF-êB (Ouellette, 2010).

Un autre élément important de la barrière intestinale implique les immunoglobulines A sécrétoires (sIgA). Les sIgA favorisent la clairance des antigènes et des micro-organismes pathogènes de la lumière intestinale en empêchant leur contact avec les récepteurs des cellules épithéliales, conduisant ainsi à leur neutralisation dans le mucus et leur élimination ultérieure par les activités péristaltiques et mucociliaires (McCole, 2014).

Les cellules dendritiques (DC) présentent les antigènes à des cellules T CD4 + naïves, selon le microenvironnement cytokinique, ces cellules T auxiliaires se différencient vers Th1, Th2, Th9, Th17, Th22. Elles sont alors activées et circulent ensuite à la lamina propria intestinale, où elles exercent des fonctions effectrices. À l'état physiologique et en absence d'agents pathogènes invasifs, les cellules dendritiques induisent la différentiation des LT vers un profil T régulateur (Treg). De plus, elles stimulent la sécrétion d'IgA par les lymphocytes B. Une balance homéostatique est maintenue entre les cellules Treg et les cellules T effectrices. Les DC jouent aussi un rôle majeur dans l'échantillonnage des antigènes de la lumière intestinale, grâce à leur capacité à exprimer des protéines des jonctions serrés qui leurs permettent la formation de dendrites trans-épithéliales qui pénètrent le lumen intestinal et entrent en contact d'antigènes exogènes (Wells et al., 2011 ; Peterson & Artis ; 2014).

Les macrophages au niveau de la muqueuse intestinale sont situés directement sous la couche épithéliale, ils jouent ainsi un rôle important dans l'échantillonnage des antigènes de la lumière intestinale (MacDonald et al., 2011; Bar-On et al., 2011).

Chapitre I : Généralités

En réponse à divers stimuli, les macrophages peuvent subir une activation classique M1 (stimulée par les ligands des TLR ou IFN-ã) ou alternative polarisation M2 (stimulée par l'axe l'IL-4 / IL-13). Les macrophages M2, contrairement aux M1, ont une faible expression de l'IL-12, une forte expression de l'IL-10, du TGF-â, et de l'arginase-1, et présentent des fonctions anti-inflammatoires et de réparation tissulaire (Gordon, 2003).

L'épithélium intestinal est l'une des surfaces muqueuse les plus larges, elle recouvre plus de 400m², représenté en une monocouche organisée en cryptes et en villosités. Il est composé de quatre lignées cellulaires : Les entérocytes qui ont pour fonction l'absorption, constituent les cellules épithéliales intestinales (IEC) les plus abondantes. Les cellules caliciformes productrices de mucus, des cellules entéro-endocrines hormones productrices et les cellules de Paneth, qui produisent des peptides antimicrobiens (Figure 3).

L'épithélium intestinal est constitué d'une couche de cellules épithéliales fortement liées par des jonctions serrées, formant ainsi une barrière physique imperméable contre l'invasion des pathogènes. Il sépare les antigènes de la lumière intestinale des cellules du système immunitaire muqueux. De plus, il est recouvert d'une fine couche de mucus qui limite, d'une part, le contact avec les antigènes bactériens et favorise, d'autre part, la rétention des molécules antibactériennes produites par les cellules de Paneth (McCole, 2014).

Les cellules stromales, les lymphocytes B (en particulier les plasmocytes productrices d'IgA), les lymphocytes T, les macrophages et les cellules dendritiques de la lamina propria se trouvent directement en dessous de l'épithélium intestinal. En outre, des sous-ensembles de cellules T, les lymphocytes intra-épithéliaux (IELs) comprennent les cellules T conventionnelles, ainsi que les cellules T ãä et les cellules NKT. Les IELs et certaines cellules dendritiques se positionnent entre les IECs (Figure3) (Abreu, 2010).

Figure 3 : Anatomie de l'épithélium intestinal et du système immunitaire de la muqueuse.

Chapitre I : Généralités

II. Les maladies inflammatoires chroniques intestinales :

La rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique du côlon, le rectum est touché chez 95% des patients, avec un degré variable d'atteinte proximale. Sur le plan histologique, l'inflammation se limite à la muqueuse et consistes-en des ulcérations, des oedèmes, des abcès cryptiques, une distorsion des glandes muqueuses, une déplétion des cellules caliciformes et des hémorragies sur toute la longueur du côlon. Ces lésions sont accompagnées d'une infiltration par les leucocytes polymorphonucléaires et les cellules mononuclées. La RCH évolue par poussées et se manifeste chez le patient par des diarrhées et des rectorragies (Hendrickson et al., 2002).

2.2 La maladie de Crohn (MC) :

Contrairement à la rectocolite hémorragique, la MC peut atteindre n'importe quelle partie du tractus gastro-intestinal, de l'oropharynx à la région anal. Les segments atteints sont fréquemment séparés par des intervalles de muqueuse saine.

Chapitre I : Généralités

Du point de vue histologique, l'inflammation peut être trans-murale et peut s'étendre à travers la séreuse, résultant en la formation de fistules. Il apparait des ulcérations superficielles au niveau des Plaques de Peyer et des foyers inflammatoires chroniques s'étendant à la sous-muqueuse, parfois accompagnés de granulomes. La localisation la plus commune est la région iléo-caecale (Hendrickson et al., 2002).

2.3 Diagnostic :

Avant de pouvoir confirmer le diagnostic des MICI, il est important d'exclure l'éventualité d'une infection par des pathogènes entériques qui pourrait les mimer tels que Salmonella, Shigella, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas, Yersinia, Eschericha coli O157:H7, Clostridium difficile, Giardia lamblia, Histoplasma, Mycobacterium tuberculosis, et Entamoeba histolytica. (Tableau I)

Une fois ces infections exclues, d'autres analyses plus approfondies de diagnostic des MICI sont effectuées. (TabIeau I) (Hendrickson et al., 2002).

Tableau I : Testes utilisés pour le diagnostic des MICI (Hendrickson et al., 2002).

3. Epidémiologie et distribution géographique des maladies inflammatoires chroniques intestinales :

Initialement décrites aux États-Unis et en Europe du Nord, les MICI touchent désormais de nombreuses régions du globe que l'on pensait jusqu'ici épargnées. Les études épidémiologiques font ainsi état d'une augmentation de l'incidence des MICI dans les pays en voie de développement, parallèlement à leur niveau d'industrialisation (Lotfus & Edward ; 2004).

En effêt, les MICI ont été principalement caractérisée comme maladies des pays industrialisés, avec une prévalence accrue dans le monde développé. Les taux d'incidence et de prévalence varient selon un gradient nord/sud au sein des zones géographiques étudiées.

La prévalence de la MC en Amérique du Nord varie de 44 à 201/100 000 habitants, et celle de la RCH à partir de 37,5 à 238 / 100,000 habitants; en Europe, la prévalence de la MC varie de

Chapitre I : Généralités

8 à 214 /100.000 habitants et celle de la RCH de 21 à 294/100.000 habitants (Cosnes et al., 2011). Bien que les pays en développement ont traditionnellement rapporté une plus faible prévalence des MICI, leur incidence est en hausse (par exemple, Inde et Chine) (Lotfus & Edward ; 2004 ; Molodecky & Kaplan ; 2010).

En Europe du Sud, et au Maghreb, l'incidence paraît croître encore dans certaines régions.

En Algérie, le taux d'incidence annuel moyen des MICI connaît une recrudescence. En effet, une étude réalisée par Boucekkine entre 1981-1985 a montré un taux d'incidence de 2,17/100.000 habitants par an au niveau de la région du grand Alger. Une étude récente réalisée au niveau de la ville de Constantine a rapporté un taux d'incidence de 9,8/100 000 habitants par an, situant notre pays dans la zone d'incidence intermédiaire (Hammada et al., 2011).

L'étiologie des MICI a été largement étudiée au cours des dernières décennies ; cependant, les facteurs étiologiques de la pathogenèse de ces maladies ne sont pas encore pleinement compris (Molodecky & Kaplan ; 2010).

4.1. Les facteurs génétiques:

Il existe des variations génétiques dans plus de 100 à 160 gènes distincts qui augmenterait le risque d'apparition de la MC et de la RCH (Korzenik & Podolsky ; 2006).

Le Caspase recruitment domain family, member 15 (NOD2/CARD15) a été le premier gène identifié et spécifiquement associé à la MC (IBD1). Les mutations de CARD15 associées à la MC ont été impliquées dans le défaut de clairance des bactéries intracellulaires au niveau de l'épithélium intestinal humain et également à la réponse immunitaire altérée aux composants bactériens, mais aussi au défaut d'activation du facteur nucléaire -kB (NF-kB) ( Kozernik & Podolsky ; 2006).

De plus l'identification d'une variation au niveau du gène codant pour la protéine reliée à l'autophagie ATG16L1 chez les patients atteints de MC confirme l'implication d'un défaut de clairance des bactéries. En effet, ces variations induisent des aItérations immunoIogiques, dont les principales sont un défaut dans la dégradation par autophagie, l'altération de la présentation des antigènes bactériens aux Lymphocytes T et une déficience dans la formation de granules dans les cellules de Paneth au cours de la MC (Gianchecchi et al., 2014).

Des variations au niveau des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien de l'integrité de la barrière éphitéliale ont été égalment décrites. Le CDH1 est associé à la RCH et à la MC. Il code pour les protéines d'adhésion A-cadherin, ces dernières jouent un rôle essentiel dans l'adhésion cellule-cellule et sont également nécessaires pour la formation des jonctions serrées.

Le gène codant pour MUC3 a été associé à la MC et la RCH. Des allèles rares dans MUC3 pourraient coder pour des protéines de mucine avec des altérations conformationnelles.

Chapitre I : Généralités

Étant donné que les O-glycosylation et la N-glycosylation dépendent de la structure de la protéine de type mucine, une modification conformationnelle de la protéine pourrait entraîner une diminution de la glycosylation. Cela pourrait conduire à une sensibilité accrue aux protéases intestinales bactériennes et à la dégradation de la mucine, contribuant ainsi à la rupture de la fonction de barrière (McCole, 2014). Ces données suggèrent l'implication de l'altération de la barrière épithéliale dans la pathogenèse des MICI.

Plusieurs gènes impliqués dans la voie de signalisation de l'IL-23, spécifiquement IL-23R, JAK2, STAT3, IL-12B (encodage p40) ont été associés aux MICI, ces données soulignent la forte implication de l'axe IL-23/IL-17 dans la pathognie des MICI (Anderson et al., 2011).

4.2. Les facteurs environnementaux:

Les données épidémiologiques et génétiques ont souligné le rôle probable des facteurs environnementaux dans la genèse des MICI (Baron et al., 2005 ; Economou & Pappas ; 2008 ; Guo et al., 2014).

En effet, l'incidence des MICI a tendance à être plus élevés dans les latitudes nordiques. Plusieurs groupes ont examiné la variation géographique de l'incidence des MICI dans un même pays et ont suggéré un gradient nord/sud. De plus, une étude réalisée au niveau de la ville de Constantine a montré que la distribution des malades vivants en milieu urbain était de 88 contre 12 % en milieu rural, soit un ratio de 7,30 (Hammada et al., 2011).

Les études génétiques ont démontré que la concordance entre les jumeaux homozygotes varie de 20 à 62 % pour la MC et de 6 à 19% pour la RCH (Halfvarson et al., 2007). De plus, les variations du gène NOD2 par exemple sont retrouvées chez seulement 10 à 50% des patients atteints de la MC (Lesage et al., 2002).

L'interaction entre les facteurs génétiques et environnementaux dans la genèse des MICI est souvent expliquée par l'hypothèse de l'hygiène. Cette hypothèse expliquerait la prévalence quasiment nulle ou faible des MICI dans les régions avec une forte prévalence des helminthiases (Ponder, 2013).

L'hypothèse de l'hygiène des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin a été proposée dans les années 1990 par Weinstock et al, celle-ci stipule que l'éducation des enfants dans un environnement extrêmement propre et une exposition réduite aux parasites intestinaux (helminthes en particulier), affecte négativement le développement du système immunitaire, ce qui les prédispose à l'âge adulte aux MICI (Ben-Ami Shor et al., 2013).

D'autre part, la barrière intestinale joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie intestinale. Par conséquent, l'altération de la flore commensale suivant l'utilisation d'antibiotiques ou la perturbation de la barrière intestinale par des agents tels que les médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) peut augmenter le risque de contracter la maladie (Ananthakrishnan ; 2013).

Chapitre I : Généralités

De plus, plusieurs facteurs de risque environnementaux, ont été étudiés dont les plus important sont le tabagisme et l'apendisectomie (Frolkis et al., 2013 ; Molodecky & Kaplan ; 2010). Il a été montré que le tabagisme est un facteur protecteur de la RCH, mais de risque pour la MC.

L'effet «opposé» du tabagisme sur ces deux conditions inflammatoires offre la possibilité de définir des mécanismes impliqués dans les deux maladies. Différents mécanismes peuvent ainsi être influencés par le tabagisme dans les deux maladies.

Il a été suggéré, dans la maladie de Crohn que des changements dans la micro-vascularisation induisent des lésions ischémiques, le tabagisme aurait un effet négatif sur ce processus ; des changements comparables dans la circulation micro-vasculaire n'ont pas été décrits dans la RCH. Le tabac semble exercer un rôle sur la motilité intestinale ou sur le mucus au cours de la RCH, mais ce ne sont que quelques-unes des différentes possibilités (Thomas et al., 2000).

En ce qui concerne l'appendicectomie, elle a aussi des effets divergents sur la MC et la RCH. L'appendicectomie précoce (avant l'âge de 20 ans) est associée à une réduction du risque de la RCH ; Toutefois, elle ne modifie pas le risque de MC et peut même être associée à une augmentation initiale du risque.

Des études ont démontrés une association variable entre les principaux facteurs de stress, l'anxiété ou la dépression et le risque de développer les MICI (Ananthakrishnan ; 2015).

L'hypothèse la plus répandue suggère que des réponses immunitaires excessives à l'encontre d'un sous-ensemble de bactéries entériques commensales, se développent chez des hôtes génétiquement susceptibles, les facteurs environnementaux influencent l'apparition ou la réactivation de la maladie (Sartor, 2006).

Les macrophages et les cellules dendritiques dans la lamina propria augmentent en nombre et ont un phénotype activé dans les deux formes des MICI. La production de cytokines pro-inflammatoires et de chémokines, telles que : l'IL-1f3, TNF-á, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IL-23, IL-27 est augmentée dans les MICI (Sartor, 2006).

Les cellules épithéliales intestinales expriment normalement de faibles niveaux de TLR, ce qui leur permet de résider dans l'iléon distal et le côlon malgré la concentration bactérienne élevée. De plus, les TLRs sont exprimés sur la surface de diverses cellules de la réponse immunitaire innée. Bien que chaque type de TLR lie un motif bactérien spécifique, ces signaux convergent par l'intermédiaire du MyD88, à l'activation de plusieurs voies dont celle du NF-?B. L'activation du NF-?B stimule l'expression de nombreuses molécules contribuant à la pathogenèse des MICI. Celles-ci comprennent des molécules impliquées dans la réponse inflammatoire, telles que : les cytokines (l'IL-1f3, TNF-á, IL-6), les chémokines, les molécules d'adhésion (ICAM-1), ainsi que les molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86).

Chapitre I : Généralités

L'expression de chacun de ces médiateurs pro-inflammatoires est augmentée en phase active des MICI (Sartor, 2006).

Contrairement à la réponse immunitaire innée, qui est activée de façon similaire dans les deux formes des MICI, les profils de cellules T sont disparates dans la MC et la RCH. En effet, un profil cytokinique Th1 caractérisé par la production de l'IFN-ã et de l'IL-12 a été associé à la MC (Neurath, 2014).

Une étude récente de notre équipe a démontré que l'axe IL-12/IFN-ã est déterminant dans l'induction de la NOS2 chez des patients atteints de MC en phase active (Rafa et al., 2010).

À l'inverse, la prédominance d'un profil Th2 a été rapportée au cours de la RCH caractérisé par la sécrétion de l'IL-5, l'IL-4 et l'IL-13 (Neurath, 2014). Il a été démontré dans un modèle de colite Th2 induite par l'oxazolone que l'IL-13 produite en forte quantité par des cellules NKT atypiques serait impliquée dans l'altération de la barrière intestinale et ce, via l'induction de l'apoptose des cellules épithéliales et l'altération des protéines de jonctions (Baumgart & Carding ; 2007).

De plus, une forte expression de l'IL-23 a été également rapportée chez les patients atteints de MICI. L'axe IL-23/IL-17 joue un rôle particulièrement important dans le développement de l'inflammation intestinale. L'IL-23 est une cytokine pro-inflammatoire qui joue un rôle important dans le maintien et l'amplification de la réponse Th17 et l'inhibition de la réponse Treg (Sarra et al., 2010 ; Powrie, 2012). Une forte expression des cytokines IL-6, IL-1? a été observée au niveau de la muqueuse colique de patients atteints de MICI (Neuman, 2007). Ces cytokines favorisent la différenciation des lymphocytes T naïfs vers un profil Th17.

Dans la lamina propria, les cellules Treg jouent un rôle majeur dans le maintien de l'homéostasie intestinale et suppriment les réponses immunitaires aux microbes commensaux résidents et ce, à travers la production des cytokines immuno-régulatrices telles que: l'IL-10, le TGF-â et l'IL-35. Les Treg pourraient avoir un rôle critique dans la modulation du spectre clinique de la maladie. Ces cellules seraient réduites en nombre ou absentes dans la lamina propria des patients atteints de MICI conduisant à une régulation insuffisante de la réponse immunitaire (MacDonald et al., 2011). En plus des cellules T, il a été démontré que les cellules Breg ont également un rôle régulateur de l'inflammation intestinale. Contrairement aux cellules Treg, ces cellules ne sont vus que dans les états l'inflammatoires et suppriment la progression plutôt que l'initiation de la colite murine (Xavier & Podolsky ; 2007).

Chapitre I : Généralités

Le monoxyde d'azote (NO) est un radical libre avec une réactivité modérée en comparaison avec d'autres espèces, ce qui donne lieu à une multitude de fonctions de régulation spécifiques d'organe. Cette molécule fortement diffusible est synthétisé à partir de la L-arginine par la NO synthase (NOS). Trois isoformes ont été identifiés : deux sont constitutivement présentes, la nNOS neuronale et la eNOS endothéliale. La troisième isoforme appelé NOS inductible (NOS2) est exprimée après stimulation par le lipopolysaccharide (LPS) et / ou des cytokines pro-inflammatoires IFN-X, le TNF-á, l'IL-1, et l'IL 6 (Touil-Boukoffa et al., 1998).

Le NO est produit tout au long du tractus gastro-intestinal. Il est jugé important dans les deux événements physiologiques et physio-pathologiques en fonction de la quantité de NO produit. La Production et la sécrétion de haute concentration de NO par les cellules infiltrantes peut conduire à la perpétuation de la lésion tissulaire locale. Certaines données indiquent que les cytokines pro-inflammatoires induisent l'expression de la NOS2 et sont activation dans les cellules épithéliales du côlon.

Il a été rapporté que le NO excédentaire produit par la NOS2 peut aggraver les caractéristiques clinico-pathologiques des MICI et des colites expérimentales par cytotoxicité directe, par l'activation des neutrophiles, la vasodilatation, une diminution du tonus des muscles lisses, une augmentation de la production de nitrosamines, et l'interaction avec l'anion superoxyde pour former le peroxynitrite. Ce dernier est considéré comme un oxydant puissant qui réagit avec les protéines, les lipides et est un puissant initiateur de dommages à l'ADN. Le peroxynitrite est un stimulus obligatoire pour l'activation de l'enzyme nucléaire poly-ADP ribosyle synthetase (PARS), ce qui peut conduire à une augmentation de la perméabilité des cellules épithéliales. La voie peroxynitrite-PARS peut contribuer à des lésions cellulaires dans un certain nombre de situations physiopathologiques et a été impliquée dans la survenue de l'inflammation intestinale et ce, en induisant l'apoptose des cellules épithéliales (Kolios et al., 2004).

Chapitre I : Généralités

7.1 : Traitements conventionnels :

Jusqu'à récemment, les techniques médicales de traitement des MICI étaient relativement limitées comprenant essentiellement les composants de l'acide 5-Aminosalicyllique (5-ASA), Corticostéroïdes et l'azathioprine 6-mercaptopurine. A ces dernières, viennent s'ajouter le Méthotrexate, des inhibiteurs de Calcineurine tels que la cyclosporine, les thiopurines, et l'infliximab (Remicade ; Centocor) un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre le tumor-necrosis factor-á (TNF-á) (Bernstein, 2015 ; Kozernik & Podolsky ; 2006).

Bien-que nombre de patients répondent et maintiennent un état de rémission grâce à ces thérapies conventionnelles, elles restent néanmoins inadaptée pour une certaine catégorie de patients atteints de MICI, de ce fait, de nombreuses nouvelles approches thérapeutiques ciblant des molécules précises au niveau des différentes voies de signalisation impliquées dans le processus physiopathologique des MICI (Kozernik & Podolsky ; 2006).

8.2 : Traitements biologiques (biothérapies) :

De nombreuses thérapies biologiques ont été développées et ont pour but de bloquer une variété de cytokines impliquées dans l'activation des cellules T ainsi que de nouvelles approches qui interviennent dans d'autres étapes du processus physiopathologique (Tableau II) (Kozernik & Podolsky ; 2006). Les différentes approches sont résumées dans le tableau II.

Chapitre I : Généralités

Tableau II : Nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des MICI.

Approches thérapeutiques	Agents	Cible	Classe thérapeutique	Maladie	Phase
Différenciation des cellules T	ABT-974	IL-12	mAb	MC	III
	Atlizumab/ MRA	IL-6	Récepteur mAb	MC	I/II
	Daclizumab/ basiliximab	CD25	mAb	RCH	II
	Visilizumab	CD3	mAb	RCH	I/II
Cytokines pro- inflammatoires/ voix de signalisation	Certolizumab (CDP-870)	TNFá	Fragment PEG-Ab	MC	III
	Adalizumab	TNFá	Petite molécule	MC	III
	Fontolizumab	IFNã	Peptide	MC	II
Molécules d'adhésions sélectives	Alicaforsen	ICAM1	Anti-sens	RCH	II
	Natalizumab	á4	mAb	MC	III
	MLN02	á4â7	mAb	RCH	III
Réparation intestinale	EGF	Inconnue	Peptide	RCH	III
Réparation intestinale	Hormone de croissance	Inconnue	Peptide	MC	II
Autres	Ovule de Trichuris suis	Inconnue	Helminthe	MC/RCH	I et II
	Probiotiques/ prébiotiques	Equilibre de la flore intestinale	N/A	MC/RCH	II/III
	Greffe autologue de moelle osseuse	Lymphocytes T	N/A	MC	I

Légendes du Tableau II : Ab, Anticorps ; MC, Maladie de Crohn ; EGF, epidermal growth factor ; ICAM ; intercellular adhesion molecule; IL, interleukin; IFN, interferon; mAb, anticorps monoclonal; N/A, Pas disponible ; PEG, polyethylene glycol ; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor; TNF, tumour-necrosis factor; RCH, rectocolite hémorragique, Phase : Phase des essais clinique en cours.

Chapitre I : Généralités

III. Les modèles expérimentaux des MICI :

Il existe à l'heure actuelle plusieurs modèles animaux des MICI. Bien qu'aucun des modèles animaux actuels ne reproduise les MICI humaines entièrement, des modèles animaux d'inflammation intestinale ont fourni des indications utiles sur la pathogenèse de la réponse inflammatoire intestinale. Les modèles animaux des MICI sont soit des modèles qui se développent spontanément ou qui sont induits. Pour les modèles animaux qui se développent spontanément, il existe deux souches de souris, les C3H/HeJBir et les SAMP1/Yit. En ce qui concerne les modèles induits, ils incluent les animaux qui ont été traités avec des agents qui favorisent l'inflammation intestinale comme par exemple le Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) ou le Dextran sulfate sodium (DSS) (Wirtz & Neurath ; 2007).

Les rongeurs qui ont été génétiquement manipulées par un ciblage génique ou par transgénèse, ceux-ci incluent les souris chez les quelles on a altéré une fonction cytokinique comme les souris IL-10 knockout, les souris IL-2 knockout, les souris TNF-á et les souris STAT-4 transgéniques. D'autre part, ils existent des rongeurs chez lesquels on a induit une altération des fonctions des cellules T, par exemple les souris knockout pour le récepteur á ou â des LT et des rats transgéniques pour le HLA-B27 (Wirtz & Neurath ; 2007).

Enfin, des animaux immuno-déficients chez lesquelles des populations de cellules qui interviennent dans l'inflammation intestinale ont été transférés, nous citerons le transfert adoptif de Cellules T CD4+ exprimant des niveaux élevés de CD45RB (CD45RB^hi) dans des souris SCID ou Rag -/- qui sont déficientes en lymphocytes B et T, ce qui a pour résultat une inflammation intestinale accompagnée de diarrhée et de perte de poids (Hendrickson et al., 2002).

1. Modèle de colite chimio-induite par le DSS :

Le Dextran est un polymère de glucose complexe avec un haut poids moléculaire il est synthétisé par certaines bactéries à partir du glucose, comme Leuconostoc spp et Streptococcus spp. Le Dextran sulfate sodium (DSS) est un dérivé polyanionique du Dextran, produit par une estérification avec l'acide chlorosulphonique. C'est donc un polysaccharide héparine-like contenant plus de 3 groupements sulfate par molécule de glucose.

Le modèle de colite induite par le Dextran Sulfate Sodium (DSS) a été largement validé. Le modèle de colite expérimentale reproduit les caractéristiques clinique et anatomopathologique des MICI notamment la RCH selon sa concentration et sa durée.

La colite est généralement induite par addition de DSS à l'eau de boisson. Selon la concentration, la durée et la fréquence d'administration de DSS, les animaux peuvent développer une colite aiguë ou chronique. La colite survient chez des souris BALB/c après l'administration du DSS dissout dans l'eau de boisson pendant 7 jours. Cette durée est considérée comme un cycle (Okayasu et al., 1990). L'alternance de trois cycles de DSS séparés par un intervalle d'une semaine sans DSS provoque une colite chronique. La colite aiguë est induite quant à elle en utilisant des concentrations relativement élevées de DSS (entre 3 et 10%) administrés en continu pendant de courtes périodes, généralement de 4 à 14 jours.

Chapitre I : Généralités

Durant la semaine d'administration, la sévérité de la colite est évalué en utilisant le Disease Activity Index (DAI), qui se base sur l'observation de plusieurs manifestations comme la perte de poids, la consistance des selles (selles molles, diarrhées liquides) Présence de sang (au niveau de l'anus, dans les selles) (Cooper et al., 1993).

L'inflammation est généralement limitée au côlon; les caractéristiques macroscopiques comprennent un raccourcissement du côlon qui devient oedémateux avec des zones d'hémorragies et d'ulcérations. Histologiquement, l'inflammation est superficielle, affectant principalement la muqueuse, mais peut s'étendre à la sous-muqueuse et à la musculeuse-muqueuse. Elle est caractérisée par des ulcères superficiels, un oedème muqueux, la perte des cellules caliciformes, une distorsion des cryptes et des abcès cryptiques ; il y a une infiltration de cellules inflammatoires dans la muqueuse et la sous-muqueuse, ces cellules inflammatoires comprennent des neutrophiles, macrophages, cellules plasmatiques et quelques lymphocytes.

Bien que l'inflammation dans la colite aiguë induite par le DSS est continue, sa gravité varie, affectant plus le côlon ascendant et le caecum chez le cochon de Guinée et le hamster, tandis qu'elle est plus sévère dans le côlon descendant chez les souris BALB / c.

Le mécanisme exact à travers lequel le DSS pourrait induire une colite est inconnu. Il existe plusieurs hypothèses, la plus plausible serait l'augmentation de la perméabilité de l'intestin causée par la réduction des protéines de jonction tel que zona occludens-1 directement par le DSS.

Il a été démontré que les groupements sulfate avait un rôle potentiel dans l'induction de la colite par le DSS. En effet, les dérivés soufré serait capable de provoquer une inflammation colique après transformation du H2S en HS^- (Roediger et al., 1996).

Par ailleurs, des bactéries sulfato-réductrices ont été mises en évidence au niveau de la muqueuse colique. Ces bactéries exercent un effet délétère sur la muqueuse en transformant les groupements sulfates en sulfides d'hydrogène très toxiques pour les colonocytes. La présence de ces bactéries est par ailleurs requise pour l'apparition de la colite expérimentale après traitements des animaux avec du DSS (Solomon et al., 2010).

Chapitre I : Généralités

IV. Helminthes et maladies inflammatoires chroniques intestinales :

Les mécanismes d'évasion immunitaire des parasites dépendent eux-mêmes d'une forme de dialogue moléculaire entre l'agent pathogène et l'hôte et, à leur tour, de nombreux parasites dépendent de signaux moléculaires de l'hôte pour leur développement.

2.1 Interaction hôte-Echinoccocus granulosus :

L'hydatidose, est une helminthiase chronique endémique causée par une infection par le stade larvaire du Cestode Echinococcus granulosus. C'est l'une des maladies zoonotiques les plus répandues chez l'homme dans le monde (Siracusano et al., 2012).

L'hydatidose est répandue dans les pays des zones tempérées, y compris l'Amérique du Sud, l'ensemble de la région méditerranéenne, plus spécialement l'Afrique du nord, mais aussi la Russie, l'Asie centrale, la Chine et l'Australie (Siracusano et al., 2012).

Chapitre I : Généralités

Au cours de l'hydatidose, les antigènes d'Echinoccocus granulosus modulent la polarisation des lymphocytes T vers la voie Th2. Ceci est confirmé par les niveaux d'IgG4, d'IgE et l'éosinophilie, retrouvée au cours de cette infection (Shambesh et al., 1997).

Les données immunologiques montrant une forte production in vitro d'IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 et IFN-ã par les patients atteints d'hydatidose, ont confirmé que la réponse immunitaire humaine à l'infection par E. granulosus est principalement régulée par l'activation des cellules Th2, mais aussi par les cellules Th1 (Siracusano et al., 2012). Des résultats récents suggèrent que l'IL-4 et l'IL-10 entravent la réponse Th1 protectrice de l'hôte contre le parasite et permettent à ce dernier de survivre chez les patients hydatiques (Amri et al., 2009).

Par ailleurs, Il a été démontré que la ML exerce d'une part, un effet anti-inflammatoire et immuno-régulateur qui se traduit par la diminution de l'expression de la NOS2, des cytokines pro-inflammatoires majeures (axe IL-1??IL-17A) et d'autre part, par l'augmentation de la cytokine immuno-régulatrice : IL-10 au cours d'un modèle de colite expérimentale induite par le DSS (Soufli et al., 2015).

2.1.1 La membrane lamellaire (ML) et l'immunité de l'hôte :

Une fois que le kyste hydatique est complètement formé, la deuxième phase de l'infection par E.granulosus à lieu. Elle se caractérise par une réponse de type Th2, en corrélation avec la sensibilité à la maladie, impliquant l'élévation de l'IL-4, IL-5, et de l'IL-10 et une diminution de l'IFN_? et du TNF-á. Cela suggère que la membrane lamellaire joue un rôle important dans l'orientation de la réponse immunitaire de l'hôte (Diaz et al ., 2011).

Le parasite élabore deux mécanismes d'échappement, le premier passif par l'enkystement et le deuxième actif par l'immuno-modulation de la réponse immunitaire de l'hôte, la ML est la seule structure du parasite qui soit en contact avec les cellules de l'hôte, et semble être l'un des facteurs clés de la stratégie de survie du parasite par la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte (Diaz et al ., 2011).

Des travaux antérieurs ont montré que la ML d'Echinococcus granulosus augmente la production de l'IL-4, IL-10 et TGF-â par les leucocytes de l'hôte infecté. Cela améliore la survie du parasite par l'inhibition des réponses effectrices notamment la Th1 protectrice de l'hôte. La ML d'E. granulosus n'active le complément que très peu, contrairement au liquide hydatique du kyste et aux protoscolexes. C'est en grande partie la conséquence de l'activité du facteur H de l'hôte, inhibiteur du complément, qui est présent dans les fluides extracellulaires, et se concentre dans la ML (Diaz et al., 2011). De plus, il a été rapporté que la ML d'Echinoccocus granulosus induirait la production de l'IL-10 et des cytokines de la voie Th2 telles que l'IL-4 et l'IL-13 et induirait une activation alternative des macrophages M2 (Amri, 2012).

E. granulosus se développe habituellement en un grand kyste uniloculaire turgescent, qui se développe à travers une augmentation du diamètre. La membrane germinative (MG) se trouve vers l'extérieur de la membrane plasmique apicale (de son tégument syncytial) qui porte des

Chapitre I : Généralités

microtriches. La MG est séparée des cellules de l'hôte et / ou de sa matrice extracellulaire par la membrane lamellaire (ML).

La membrane lamellaire est considérée comme l'élément crucial de la relation hôte-parasite, c'est une gaine acellulaire, riche en glucides, sécrétée par la MG. La ML atteint jusqu'à environ 3 mm chez E. granulosus. La ML est liée au glycocalyx cellulaire. Toutefois, seule la couche la plus interne de cette structure massive est susceptible d'être ancré de manière covalente à la membrane tégumentaire de la MG. Ainsi, la ML est décrite à juste titre comme une matrice extracellulaire spécialisée, trouvé seulement dans le genre Echinococcus, évolutivement conçu pour préserver l'intégrité physique des métacestodes et pour protéger les cellules de la MG de l'immunité de l'hôte (Diaz et al., 2011).

Figure 6 : Les réponses immunitaires de l'hôte dirigées contre la membrane lamellaire du kyste hydatique (Diaz et al., 2011).

3.1 Structure de la membrane lamellaire hydatique :

3.1.1 Ultrastructure :

La ML est une structure macroscopique cohérente et élastique, un maillage tridimensionnel de fibrilles hydrophiles hautement hydratés. Sous le microscope électronique à transmission, ces fibrilles sont irrégulièrement disposées et d'environ 10 nm de diamètre. La ML d'E. granulosus se compose, en plus du maillage fibrillaire, de granules naturellement denses aux électrons, se disposant individuellement ou en amas. La ML doit son nom aux lamelles concentriques qu'on observe sous le microscope optique (Diaz et al., 2011).

Chapitre I : Généralités

3.1.2 Structure moléculaire :

Les hydrates de carbone abondants qui caractérisent la ML se trouvent dans le maillage fibrillaire. Ce dernier est formé par un type majeur de glycoprotéines fortement glycosylées, les mucines, portant essentiellement que des O-glycanes. La composition en monosaccharides de la ML, est formée seulement de galactose (Gal), N-acétylgalactosamine (GalNAc) et N-acétylglucosamine (GlcNAc).

Par ailleurs, il a été démontré que la paroi du kyste d'E. granulosus contenait de grandes quantités de myo-inositol hexakiphosphate (InsP6).

4. Effet immunomodulateur des helminthes chez l'homme et l'animal : 4.1 Données chez l'homme :

Deux rapports rapportant l'utilisation des helminthes pour le traitement des MICI chez l'homme, Suggèrent que l'exposition aux helminthes a un effet bénéfique sur la MC et la RCH. Dans ces études, les patients RCH et MC ont été traités directement avec les oeufs de Trichuris suis (TSO), résultant en une amélioration clinique significative chez près de 80% des patients MC et des effets plus modestes chez les patients RCH (Summers et al., 2005).

4.2 Données chez l'animal :

Une variété de modèles animaux de colite ont été développés. Ces modèles reproduisent un grand nombre des particularités et caractéristiques des MICI humaines.

Même si aucun des modèles ne représente complètement les MICI chez l'homme, ils ont néanmoins été extrêmement utiles dans la compréhension de leur pathogenèse. La première publication sur la modulation par les helminthes d'une colite murine a montré que les aspects de la colite expérimentale induite par le DSS étaient améliorés chez les animaux infectés par le ténia Hymenolepis diminuta (Reardon et al., 2001).

Plus récemment, une étude menée au sein de notre équipe a mis en évidence l'effet protecteur de la membrane lamellaire d'Echinoccocus granulosus au cours d'un modèle de colite induite par le DSS (Soufli et al., 2015).

D'autres travaux sur un modèle de colite induite par le dinitrobenzène acide sulfonique (DNBS) ont montré que l'infection de souris par le nématode parasite, Trichinella spiralis, avait un effet protecteur. De plus, une étude a utilisé les protéines solubles de S. mansoni au cours d'un modèle de colite induite par le TNBS (Hunter & McKay ; 2004).

En outre, plusieurs études ont rapporté l'utilisation des helminthes et de leurs dérivés pour le traitement au cours de modèles expérimentaux d'autres maladies de nature inflammatoire, tel que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque et le diabète de type 1 (Bashi et al., 2015).

Chapitre II : Matériel & Méthodes

I. Matériel:

1. Matériel biologique : 1.1 Animaux :

Notre étude a été réalisée sur des souris BALB/c femelles fournies par l'institut pasteur de Kouba ; Alger. Les souris ont ensuite été placées au niveau de l'animalerie de la faculté des sciences biologiques, ayant accès libre au pain comme unique aliment et à l'eau courante (ad libitum) sous des conditions climatique stable avec un cycle de lumière de 12h. Les souris BALB/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 24g, ont été réparties en 3 lots de 4 souris.

1.2 Echantillons sanguins :

Le sang a été prélevé dans des tubes citrate chez des patients consentant atteints de MICI. Ses derniers ont été fournis par: CHU Mustapha bacha, EPH de Ain taya et EPH de Rouiba. Les prélèvements vont servir à l'isolement des cellules mononuclées du sang périphérique (Tableau IV).

1.3 La membrane lamellaire hydatique :

La membrane lamellaire a été récupérée à partir de kystes hydatiques pulmonaires humains (n=2) prélevés sur des patients atteints d'hydatidose au niveau du service de chirurgie thoracique, CHU Mustapha bacha Alger.

Chapitre II : Matériel & Méthodes

1.4 Les cytokines :

La cytokine recombinante humaine IL-4(Cell signaling) a été utilisée pour l'induction des cultures de PBMC.

2. Matériel non biologique :

- Dextran sulfate sodium (DSS) (Consultancy AB, Sweden), est un polymère de polysaccharide sulfatés, de poids moléculaire varient entre 36 000 Da - 50 000Da.

? Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma) enrichi par l'addition de 10% de SVF, 1% d'antibiotique er de L-Glutamine à 1mg/ml préalablement décomplémenté à +56°C, pendant 30min.

? RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium/Sigma Aldrich) enrichi avec 5% de sérum de veau foetal (SVF) préalablement « décomplémenté » à +56°C, pendant 30 min.

II. Méthodes :

L'extrait brut de la membrane lamellaire hydatique est préparé selon le protocole décrit par (Amri et al., 2012). Le liquide hydatique est aspiré à l'aide d'une seringue, la membrane du kyste est ensuite lavée plusieurs fois au PBS stérile contenant 300UI de pénicilline et 0.3 mg/ml de streptomycine et congelée pendant une nuit.

La membrane lamellaire est ensuite séparée de la membrane germinative dans un environnement stérile ; elle est lavée plusieurs fois avec un tampon PBS stérile (pH : 7.4) contenant 4% d'antibiotiques. Elle subit par la suite plusieurs cycles de sonication de 10s pendant 10min dans du tampon PBS contenant un cocktail d'anti-protéases jusqu'à l'obtention d'une solution homogène. Par la suite cette solution est laissé à décanter à 4°C, le surnageant qui en résulte représente l'extrait brut de la membrane lamellaire, il est ensuite récupéré et conservé à -20°C et servira à l'induction des cultures des PBMC.

Chapitre II : Matériel & Méthodes

Pour son utilisation in vivo dans un modèle de colite induite par le DSS, l'extrait soluble de la ML est préparé après broyage mécanique dans un tampon PBS stérile (pH : 7.4) contenant des anti-protéases.

Afin d'éliminer toute contamination pouvant interférer avec l'effet de la ML nous avons procédé à la décontamination des extraits brut et soluble par un kit d'élimination d'endotoxines, Endotoxin Removal kit (Life technologies). Cela a été réalisé selon les instructions du fabricant.

2. Induction d'une colite aigue par le Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez des souris BALB/c :

La colite expérimentale est induite après administration de 3% de DSS ad libitum dans l'eau de boisson à des souris BALB/c pendant 5 jours. Les souris ont été randomisé en 3 groupes de 4souris chacun (Figure 7).

La solution de DSS à 3% est préparée fraichement chaque jour, les souris sont pesées chaque jour et les paramètres cliniques de la colite le poids, saignements rectaux, consistance des selles ont été contrôlés quotidiennement chez toutes les souris, durant la période expérimentale afin d'évaluer la sévérité de l'inflammation tout au long de l'expérimentation. Chacun de ces paramètres est évalué sur une échelle de 0 à 4 afin de calculer le «Disease Activity Index» (DAI), le DAI est établis tous les jours comme suit (Cooper et al, 1993) :

Paramètres Scores	selles	sang	Perte de poids
0	normales	Pas de sang	Pas de perte de poids
1	Normales/molles	Pas de sang	1 à 3% de perte de poids
2	molles	Visible dans les selles	3 à 6% de perte de poids
3	Diarrhée liquide	selles et intérieur de l'anus	6 à 9% de perte de poids
4	Liquide et queue marron	Sang au niveau de l'anus et la queue	> 9% de perte de poids

Chapitre II : Matériel & Méthodes

Pour récupérer les macrophages péritonéaux il est nécessaire d'effectuer un lavage péritonéal, pour ce faire un volume de 5ml de PBS stérile est injecté dans la cavité péritonéale de la souris. Celle-ci est secouée quelque secondes afin de récupérer un maximum de cellules. Le liquide péritonéal prélevé est ensuite centrifugé a 2800 rpm pendant 10min. le culot obtenu est remis en suspension dans un volume déterminé de DMEM après deux lavages avec du PBS stérile.

4.2 Test de viabilité :

Un test de viabilité et un comptage des macrophages sont d'abord effectués sur une cellule Malassez. La viabilité cellulaire est évaluée en utilisant un colorant vital (Bleu de trypan) ce dernier nous permettra de différencier entre les cellules vivantes qui apparaissent réfringentes des cellules mortes de couleur bleu.

La densité cellulaire (4.10⁵ cellules/ml) est déterminée par la formule suivante :

M : moyenne des macrophages vivants observés dans 3 champs de la lame de Malassez.

4.3 Culture des macrophages péritonéaux :

Les macrophages ont été mis en culture à raison de 4*10⁵ cellules/puits. Chaque puits est réalisé en duplicate. Les cellules sont d'abord mises à adhérer sur microplaque à fond plat pendant 1h30 à 37°C sous atmosphère humide en présence de 5% de CO2. Ensuite trois lavages au PBS stérile sont effectués afin d'éliminer les cellules non adhérentes. Puis elles sont à nouveau mises en culture dans les mêmes conditions pendant 20h à 37°C.

Après 20h d'incubation les surnageant de culture sont récupérés et centrifugés pendant 5min a 4000 rpm, ils sont ensuite conservés à -20°C pour le dosage ultérieur du NO.

Chapitre II : Matériel & Méthodes

L'évaluation des taux de monoxydes d'azote a été réalisée par le dosage de ses métabolites physiologiquement stables, les nitrites résiduels (NO2^-). Le dosage du NO a été réalisé au niveau des plasma et des surnageants de culture cellulaire, par la méthode de Griess modifiée.

5.1 Principe :

C'est une technique colorimétrique qui permet la quantification des nitrites (métabolites stables du NO). Ce dosage est réalisé au spectrophotomètre à une longueur d'onde de ë=543nm.

5.2 Mode opératoire :

Une courbe étalon des nitrites s'étalant de 0 à 128uM est réalisée antérieurement à partir d'une solution mère de NaNO2. L'échantillon à doser est mélangé à 25ìl de Griess B, 25 ul de Griess A et 400 ul d'eau distillée respectivement. La solution obtenue est alors incubée pendant 15min à l'obscurité puis centrifugée à 10000rpm pendant 5 minutes. Une lecture de la DO est réalisée au spectrophotomètre à une longueur d'onde de ë=543nm.

Figure 8: courbe étalon de dosage du NO selon la méthode de Griess modifiée.

Les échantillons de plasma et de surnageant de culture ont été préparés selon la méthode de Griess modifiée. Puis la lecture des DO a été réalisée a une longueur d'onde de ë=543nm. Les concentrations des nitrites résiduels sont déterminées après extrapolation de la valeur de D0 sur la courbe étalon DO=É [NaNO2] préalablement établie (Touil-Boukoffa et al.,1998).

Chapitre II : Matériel & Méthodes

? La déshydratation : la déshydratation du colon se fait sous agitation par un passage du tissu dans des bains d'éthanol à des concentrations croissantes.

Deux bains d'alcool 70° de 5 à 10 min chacun Deux bains d'alcool 90° de 5 à 10 min chacun Trois bains d'alcool 100° de 5 à 10 min chacun

? L'éclaircissement: les fragments sont ensuite plongés dans trois bains de toluène pendant 10min chacun.

? L'inclusion dans la paraffine: Les fragments tissulaires sont plongés dans deux bains de paraffine de 2h puis 24h dans une étuve thermostatée à 60°c, ensuite des blocs sont confectionnés grâce à des cassettes et seront ultérieurement coupés au microtome.

? La réalisation des coupes: les blocs de paraffine sont coupés à l'aide d'un microtome pour réaliser des coupes histologique d'une épaisseur de 4um, les rubans obtenus sont placés au fur et à mesure dans un bain marie à 37°C et étalés ainsi sur des lames recouvertes d'eau gélatinée à 0.4%. les lames sont ensuite placées dans une étuve thermostatée à 37°c pendant 24h afin de les sécher.

Cette étape vient avant l'étape de la coloration des coupes. Pour cela les lames sont placées pendant quelques secondes sur une plaque chauffante puis plongées dans un bain de toluène pendant 3 à 5 min. Lorsque la paraffine est fondue, les coupes sont réhydratées en les plongeant dans des bains d'alcool décroissants :

Un bain d'alcool de 100° pendant 2 à 3 min. Un bain d'alcool de 90° pendant 2 à 3 min. Un bain d'alcool de 70° pendant 2 à 3 min. Puis on réalise un bain final d'eau distillée.

Chapitre II : Matériel & Méthodes

L'étape de la coloration est primordiale à fin de réaliser notre étude histologique, une coloration à base d'hématoxyline et d'éosine qui nous permettra d'observer les différentes couches du côlon distal a été utilisée. Pour cela les lames sont plongées dans de l'hématoxyline pendant 2 minutes puis lavées à l'eau de robinet. Elles sont ensuite plongées dans de l'éosine pendant quelques secondes puis rincées à l'eau distillée pendant 1 minute.

Enfin, les coupes sont déshydratées par passage dans des bains d'alcool croissants (70°, 90°, 100°) pendant quelques minutes, suivis de deux bains de xylène.

La dernière étape consiste à recouvrir les lames par des lamelles en verre et pour cela une goutte de résine de montage Eukitt® est déposée sur la lamelle imprégnée de xylène, celle-ci est fixée sur la lame délicatement en évitant la formation de bulles d'air.

8. Isolement et culture des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) des patients atteints des MICI : Etude de l'effet immunomodulateur de la ML

Dans le second volet de notre étude nous avons voulu exploré l'effet de la ML sur la production ex vivo du NO. A cet effet, Les PBMC sont préparées à partir du sang total par gradient de densité de Ficoll «Histopaque» (1.077 mg/ml, Sigma Aldrich). Les cellules sont ensuite récupérées et re-suspendues dans du PBS stérile. Trois lavages sont effectués avant de procéder au test de viabilité. Ce dernier réalisé, les cellules sont mises en culture à raison de 10⁶ cellules/ml dans le milieu de culture RPMI-1640 en présence et en absence de concentrations croissantes d'extrait brut de la ML (10, 25, 50 et 60ug/ml) et ou de la cytokine recombinante IL-4 (1ng, 10ng et 100ng).

8.1 Culture des PBMC humaines :

Les PBMC sont mises en culture dans une microplaque de 96 puits à raison de 10⁶cellules/puits et cela en rajoutant le volume nécessaire de RPMI-1640 contenant 30 mM de L-glutamine et enrichi par 5% de sérum de veau foetal, 100UI de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine, en présence et en absence de concentrations croissantes d'extrait brut de ML (10, 25, 50 et 60ug/ml) et ou de cytokine IL-4 (1ng, 10ng et 100ng) pour un volume final de 200ìl. La microplaque est alors incubée pendant 20h dans une étuve humidifiée, réglée à 37°C et 5% de CO2.

Après 20h d'incubation les surnageants de culture sont récupérés et centrifugés pendant 5min à 4000 rpm. Ils sont ensuite conservés à -20°C pour le dosage ultérieur du NO.

Chapitre II : Matériel & Méthodes

RM One way ANOVA et le test non-paramétrique de Friedman ont été utilisés pour mesurer l'effet de la ML sur la modulation de la production du NO ex vivo. Les différences sont considérées comme statistiquement significatives pour p < 0,05 dans l'ensemble des analyses statistiques.

Chapitre III : Résultats

PARTIE I : Etude sur modèle animal :

I. Effet de la membrane lamellaire hydatique au cours de la colite induite par le Dextran sulfate sodium (DSS) :

1. Paramètres Cliniques :

L'administration de 3% (m/v) de DSS pendant 5jours a provoqué chez les souris du groupe DSS une détérioration importante de l'état général. Les premiers signes cliniques sont apparus à partir de J2 : fatigue, perte de poids et diarrhées hémorragiques.

À l'inverse, nous avons remarqué un retardement de l'apparition de ces signes cliniques chez le groupe DSS+ML, seulement 25% des souris ont montré un état de morbidité à partir de J8 pour le groupe DSS+ML alors que toutes les souris appartenant au groupe DSS étaient en état de morbidité avec plus de 20% de perte de poids à la fin de la période expérimentale.

A J7 il y'a eu 25% de mortalité dans le groupe DSS contre 0% dans le groupe DSS+ML, à J9 jour du sacrifice nous avons a retrouvé 50% de souris mortes dans le groupe DSS contre 25% des souris pour le groupe DSS+ML.

Figure 9: Effet de la ML sur les paramètres cliniques de la colite induite par le DSS. A. Variation du poids corporel des souris exprimée en %. B. Disease Activity Index : Perte de poids, consistance et présence de sang dans les selles. C. Taux de survie des souris exprimé en % durant la période expérimentale.

Chapitre III : Résultats

Ainsi, l'administration par voie intra-péritonéale de la ML à but curatif a induit une légère amélioration des signes cliniques se traduisant par une diminution du score clinique, le DAI. De plus, une restauration du poids corporel, a été remarquée dans le groupe DSS+ML en comparaison avec le groupe DSS (Figure 9).

2. Effet de la ML sur les altérations morphologiques et histologiques du côlon induites par le DSS :

Sur le plan morphologique, l'administration du DSS 3% à des souris BALB/c à induit un raccourcissement important du côlon d'environ 55% en comparaison avec les souris non traitées. Le traitement des souris par la ML atténue légèrement le raccourcissement de la longueur du côlon. En effet, nous avons remarqué qu'il y a une amélioration d'environ 10% au niveau de la longueur du côlon du groupe DSS+ML en comparaison avec le groupe DSS (Figure 10).

Figure 10 : Longueur du côlon des souris issues des trois groupes expérimentaux (DSS : Dextran Sulfate Sodium ; ML : Membrane Lamellaire).

L'analyse histologique du côlon qui s'est basée sur des critères bien définis tels que l'organisation structurale de la muqueuse colique, la présence d'abcès cryptique, l'apparition d'oedèmes, la présence d'infiltrat inflammatoire au niveau de la muqueuse colique ainsi qu'une déplétion des cellules caliciformes. L'examen histologique du côlon des souris traitées avec du DSS a montré des lésions intestinales sévères. Un infiltrat intense de cellules inflammatoires, destruction totale des cryptes et des zones oedémateuses ont été observés au niveau de la muqueuse et de la sous muqueuse (Figure 11C, 11D).

Cette analyse chez le groupe DSS+ML a montré la conservation de quelques cryptes dans la muqueuse colique. En outre, nous avons remarqué une diminution légère de l'infiltrat inflammatoire au niveau de la muqueuse colique en comparaison avec le groupe DSS (Figure 11E, 11F). Nous avons suggéré que cette amélioration serait dûe à une diminution du taux de monoxyde d'azote.

Chapitre III : Résultats

Figure 11: Structure histologique du Côlon des souris des groupes : (coloration H&E) Témoin (A, B), DSS (C, D), DSS/ML (E, F). (A, B) x100, x400: Groupe témoin montrant un aspect stratifié normal; muqueuse (M), sous muqueuse (SM), musculeuse (MS). (C, D) x100, x400: Groupe DSS montrant une destruction des cryptes et une déplétion des cellules caliciformes, une érosion de la muqueuse et la présence d'infiltrat cellulaire au niveau de la muqueuse (M) et de la sous muqueuse (SM). (E, F) x100, x400: Groupe DSS/ML montrant une amélioration dans l'organisation architecturale du côlon, une destruction partielle des cryptes une déplétion non totale des cellules caliciformes, on remarque aussi la présence d'un important infiltrat inflammatoire au niveau de la sous muqueuse (SM) et une diminution de l'infiltrat inflammatoire au niveau de la muqueuse (M).

Chapitre III : Résultats

Nous avons ainsi été amenés à explorer l'effet de la ML sur la modulation de la production du NO dans notre modèle d'étude. Le NO étant un médiateur proinflammatoire produit principalement par les macrophages activés à travers la NOS2, il a été associé à l'apparition des dommages tissulaires au cours des MICI (Kolios et al., 2004).

3.1. Effet de la ML sur la production in vivo du monoxyde d'azote (NO) :

Le dosage du NO au niveau du plasma a été réalisé grâce au dosage des nitrites résiduels [NO2^-]. Nous avons remarqué qu'après administration de 3% de DSS à des souris BALB/c, le taux de NO a fortement augmenté en comparaison avec le groupe témoin (11.3#177;3.81uM vs 5.1#177;0.42uM).

Par contre, le groupe DSS+ML a montré une diminution de la production in vivo du NO en comparaison avec les souris du groupe DSS (7.46#177;4.80uM vs 11.3#177;3.81uM) (Figure 12).

Figure 12 : Effet de la ML sur la production in vivo du monoxyde d'azote (NO).

3.2. Effet de la ML sur la production in vitro du monoxyde d'azote (NO) au niveau des surnageants de culture des macrophages péritonéaux :

L'étude de la production de NO au niveau des surnageants de culture des macrophages péritonéaux a révélé une forte augmentation chez le groupe DSS en comparaison avec le groupe Témoin (39.75#177;8.08uM vs 16.80#177;1.21uM). À l'inverse, nous avons observé une forte diminution de la production du NO par les pMØ des souris du groupe DSS+ML en comparaison avec le groupe DSS (22.82#177;2.52uM vs 39.75#177;8.08uM) (Figure 13).

Chapitre III : Résultats

Figure 13: Effet de la ML et/ou du DSS sur la production in vitro des nitrites résiduels par les macrophages péritonéaux.

II. Effet de l'IL-4 sur la production in vitro du monoxyde d'azote (NO) au niveau des surnageants de culture des macrophages péritonéaux :

Le traitement des macrophages péritonéaux des souris du groupe DSS par l'IL-4 a induit une diminution du taux de NO en comparaison avec le groupe DSS (39.75#177;8.08uM vs 25.5#177;6.64uM). Nous avons noté avec intérêt que l'effet de la ML sur la production du NO au niveau des surnageants de culture des pMØ du groupe DSS était comparable à l'effet de l'IL-4 (Figure 14).

Figure 14: Effet de l'Il-4 et/ou du DSS sur la production in vitro des nitrites résiduels par les macrophages péritonéaux des souris du groupe.

Chapitre III : Résultats

PARTIE II : Etude chez des patients atteints de MICI

I. Etude de l'effet de l'extrait brut de la ML sur la production du monoxyde d'azote ex vivo au cours des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin :

Dans la seconde partie de notre étude, nous nous sommes intéressés à l'évaluation de l'effet de l'extrait brut de la membrane lamellaire hydatique sur la production ex vivo du NO par les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) des patients atteints de MICI.

La production du monoxyde d'azote a été déterminée dans les surnageants de culture en présence et en absence de concentrations croissantes de la ML et/ou de la cytokine recombinante exogène : l'IL-4.

1. Patients atteints de la maladie de Crohn :

1.1. Effet de la ML sur la production ex vivo du NO au niveau des cultures des cellules mononuclées du sang périphérique chez les patients traités par des anti-inflammatoires :

Les taux de nitrites dans les surnageants de culture des PBMC ont montré une diminution significative * P<0.05 dans les teneurs en NO après l'addition de concentrations croissantes d'extrait brut de la ML 25, 50 et 60 ug/ml par rapport au témoin négatif (PBMC non traités avec la ML) et ce, quelque soit la concentration en protéines de l'extrait brut de la ML (Figure 15A).

1.2. Effet de la ML sur la production ex vivo du NO au niveau des cultures des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) chez les patients sous immunosuppresseurs :

Les taux de nitrites dans les surnageants de culture des PBMC ont montré une diminution significative (* P<0.05) dans les teneurs en NO après traitement par les concentrations 10 et 50 ug/ml de l'extrait brut de la ML par rapport au témoin négatif de culture (PBMC non traités avec la ML) (Figure 15B).

Figure 15: effet de la ML sur la production ex vivo du NO par les PBMC de patients atteints de la maladie de Crohn. A : patients traités par des anti-inflammatoires. B : patients traités par des immunosuppresseurs. [ML]= 10, 25, 50, 60 ug/ml d'extrait brut de la ML, * : p<0.05.

Chapitre III : Résultats

2. Patients atteints de la rectocolite hémorragique :

2.1 Effet de la ML sur la production ex vivo du NO au niveau des cultures des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC):

La comparaison entre les taux de nitrites dans les surnageants de culture des PBMC de patients atteints de rectocolite hémorragique en phase active et sous corticothérapie a montré une diminution importante dans les teneurs en NO après l'addition de concentrations croissantes d'extrait brut de la ML par rapport au témoin négatif de culture (PBMC non traités avec la ML). Quelque soit la concentration de l'extrait brut utilisée, la diminution du taux du NO n'est pas statistiquement significative, à l'exception de la concentration de 50ug/ml de la ML. Cette dernière a induit une diminution significative de la production du NO par les PBMC en comparaison avec le témoin de culture (Figure 16.A).

2.2 Effet de L'IL-4 sur la production ex vivo du NO au niveau des cultures des cellules mononuclées du sang périphérique :

Afin de confirmer l'effet inhibiteur de la ML sur la production du NO, nous avons voulu comparer son effet avec l'effet de l'IL-4. Pour rappel, l'IL-4 est une cytokine anti-inflammatoire, capable d'inhiber l'expression de la NOS-2 au niveau des monocytes. Le traitement des PBMC de patients atteints de RCH en phase active et sous corticothérapie avec 1 et 10 ng/ml d'IL-4 a induit une diminution significative du taux du NO en comparaison avec le témoin de culture (3.7#177;1.53uM, 4.03#177;2.07uM vs 7.51#177;0.37uM p<0.05 respectivement) (Figure 16.B).

Ainsi, nous avons noté avec intérêt que l'effet de la ML sur la production du NO par les PBMC de patients atteints de RCH en phase active est semblable à celui de l'IL-4.

Figure 16: effet de la ML sur la production ex vivo du NO par les PBMC de patients atteints de la rectocolite hémorragique en phase active et sous corticothérapie. A : Avec ou sans [10, 25, 50, 60 ug/ml] d'extrait brut de la ML. B : Avec ou sans [1, 10, 100 ng/ml] d'IL-4 humaine recombinante. * : p<0.05.

Le modèle de colite induite par le DSS est un modèle établie, son principal intérêt est de comprendre l'impact de la rupture de la barrière intestinale dans la pathogenèse des MICI. Il présente des similarités avec les MICI humaines du point de vue étiologique et physiopathologique (Solomon et al., 2010).

Le DSS par son action cytotoxique sur les cellules épithéliales, induit la rupture de la fonction de la barrière épithéliale (Cooper et al., 1993). Cette destruction mettrait en contact la flore commensale et le système immunitaire muqueux, ce qui est à l'origine de l'activation excessive du système immunitaire muqueux et la perturbation de l'homéostasie intestinale comme il a été décrit au cours des MICI humaines (Nancey et al., 2008; Neuman, 2007).

De ce fait, nous avons utilisé ce modèle afin d'évaluer l'effet curatif de la ML et ce, selon différents paramètres : cliniques, morphologiques et histologiques. Nous avons également évalué l'impact de son effet sur la modulation de la NOS2 au cours de notre modèle d'étude.

Ce modèle est caractérisé sur le plan clinique par une importante perte de poids, en conséquence d'une diminution de la consommation alimentaire, un changement de la consistance des selles allant jusqu'à la diarrhée, accompagné de saignements rectaux. Sur le plan histologique, il a été décrit que l'inflammation induite par le DSS est limitée au côlon distal chez les souris BALB/c. Il induit des lésions sévères au niveau de la muqueuse colique associées à une importante infiltration des cellules inflammatoires (Cooper et al., 1993).

Dans notre étude, l'administration de 3% de DSS dissout dans l'eau de boisson à des souris BALB/c pendant 5 jours, a induit une détérioration de l'état général des souris se traduisant par une augmentation du DAI. En effet, l'apparition des différents signes cliniques nous a permis de suivre l'évolution de l'inflammation. Les premières selles molles sont apparues à J1, les diarrhées hémorragiques sont apparues à partir de J3. À partir de J7 jusqu'à J9 les souris de ce groupe étaient toutes dans un état de morbidité associé à plus de 20% de perte de poids, nous avons également enregistré 50% de mortalité dans ce groupe. Au cours de notre modèle, l'administration du DSS à 3% pendant 5jours a induit un raccourcissement de la longueur du côlon de l'ordre de 55%, ce qui reflète la sévérité de l'inflammation colique.

Nos résultats sont en accord avec les résultats obtenus par les études précédentes (Okayasu et al., 1990 ; Cooper et al., 1993 ; Abdelouhab et al., 2012 ; Soufli et al., 2015). En effet, il est bien établi que les souris présentent des symptômes cliniques de colite à partir de J2 reflétant l'installation du processus inflammatoire et des lésions histologiques. Nous avons donc évalué l'effet de l'extrait soluble de la ML en tant que traitement curatif et ce, à travers son administration par voie intra-péritonéale 3 jours après l'induction de la colite.

L'administration de l'extrait soluble de la ML à but curatif, a induit un retardement de l'apparition des signes cliniques, ce qui a conduit à l'amélioration de l'état générale des souris et la diminution des altérations morphologiques. En effet, nous avons relevé une augmentation de la longueur du côlon chez le groupe DSS+ML en comparaison avec le groupe DSS.

Nos résultats sont en accord avec ceux rapportés par Reardon et al, qui ont démontré que l'infection des souris avec le teania Hymenolepis améliore la colite induite par le DSS. Khan et al ont aussi démontré que l'infection avec Trichinella spiralis, protège les souris de la colite induite par le (DNBS). Plus récemment, une étude menée au sein de notre équipe a mis en évidence l'effet protecteur de la membrane lamellaire d'Echinoccocus granulosus au cours d'un modèle de colite induite par le DSS (Reardon et al., 2001 ; khan et al., 2002 ; Soufli et al., 2015). Il a été démontré que la ML exerce un effet protecteur au cours de la colite induite par le DSS à travers la régulation négative de l'expression de la NOS2 et des cytokines proinflammtoires IFN-ã et TNF-á (Soufli et al., 2015).

L'analyse histologique nous a permis de localiser et d'estimer le degré d'atteinte tissulaire au niveau du côlon distal. Nous avons observé chez les souris du groupe DSS la présence d'importantes altérations au niveau de l'organisation architecturale du côlon qui se traduisent par une destruction de la muqueuse colique, la destruction de l'épithélium, la déplétion des cryptes et des cellules caliciformes ainsi qu'une importante infiltration muqueuse et sous muqueuse. En ce qui concerne le groupe DSS+ML, nous avons remarqué une légère amélioration dans l'organisation structurale de la muqueuse en comparaison avec le groupe DSS. En effet, nous avons observé la présence de quelques cryptes ainsi qu'une diminution de l'infiltration au niveau de la muqueuse.

Dans notre étude, l'analyse histologique a révélé la présence d'un important infiltrat inflammatoire hétérogène. Ces cellules seraient à l'origine de la production des cytokines proinflammatoires et de monoxyde d'azote.

Nous avons mesuré le taux de nitrites résiduels représentatifs des taux de NO au niveau systémique (taux plasmatique) in vivo et in vitro au niveau des surnageants de cultures des macrophages péritonéaux. L'administration du DSS à 3% a induit une forte augmentation de la production du NO in vivo et in vitro en comparaison avec les souris du groupe témoin. À l'inverse, nous avons noté une diminution importante du taux de NO in vivo et in vitro après traitement des souris par l'extrait soluble de la ML en comparaison avec les souris traitées par le DSS seul.

Plusieurs études ont démontré une surexpression de la NOS2 au niveau de la muqueuse intestinale des patients atteints de MICI (Rafa et al., 2013) ainsi qu'au cours des colites expérimentales (Toumi et al., 2014 ; Soufli et al., 2015 ).

L'expression de la NOS2 est induite après activation du facteur de transcription NF-êB et libère de fortes concentrations de monoxyde d'azote. Elle est induite par différents stimuli qui agissent en synergie : l'IFN--y/TNF--a, LPS/IFN- ã, IL-1â/LPS. Le NO est un radical libre impliqué dans l'apparition des lésions tissulaires au cours des MICI (Kimura et al., 1997 ; Pacher et al., 2007 ; Rafa et al., 2010 ; 2013).

Il interagit avec l'anion superoxyde pour donner le péroxynitrite qui est connu pour ses effets délétères sur la muqueuse intestinale (Rachmilewitz et al., 1995 ; Kolios et al., 2004).

Des travaux ont suggéré que l'induction des macrophages de type M2 serait à l'origine de l'atténuation de l'inflammation colique par les helminthes au cours des modèles expérimentaux de MICI (Heylen et al., 2014). De plus, une étude récente de notre équipe a démontré que la ML inhibe l'expression de la NOS2 et augmente l'expression de l'arginase, marqueur des macrophages M2, au niveau des macrophages péritonéaux murins (Amri & Touil-Boukoffa ; 2015 in press).

Les résultats obtenus à travers notre étude, sont en accord avec ces données. En effet, nous avons noté que la ML a induit une diminution importante de la production du NO par les macrophages péritonéaux en comparaison avec le groupe DSS. Cette diminution est comparable à celle observée au niveau des surnageants de culture des pMø issus du groupe DSS et traités par de l'IL-4 exogène, suggérant que la ML aurait un effet similaire à l'IL-4.

Il a été démontré qu'au cours de la phase chronique de l'hydatidose, la ML induirait des cytokines de type Th2 et Treg principalement l'IL-4 et l'IL-10 (Amri et al., 2009). Nos résultats montrent que l'effet de la ML était semblable à celui de l'IL-4 ce qui suggèrent que la ML agirait probablement en induisant la production de l'IL-4 et de l'IL-10.

Nos résultats suggèrent qu'en plus de l'amélioration au niveau histologique et clinique, l'extrait soluble de la ML exerce un rôle immunomodulateur sur la production du NO au cours de notre modèle d'étude.

Cependant, nous avons utilisé un nombre de souris faible dans notre étude ce qui limite nos résultats à des observations. L'augmentation du nombre des souris ainsi que l'utilisation de l'extrait brut de la ML au lieu de l'extrait soluble pourraient démontrer un effet supérieur. En effet, il a été démontré de façon intéressante que l'extrait brut de la ML induit une réduction plus importante de la production de NO en comparaison avec l'extrait soluble au niveau des cultures de macrophages in vitro (Steers et al., 2001). De ce fait, l'utilisation de l'extrait brut pourrait probablement donner un effet supérieur au cours de notre modèle d'étude.

Dans la seconde partie de notre étude, nous nous sommes intéressés à l'évaluation de l'effet ex vivo de l'extrait brut de la ML sur la production du NO chez des patients atteints de la maladie de Crohn et de la rectocolite hémorragique. En ce qui concerne les patients atteints de la MC nous avons été amenés à les classer selon deux catégories, les patients traités par des anti-inflammatoires et les patients traités par des immunosuppresseurs. Nous avons noté un taux de NO réduit au niveau des surnageants de culture des patients traités par immunosuppresseurs et en comparaison avec les patients traités par anti-inflammatoire. En effet, les corticoïdes et les immunosuppresseurs sont connus pour réguler négativement la production du NO et l'induction de la synthèse des cytokines pro-inflammatoires, ce qui explique les taux faibles de NO retrouvés chez ces patients.

Nous avons remarqué que la ML a induit une diminution importante de la production du NO quelque soit la concentration protéique de l'extrait, et ceci chez les deux catégories de patients atteints de la MC. Néanmoins, nous avons remarqué que les concentrations de 25ug/ml,

50ìg/ml et 60ug/ml étaient légèrement plus efficaces chez les patients atteints de la MC sous anti-inflammatoires. Alors que pour les patients sous immunosuppresseurs elle connait une diminution statistiquement significative pour des concentrations de ML de 10ìg/ml et 50ìg/ml. Nous pouvons expliquer ces résultats par le fait que la ML exercerait son effet inhibiteur à travers l'induction de l'expression des cytokines anti-inflammatoires telles que l'IL-4 et l'IL-10 (Amri, 2012). Ces cytokines sont capables d'inhiber l'expression des cytokines pro inflammatoires régulatrices positives de l'expression de la NOS2 (Bogdan & Nathan, 1993).

En ce qui concerne les patients atteints de la RCH en phase active sous corticoïdes, l'évaluation de la production du NO dans les surnageants de culture de leurs PBMC a permis d'observer une diminution non significative de la production du NO après traitement avec différentes concentrations de la ML. A l'exception de la concentration de 50ìg/ml ou nous avons observé une diminution statistiquement significative (p<0.05).

De plus, nous avons noté avec intérêt que l'effet de la ML était comparable à l'effet de l'IL4. En effet, le traitement des PBMC par différentes concentrations de l'IL-4 a induit une diminution non significative du taux de NO à l'exception des concentrations de 1ng/ml et 10ng/ml (p<0.05). Néanmoins, il est impératif de signaler l'effectif réduit de notre échantillonnage pour cette catégorie de patients (n=4), l'augmentation de la taille de notre échantillon nous permettrait probablement de démontrer un effet supérieur.

Nos résultats suggèrent que l'inhibition de l'expression de la NOS2 par la ML passerait probablement par l'effet de l'IL-4. Pour rappel, l'IL-4 est une cytokine anti-inflammatoire produite essentiellement par les lymphocytes Th2, cette cytokines a la capacité d'inhiber la libération des cytokines pro-inflammatoires telles que : l'IL-1â et le TNF-á par les monocytes/macrophages et ainsi inhiber indirectement l'expression de la NOS2 (Bogdan et Nathan, 1993).

Conclusion

Au regard global de notre étude, nous suggérons l'instauration d'un effet curatif exercé par l'extrait soluble de la membrane lamellaire hydatique dans le modèle de colite expérimentale induite par le DSS. En effet, il apparait que la ML exerce un effet immunomodulateur sur l'expression de la NOS2 qui se traduit par la diminution de la production du NO in vivo et in vitro au niveau des surnageants de culture des macrophages péritonéaux. D'autre part nous avons noté un effet bénéfique probable sur la protection de l'intégrité de la muqueuse colique. Nous avons dans cette optique, mis en évidence, le rôle immunomodulateur de cet extrait sur la production du NO ex vivo chez des patients atteints de MICI. En effet, les résultats obtenus à travers notre étude, sont en faveur de l'hypothèse hygiéniste et suggèrent un effet thérapeutique potentiel de la ML dans les MICI.

Figure 17 : Schéma proposé pour illustrer les altérations induites par le DSS et l'effet
protecteur probable de la membrane lamellaire.

Abdelouhab, K., Rafa, H., Toumi, R., Bouaziz, S., Medjeber, O., & Touil-Boukoffa, C. (2012). Mucosal intestinal alteration in experimental colitis correlates with nitric oxide production by peritoneal macrophages: effect of probiotics and prebiotics. Immunopharmacol Immunotoxicol, 34(4), 590-597. doi: 10.3109/08923973.2011.641971

Abreu, M. T. (2010). Toll-like receptor signalling in the intestinal epithelium: how bacterial recognition shapes intestinal function. Nat Rev Immunol, 10(2), 131-144. doi: 10.1038/nri2707

Amri, M., Mezioug, D., & Touil-Boukoffa, C. (2009). Involvement of IL-10 and IL-4 in evasion strategies of Echinococcus granulosus to host immune response. Eur Cytokine Netw, 20(2), 6368. doi: 10.1684/ecn.2009.0154

Amri, M. & Touil-Boukoffa, C., 2011. PS2-092. Down-regulation of Th1/Th17 protective immune responses during human echinococcosis. Cytokine, 56(1), 88-89. Available at: http://dx.doi.org/10.1016/j.cyto.2011.07.256.

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