ANNEXES
ANNEXE I
Caractérisation et isolement des bactéries
solubilisatrices de phosphate.
1- Préparer le milieu PVK liquide contenant 10g de
glucose ; 0.01g d'Ammonium sulfate hydraté; 0.2g chlorure de potassium ;
0.2g de Chlorure de sodium ; 0.1g de sulfate de magnésium ; 0.002g de
sulfate de manganèse ; 0.002g de sulfate de fer septahydraté; 0.5
g d'extrait de levure ; 5g de Tricalcium de phosphate, maintenez le pH à
7 et autoclavez à 121 °C pendant 15min.
2- Préparer le milieu PVK de bleu de
Bromophénol solide contenant 10g de glucose ; 0.5 0.01g d'Ammonium
sulfate hydraté; 0.2g chlorure de potassium ; 0.2g de Chlorure de sodium
; 0.1g de sulfate de magnésium ; 0.002g de sulfate de manganèse ;
0.002g de sulfate de fer septahydraté; 0.5 g d'extrait de levure ; 15 g
Agar ; 0,25g de Bromophénol ; 5g de Tricalcium de phosphate, maintenez
le pH à 7 -7.2 et autoclavez à 121 °C pendant 15min.
3- Prélever 1g de chaque échantillon de sol et
ajouter dans les tubes à centrifugeuse contenant 10 ml d'eau
physiologique (NaCl 9%o) stérile
4- Agiter pendant 1h
5- Une heure après agitation, Un ml (1 ml) de la
dilution 10-1 est prélevée aseptiquement et mis dans 9
ml d'eau physiologique stérile donnant ainsi la dilution 10-2
qui est agitée avant de prélever 1ml que l'on ajoute à 9
ml d'eau physiologique stérile et ainsi de suite jusqu'à la
dilution 10-7.
6- 100 ul de chaque dilution sera prélevée et
étalé sur les boites de Pétri contenant le milieu PVK
gélosé. Trois boites seront été
préparées pour chaque dilution. Elles seront incubées
à 30° C pendant 7jours dès leur ensemencement.
7- De même, 20 ul de chaque dilution sera
prélevée et inoculée les microplaques contenant 200 ul de
milieu PVK liquide. Elles seront incubées à 30° C pendant
7jours dès leur ensemencement.
8- 7 jours après incubation, le nombre de
bactéries solubilisatrices de phosphate est déterminé au
spectromètre à DO 620 nm sur milieu liquide en microplaque.
9- Sur le milieu solide PVK, l'activité de
solubilisation de phosphate des BSP est évaluée par la
détermination de halos (zone claires) autour des colonies en croissance.
Ainsi, le diamètre de la colonie et de l'halo qui l'entoure seront
mesurés. L'indice de solubilisation sera calculé de
solubilisation.
L'indice de solubilisation sera calculé par la formule
suivante :
IS =
Diamètre de la colonie + Diamètre de
l'halo
Diamètre de la colonie
10- Les isolats ayant un IS >2 seront
sélectionnés puis réutilisés pour
réensemencer à nouveau des
microplaques contenant PVK. Cette procédure sera
répétée 3fois pour une purification des
XV
différents isolats de BSP. Les caractéristiques
morphologiques comme décrit par Sharna et al., (2011) de chaque
isolat seront mentionnées.
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