Etude de la sensibilite des germes resistants aux antibiotiques couramment utilises sur les huiles essentielles

II.9. METHODES

La méthode est définie comme une manière de réaliser quelque chose suivant certains principes et avec un certain ordre. ( http://wiktionary.org)

Notre étude a utilisé la méthode clinique ou empirique.

II.9.1.Types d'études

Dans ce travail, nous réalisons une étude descriptive qui a pour but de se rendre compte d'un phénomène de santé, de sa fréquence, de sa distribution et de son évolution et les facteurs des risques dans la population.

II.9.2.Procédure

1) Coloration de Gram

v Principe : Les bactéries en paroi épaisse (riche en peptidoglycane) fixent le premier colorant et résistent ; celles en paroi mince (moins riche en peptidoglycane) sont décolorées et fixent le deuxième colorant :

- Les bactéries qui fixent le premier colorant sont Gram positif ;

- Les bactéries qui fixent le deuxième colorant sont Gram négatif.

v Réactif et rôle :

- Violet de gentiane 1% colorant

- Lugol 30 %(fixation ou mordançant)

- Acétone alcool décolorant

- Safranine rouge ou Fuschine basique colorant

v Technique :

- Confectionner un frottis ;

- Fixer la préparation sur la lame en faisant passer celle-ci à la flamme de la lampe alcool 2 ou 3 fois ;

- Placer les lames sur le pont de coloration ;

- Couvrir la préparation du violet de gentiane pendant une minute ;

- Rincer à l'eau de robinet ;

- Couvrir le Lugol pendant une minute ;

- Rincer à l'eau ;

- Couvrir la préparation de l'alcool acétone jusqu'à sa décoloration totale ;

- Couvrir la préparation de la Fuschine basique ou safranine rouge pendant 10 secondes ;

- Egoutter, sécher la lame à l'abri de la poussière, et passer à la microscopie.

Les bactéries Gram positives sont colorées en violet foncé et sont soit staphylocoques, streptocoques, microcoques, pneumocoques, entérocoques, bacilles diphtériques, bacilles du charbon.

Tandis que les bactéries Gram négatives sont colorées en rose et sont soit gonocoques, méningocoques, colibacilles, Shigelles, Salmonelles, Vibrionscholérae.

2) Extraction des extraits de plantes

L'extraction est l'action d'extraire.

Cette étude a utilisé la méthode d'extraction par infusion vu que les parties de plantes sont tendres (les feuilles, fleurs). Cette méthode consiste à :

- Faire bouillir de l'eau à une quantité de 200ml ;

- Mettre le produit dans le récipient et verser de l'eau bouillante ;

- Couvrir avec un couvercle et laisser infuser pendant 15minutes ;

- Après, filtrer avec une passoire (à thé) et verser le liquide dans un récipient pour le conserver (BENZANGER L. et al, 1975, pg 22).

Toutes les plantes à savoir Euphorbia hirta, Allium sativum, Allium cepa, Aloevera ont été récoltées selon les normes traditionnelles par un couteau pour arracher les feuilles et au ciseau pour les fleurs.

3) Vérification des souches bactériennes

v Préparation et stérilisation de la verrerie

Les ballons, les boites de Pétri, les erlenmeyers, les tubes à essai, les pipettes bien propres et sèches ont été bouchés à l'ouate et emballés chacun dans un papier journal.

En se servant d'un perforateur, des disques de 5mm de diamètre ont été découpés sur un papier buvard. Une fois découpés, les disques ont été mis dans une boite de Pétri. L'ensemble de tout ce matériel a été stérilisé à l'autoclave à 121°C pendant 30 minutes.

v Techniques d'asepsie

Toutes les opérations en microbiologies se font en évitant toute contamination éventuelle par d'autres organismes que ceux qui sont utilisés, c'est-à-dire de façon aseptique. A cet effet, les opérations se font autour d'une flamme qui éloigne les micro-organismes de l'air. Les boites de Pétri sont entrouvertes juste le temps nécessaire à la manipulation. Il est conseillé d'éviter de toucher les bords du couvercle et de la boite même : la boite de Pétri est prise par le pouce et l'index.

Les fils et les anses servant aux repiquages et aux ensemencements sont rougis avant d'effectuer les prélèvements et les repiquages. Les fils et les anses sont à nouveau rougis pour tuer tous les organismes restants.

Les tubes à essai bouchés au coton sont tenus inclinés dans la main gauche et ouverts à main droite qui tient par ailleurs l'instrument d'ensemencement. Le petit doigt replié sert à saisir et sortir (en tournant) la mèche du coton obtenant le tube. Le pouce et l'index à tenir l'instrument d'ensemencement. Aussitôt ouvert, l'orifice du tube est porté quelques secondes dans la flamme.

Après l'ensemencement, l'orifice du tube est à nouveau flambé avant d'être bouché. Pendant tout ce temps, l'ouate ne devra être souillée par aucun contact (la main, la table, etc.) (VAN PEE et coll., S.D, pg 46).

v Pré-culture

Le bouillon peptone a servi de milieu pour les pré-cultures. Un tube à essai a été ensemencé pour chacune de souche bactérienne différente, les bactéries ont été conservées au réfrigérateur à 6°C, ce qui a permis de les garder en latence en attendant leur utilisation.

v Culture sur milieu solide

Un seul milieu de culture solide a été utilisé à savoir : la gélose de Müeller Hinton qui a été coulée dans des boites de Pétri.

Des pré-cultures réalisées comme décrit ci-haut, quelques millilitres ont été pipetés et coulés sur les milieux solidifiés dans des boîtes afin de former un tapis microbien.

A cette étape, il a été procédé au dépôt soigneux des disques à la surface du tapis. Après 24 heures à l'incubateur les zones d'inhibition ont été lues.

Aussi, afin de se rendre compte de l'effet bactéricide ou bactériostatique de nos extraits aqueux, il a été procédé au repiquage de la zone d'inhibition, à l'aide d'une anse de platine dans le bouillon peptone. Le tout a été incubé à 37°C et les observations se sont accompli 24heures et 48 heures après.

v Test d'antibiogramme (Aromatogramme)

Des disques antibiogrammes de 5mm de diamètre ont été découpés dans du papier buvard stérilisés à chaleur sèche et ensuite plongés dans la solution médicamenteuse pendant quelques heures. Les disques étaient ensuite séchés à l'incubateur à 37°C pendant 24 heures. Une jeune pré-culture de 24 heures était étalée en tapis bactérien sur gélose de Müeller Hinton et le disque était ensuite délicatement placé sur le milieu égoutté autour d'une flamme. L'incubation se faisait à 37°C pendant 24 heures, et 48 heures. La présence ou l'absence de zone d'inhibition renseigne sur l'activité vis-à-vis du germe concerné. Aussi, afin de se rendre compte de l'effet bactéricide ou bactériostatique de ces extraits aqueux, il a été procédé au repiquage de la zone d'inhibition, à l'aide d'une anse de platine, dans le bouillon peptone, les résultats sont lus après 24 heures.