ANNEXES
ANNEXE 2 : ELISA COMPETITIVE
Test ELISA pour la détection des anticorps
anti-brucella dans le sérum
Kit BRUCELLA-AB C-ELISA (SVANOVIR ND)
Protocole
Préparation des réactifs
Le tampon PBS-Tween :
Diluer 20 fois la solution de PBS-Tween 20 fois
concentrée (1/20) avec de l'eau distillée. Préparer 500 ml
par plaque en ajoutant 25 ml de la solution de PBST dans 475 ml de l'eau
distillée et mélanger vigoureusement.
NB : Bien vérifier qu'il n'y a pas de cristaux de
précipitation au fond du récipient, si oui réchauffer
légèrement et bien agiter encore.
La solution d'Acs monoclonaux
Reconstituer l'Ac monoclonal lyophilisé par ajout de 6
ml de tampon de dilution. Ajouter délicatement le tampon dans la
bouteille. A préparer juste avant usage. Mélanger doucement. De
grâce ne pas utiliser le vortex!
1. Tous les réactifs doivent être ramenés
à la température ambiante (18-25oC)
2. La dilution des échantillons et des témoins
peut se réaliser de 2 façons différentes :
1. Une predilution dans les tubes,suivie de l'ajout de
l'échantillon et des témoins dans les puits vides, ou bien
2. Ajouter les échantillons et témoins
directement dans les puits de la plaque préalablement remplis avec le
tampon.
(Lors de notre manipulation, on a fait une predilution)
3. Predilution des témoins et
échantillons
Prédiluer au dixième les 3 témoins et
échantillons à tester dans les tubes en ajoutant 20 ìl
des témoins respectifs ou échantillon dans 180 ìl de
tampon de dilution d'échantillon.
NB : -Ajouter 50 ìl du tampon de dilution
d'échantillon dans 2 puits appropriés (CC : Contrôle
conjugue)
-Ajouter 50 ìl du témoin ou échantillon
prédilué respectivement dans chacun des puits appropriés
ou correspondant. Tester chaque témoin en duplicata.
Pour confirmation d'usage, il est recommandé de tester
les sérums en duplicata.
4. Ajouter 50 ìl de solution d'Acs
monoclonaux dans les puits utilisés pour le témoin et
échantillon
NB : Le temps entre l'ajout de
témoins/échantillons et la solution d'Acs monoclonaux ne doit pas
dépasser 10 minutes.
5. Sceller (fermer) la plaque et
mélanger les réactifs en agitant la plaque pendant 5
minutes sur un agitateur. Tapoter alternativement les
côtés de la plaque.
6. Incuber à la température
ambiante (18 à 25oC) pendant 30 minutes.
7. Rincer la plaque 4 fois avec PBST. Pour
chaque rinçage, remplir les puits et les vider tout en tapotant fort
pour éliminer tout le reste du liquide.
8. Ajouter 100 ìl de la solution
conjugué dans chaque puit. Sceller (fermer) la plaque et incuber
à la température ambiante pendant 30 minutes.
9. Répéter l'étape 7
10. Ajouter 100 ìl de la solution de
substrat dans chaque puit et incuber pendant 10 minutes
à la température ambiante (18-25oC).Mettre en marche
le chrono après remplissage du premier puits.
11. Arrêter la réaction en
ajoutant 50 ìl de la solution stop dans chaque puit et mélanger
minutieusement. Ajouter la solution stop dans le même ordre que pour la
solution de substrat dans l'Etape 10.
12. Mesurer la DO des témoins et
échantillons au spectrophotomètre à une longueur d'onde de
450nm. La lecture des DO se fait dans les 15 minutes qui
suivent l'ajout de la solution stop pour éviter la fluctuation des
valeurs des DO.
ANNEXE 3 : ELISA INDIRECT
Test ELISA pour la détection des anticorps anti-IBR
(anti BVD) dans le sérum.
Kit IBR-Ab (ou BVD-Ab) ELISA (SVANOVIR ND)
Protocole
Préparation des
réactifs
PBS-Tween tampon :
Diluer la solution PBS-Tween 20 fois dans l'eau
distillée. Préparer 500 ml par plaque par addition de 25ml la
solution de PBST à 475 ml de l'eau distillée et mélanger
efficacement.
N.B : Vérifier qu'il n'y a pas de cristaux de
précipitation dans la bouteille. Si les cristaux sont présents,
chauffez et agitez efficacement.
Le Conjugué anti IgG bovin
Reconstituer le conjugué lyophilisé avec 11,5ml
de solution de PBS-Tween. Ajouter avec soin la solution tampon à la
bouteille. Laisser la solution 1 minute et mélanger à fond. A
préparer immédiatement avant usage.
La solution conjuguée reconstituée peut
être gardée à - 20°C et peut être
décongelée et recongelée au plus 3 fois.
Tous les réactifs doivent être exposés
à 18-25°C avant l'utilisation. Identifier tous les tubes avec un
numéro.
1. Echantillons de sérum
Pour l'IBR
A. Ajouter 100 ìl de la solution
tampon à chaque puit qui sera utilisé pour chaque
échantillon de sérum.
B. Ajouter 4 ìl de sérum de
contrôle positif (réactif A) et 4 ìl de sérum de
contrôle négatif (réactif B) respectivement aux puits
couverts de l'antigène viral IBR et aux puits correspondant couverts par
un antigène de contrôle. Pour confirmation, il est
recommandé de dupliquer les sérums de contrôle.
C. Ajouter les 4 ìl de
l'échantillon de sérum à un puit
sélectionné couvert par un antigène viral et à un
puit correspondant avec un antigène de control. Pour confirmation, il
est recommandé de tester les sérums en duplicata.
Pour la BVD
D. Ajouter 90 ìl de la solution tampon
à chaque puit qui sera utilisé pour chaque échantillon de
sérum et de témoin.
E. Ajouter 10 ìl de sérum de
contrôle positif (réactif A) et 10 ìl de
sérum de contrôle négatif (réactif B) respectivement
aux puits couverts de l'antigène viral BVD et aux puits correspondant
couverts par un antigène de contrôle. Pour confirmation, il est
recommandé de dupliquer les sérums de contrôle.
F. Ajouter les 10 ìl de l'échantillon de
sérum à un puit sélectionné couvert par un
antigène viral et à un puit correspondant avec un antigène
de contrôle. Pour confirmation, il est recommandé de dupliquer les
échantillons.
G. Agiter les plaques efficacement. Sceller la plaque et
l'incuber à 37°C pendant une heure. Continuer a l'étape 3
2. Agiter les plaques ou les barettes efficacement. Sceller la
plaque et l'incuber à 37°C pendant une heure.
3. Rincer les plaques ou les barettes 3 fois
avec la solution tampon PBS-Tween, à chaque cycle de
rinçage remplir les puits, vider la plaque et tapoter fort pour enlever
tous le reste de liquide.
4. Ajouter 100 ìl du conjugué
à chaque puit et incuber à 37°C pendant une
heure.
5. Répéter l'étape 5
6. Ajouter 100 ìl de la solution du
substrat à chaque puit. Incuber pendant 10 min
à la température de la pièce à 18-25°C.
Commencer à compter quand le premier puit est plein.
7. Arrêter la réaction par ajout de 50
ìl de la solution stop à chaque puit et mélanger
efficacement ; ajouter la solution stop dans le même ordre que pour
la solution substrat dans l'étape 8.
8. Mesurer la densité optique des contrôles et
des échantillons à 450 nm à l'aide du
spectrophotomètre.
Mesurer les DO dans 15 min après l'addition de la
solution stop en vue de prévenir la fluctuation des valeurs des DO.
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Evaluation de la séroprévalence et
impact des maladies abortives sur la réussite de l'insémination
artificielle bovine au Sénégal : Cas de la région de
Thiès.
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RESUME
Cette étude visait à évaluer la
séroprévalence et l'impact des pathologies abortives sur la
réussite de l'insémination artificielle (IA) bovine.
L'enquête sérologique a été menée au mois de
Décembre 2007 et le diagnostic précoce de gestation fait en
février 2008 sur 132 vaches faisant partie du programme national
d'insémination artificielle dans la région de Thiès. Trois
maladies à caractère abortif en l'occurence la brucellose, la
Diarrhée virale bovine/Maladie des muqueuses (BVD/MM) et la
Rhinotrachéïte infectieuse bovine(IBR) ont fait l'objet de
dépistage au niveau du labo de Microbiologie Immunologie et Pathologie
Infectieuse de l'EISMV de Dakar. Les résultats obtenus sont les
suivants :
Sur 132 sérums analysés pour rechercher des
anticorps anti brucella, anti BVD et anti IBR, on a trouvé
respectivement 2 cas, 62 cas et 102 cas positifs soit une prévalence de
1,5% pour la brucellose, 47% pour la BVD et 77,3% pour l'IBR.
Notre étude a montré que certains facteurs
influent sur le portage de l'infection. Il s'agit du système
d'élevage et la Note d'état corporel(NEC). En effet les vaches
évoluant en système intensif offrent une prévalence plus
élevée en BVD (47,4%) et en IBR (84,2%) que celles du
système semi intensif. Les vaches maigres (NEC=2,5) présentent
un pourcentage élevé d'infectées avec 47,1% pour la BVD et
86,3% pour l'IBR.
L'importance de ces maladies dans la région de
Thiès se justifie par le nombre important des vaches infectées.
En effet, sur 132 vaches dépistées, 115 soit 87% sont
séropositives au moins à l'une des 3 pathologies
investiguées.
Un taux de réussite de l'insémination
artificielle de 46% a été enregistré.
Concernant la relation entre le statut sérologique et
l'état physiologique des vaches, notre étude montre qu'il y a
aussi bien des vaches séropositives à l'une ou l'autre de ces
maladies dans la catégorie des vaches gestantes que dans celle des non
gestantes. Toutefois on remarque que parmi les 63 vaches gestantes, 8
seulement, soit 6% des vaches inséminées, sont indemnes des
maladies dépistées. Tenant compte des travaux des autres auteurs,
c'est seulement ces 8 vaches qui pourront donner des veaux viables.
Devant l'impérieuse nécessité de
gérer le potentiel reproducteur de la population animale et
d'accroître sa productivité par tous les moyens dont l'IA, il y a
lieu de revoir des stratégies de lutte contre ces affections abortives
des ruminants au Sénégal, car aucun programme d'IA malgré
ses bonnes ambitions, ne peut parvenir à ses fins avec des animaux
infectés.
Mots clés : Maladies
abortives- Bovins- IA- Thiès
Auteur : Sylvain HABIMANA
E-mail :
habishema@yahoo.fr
B.P. : 80 Gitarama - RWANDA Tel :
(250) 08488224
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