Memoire Online - Polymorphisme des antigenes plaquettaires humains dans la population tunisienne

Cette étude statistique a été menée dans le but de déterminer la distribution des fréquences alléliques, génotypiques, phénotypiques, les fréquences haplotypiques et le déséquilibre de liaison des cinq premiers systèmes plaquettaires dans l'échantillon étudié. Elle nous permet d'étudier l'équilibre de la population Tunisienne pour les locus étudies en utilisant l'approche de H-W.

Les moyens statistiques que nous avons utilisés sont les suivants : Les tests statistiques et le logiciel SAS.

1. Calcul des fréquences géniques et génotypiques en cas d'équilibre panmictique :

Il s'agit de la proportion des différents allèles d'un gène dans une population.

Chaque individu, étant diploïde, à 2 loci pour chaque système plaquettaire, soit en tout 2N loci pour tout l'échantillon. Donc, les allèles présents dans les loci sont l'allèle a et l'allèle b.

Les individus aa ont deux allèles a, les individus ab ont un seul allèle a et un seul allèle b, ceux qui ont le génotype bb n'ont évidemment aucun allèle a. La fréquence de l'allèle a c'est donc la proportion de l'allèle a parmi tous les gènes de la population qui peuvent occuper le locus (a, b). De même, q est la proportion des allèles b. puisque le locus (a, b) est nécessairement occupé soit par a soit par b et que ces éventualités sont mutuellement exclusives, on a donc en cas d'équilibre : p ₊ q ₌ 1

Les fréquences des deux allèles a et b sont obtenues par les formules suivantes :

Donc il s'agit de calculer le nombre de sujets présentant un allèle donné qu'on divise par le nombre total des allèles dans chaque locus : chaque individu possède deux allèles dans un locus donné.

Soit l'échantillon étudié de N individus et on a 3 génotypes (aa) n₁, (ab) n₂ et (bb) n₃

Les fréquences génotypiques observées sont obtenues par un comptage direct. On calcule le nombre de sujets présentant un phénotype donné qu'on divise par le nombre total de sujets étudiés. Les fréquences génotypiques calculées : sont estimées à partir des fréquences alléliques en se basant sur la loi de H-W :

Il est appelé aussi intervalle au risque d'erreur á. Cet intervalle a une probabilité de 1-á de contenir la vraie valeur (inconnue) d'un paramètre donné. Pour un %, l'IC (à 95%, au risque d'erreur 5%) est calculé de la manière suivante :

Cet intervalle nous permet de dire que, pour un échantillon de N individus, les résultats sont fiables à #177; IC pour un résultat caractéristique à un % d'erreur de 5%.

Une hypothèse génétique s'étend d'ordinaire à plusieurs classes de génotypes. Pour l'estimer, nous avons besoin d'un test qui nous permette d'associer une probabilité aux écarts observés dans un échantillon par rapport aux fréquences attendues et de décider si les écarts relèvent ou non du seul hasard. Ce test doit également tenir compte de la taille de l'échantillon et du nombre de variables (degrés de liberté). Le test appelle du ÷² satisfait à ces exigences.

ü Test chi-deux ( ÷² ) : La valeur x²est calculée enappliquant la formule

Nous avons : n-1 degrés de liberté (dl) pour fixer, au hasard, les valeurs de n classes d'une expérience. Dans notre cas, on a 3 génotypes. Ainsi, nous aurons : 3-1 =2 degrés de liberté.

Limitation de l'utilisation du Test chi-deux : L'utilisation du Test chi-deux pour l'analyse des résultats d'expérience génétique a deux limitations importantes. (1) Les éléments du calcul doivent être les effectifs de classe eux-mêmes et non les pourcentages ou les proportions déduites de ces effectifs. (2) On ne doit pas l'utiliser quand une des classes a un effectif théorique inférieur a 5.

Cette correction n'entraîne habituellement qu'une légère diminution de la valeur du ÷², mais elle peut jouer un rôle important au voisinage de la valeur critique.

1) Le SAS. On a utilisé ce logiciel dans le but de comparer les fréquences alléliques des HPAs étudiés à travers les différentes populations.

2) L'Arlequin. Pour calculer les fréquences haplotypiques et le déséquilibre de liaison :

RESULTATS DE L'AMPLIFICATION PAR PCR DES ALLELES : (GP3A*1/ GP3A*2), (GP1BA*1/GP1BA*2), (GP2B*1/GP2B*2), GP3A*1/GP3A*3 et GP1A*1/ GP1A*2

Les profils électrophorétiques des figures représentent des exemples des génotypes HPA-1, -2, -3, -4, et -5 détectés sur gel d'agarose. Les produits amplifiés sont de tailles distinctes : Les bandes les plus lourdes sont les bandes les plus lentes et elles correspondent aux produits amplifiés du contrôle positif HGH de taille (429 pb). Cette bande doit être présente dans chaque échantillon étudié pour permettre de vérifier l'intégrité de la réaction PCR. Concernant les bandes spécifiques, la bande la plus légère correspond au produit amplifié des amorces (90 pb) du système HPA-1 qui migre le plus rapide. Les bandes spécifiques au HPA - 4 (120 pb), ensuite par la bande spécifique HPA-5 (246 pb), puis HPA-2 (258 pb) et enfin par la bande spécifique HPA-3 (267 pb).

Figure 8: Profil éléctrophorétique des amplifications du système HPA-1 en gel d'agarose à 1.5%.

Les puits : M = marqueur de Taille, a = allèle (a), allèle (b), T = témoin négatif (eau distillée). La bonde supérieure présente dans tous les puits correspondants aux produits amplifiés des amorces de contrôle interne HGH. Les bondes inférieures correspondantes aux produits amplifiés des amorces spécifiques des allèles a/b

Figure 9: Profil éléctrophorétique des amplifications des systèmes HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 en gel d'agarose à 1.5%.

L'électrophorèse sur gel d'agarose montrant les 4 systèmes HPAs. Les puits 1 et 2; 3 et 4; 5 et 6; 7 et 8 sont pour les systèmes HPA-2 (258 pb), -3 (267 pb), -4 (120 pb), et-5 (246 pb), respectivement. Le puit 9 contient le marqueur de taille Chaque couple montre des génotypes identiques HPA-2 (a+b-), HPA-3(a+b-), HPA-4 (a+b-) et HPA5 (a+b-). Noter que la bande migrant plus faiblement représente le produit d'amplification de témoin d'amorces positif HGH (429pb).

Analyse statistique de la répartition des fréquences géniques, et phénotypiques des cinq systèmes plaquettaires étudiés

Chaque système est gouverné par un couple d'allèles codominants (a, b). L'allèle a est l'allèle fréquent, il est dit sauvage et il correspond à la synthèse de l'antigène HPA-a. L'allèle b est l'allèle rare, il est dit mutant et il correspond à la synthèse de l'antigène HPA-b. Ces systèmes sont déterminés par des gènes autosomaux.

Les résultats de typage obtenus chez 111 pour le système HPA-1, 105 pour le système HPA-2, 104 pour le système HPA-3, 102 pour le système HPA-4 et 100 donneurs pour le système HPA-5, sont donnés dans le tableau VIII:

Système	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4	HPA-5
a/a	75	66	54	102	78
a/b	33	36	39	0	19
b/b	3	3	11	0	3
Total	111	105	104	102	100

Système		HPA-1	HPA-2		HPA-3		HPA-4	HPA-5
p		0,824	0,800		0,707		1	0,875
q		0,176	0,200		0,293		0	0,125
p ₊q		1	1		1		1	1
Système	Allèle			Nombre		Fréquence % (95% IC)
HPA-1	HPA-1a HPA-1-b			183 39		82,432 17,568 (#177; 5)
HPA-2	HPA-2 a HPA-2 b			168 42		80 20 (#177; 5,410)
HPA-3	HPA-3 a HPA-3b			147 61		70,673 29.327 (#177; 5,181)
HPA-4	HPA-4a HPA-4b			204 0		100 NA 0 NA
HPA-5	HPA-5 a HPA-5b			175 25		87,5 12,5 (#177; 4,58)

On remarque d'après ces données une distribution irrégulière des différentes formes alléliques. Les fréquences des allèles HPA-a sont plus élevées, pour tous les systèmes, que celles des allèles HPA-b. Les allèles HPA-1a, HPA-2a, HPA-3a, HPA-4a et HPA-5a ont les valeurs respectives de 0,824; 0,8; 0,707; 1 et 0,875. Les allèles HPA-1b, HPA-2b, HPA-3 b, HPA-4 b et HPA-5 b ont les valeurs respectives de 0,176; 0,2; 0,293; 0 et 0,125. D'après ces données, on remarque l'importance des fréquences des allèles HPA-b pour les quatre systèmes HPA-1, 2, 3 et 5. D'ailleurs, la fréquence de l'allèle HPA-3b (0,293) est plus élevée que celles de tous les autres allèles, elle est suivie par les allèles HPA-2b (0,2), HPA-1b (0,176) et HPA-5b (0,125).

Figure 10: Représentation graphique de la distribution alléliques des systèmes HPA-1, -2,- 3,-4 et-5 dans l'échantillon étudiée de la population tunisienne

Les génotypes HPAs les plus communs en Tunisie sont les homozygotes (a/a) : HPA-1 (a⁺b^-), HPA-2 (a⁺b^-), HPA-3 (a⁺b^-), HPA-4 (a⁺b^-) et HPA-5 (a⁺b^-) (Voir tableau ci-dessous). On remarque que le système HPA-4 est homogène, tous les individus sont des homozygotes du génotype HPA-4a (aa). Les homozygotes (b/b) sont faibles en comparaison avec les homozygotes (a/a). On met en évidence une fréquence élevée des génotypes homozygotes HPA-3b/b (10,576%) suivi par le génotype b/b du système HPA-5 (de 3 %), le génotype b/b du système HPA-2 (de 2,857 %), et enfin le génotype b/b du système HPA-1 (de 2,702 %) contrairement aux génotypes b/b et a/b du système HPA-4 qui sont totalement absents.

Système	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4	HPA-5
a/a	0,67	0,63	0,520	1	0,78
a/b	0,30	0,34	0,375	0	0,19
b/b	0,03	0,03	0,105	0	0,03
Total	1	1	1	1	1

Tableau XI : Fréquences génotypiques en % des systèmes HPA-1, -2, -3, -4 et 5

Système	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4	HPA-5
a/a	67	63	52	100	78
a/b	30	34	37,5	0	19
b/b	3	3	10,5	0	3
Total (%)	100	100	100	100	100

génotypiques des cinq premiers systèmes HPA dans l'échantillon étudié de la population tunisienne

Lorsqu'un système à deux allèles est en situation de codominance, chacun des trois génotypes diploïdes s'exprime par un phénotype distinct et il existe une correspondance parfaite entre génotype et phénotype. Ainsi, les systèmes plaquettaires se transmettent par codominance et les deux allèles vont s'exprimer d'une manière équivalente chez les hétérozygotes. Les phénotypes sont déduits des génotypes correspondants, c'est pourquoi les fréquences génotypiques sont égales aux fréquences phénotypiques en %. Il existe donc trois phénotypes pour les quatre systèmes HPA-1,-2 -3 et 5 : [aa], [ab] et [bb]. Tandis que pour le système HPA-4 il existe un seul phénotype : [aa].

Pour tirer des estimations valables et pour que ces estimations aient un sens biologique, certaines conditions doivent être remplies lors du prélèvement de l'échantillon afin d'obtenir un échantillon représentatif.

Considérons que l'effectif de l'échantillon est infiniment grand et que les unions se font totalement au hasard (panmixie) sans mutation ni migration ni sélection, c.á.d les génotypes HPAs n'influencent pas le choix du conjoint et les différents génotypes sont également viables et féconds (ils sont neutres du point de vue de la sélection naturelle, les individus sont supposés avoir la même espérance de vie pour les gènes HPAs et ne présentent aucune mortalité différentielle). Dans notre cas, le test ÷² n'est applicable que pour le système HPA-3 dont les effectifs des trois classes sont supérieurs à 5.

On suppose que la population tunisienne est à l'état panmictique pour le locus du système HPA-3.

Les effectifs observés et les effectifs théoriques attendus d'après H-W pour les génotypes du système HPA-3 sont présentés dans le tableau XII.

Il est évident que l'adéquation entre effectifs observés et effectifs théoriques est très bonne : elle n'est pas parfaite à cause des fluctuations statistiques aléatoires des effectifs observés des divers génotypes et qui doivent normalement se traduire par des erreurs négligeables.

Pour vérifier cette hypothèse, on utilise un test statistique qui permet de quantifier l'ajustement aux valeurs attendues : c'est le test chi-deux : ÷².

Il est évident que pour le système HPA -3, l'adéquation entre les effectifs observes et les effectifs théoriques est très bonne : elle n'est pas parfaite à cause des fluctuations statistiques aléatoires des effectifs observés des divers génotypes et qui doivent normalement se traduire par des erreurs négligeables. Pour vérifier cette hypothèse, on utilisé un test statistique qui permet de quantifier l'ajustement aux valeurs attendues : c'est le test chi-deux : ÷²

		Effectifs observés Population étudiée		Effectifs théoriques Population en équilibre		H-W
Systèmes	Génotypes	Nombre	Fréquence	Nombre	Fréquence	÷²(P)
HPA-3	a/a	54	51,920	52	50,0	0,893 (0,5 - 0,3) p>á = 0,05
	a/b	39	37,500	43	41,3
	b/b	11	10, 580	9	8,7

P > 0,05 et le ÷² calculé= 0,893 < ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-3.

		Effectifs observés Population étudiée		Effectifs théoriques Population en équilibre		H-W
Systèmes	Génotypes	Nombre	Fréquence	Nombre	Fréquence	÷² (P)
HPA-1	a/a	75	67,57	75	67,567	0,736 (0,5 - 0,3) p>á = 0,05
	a/b	33	29,73	32	28,830
	b/b	3	2,70	4	3,603

÷² (corrigé) = 0,736< ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-1.

		Effectifs observés Population étudiée		Effectifs théoriques Population en équilibre		H-W
Système	Génotypes	Nombre	Fréquence	Nombre	Fréquence	÷² (P)
HPA-2	a/a	66	62,857	67	63,81	0,0735 (0,8-0,7) p>á = 0,05
	a/b	36	34,285	34	32,38
	b/b	3	2,857	4	3,81

÷² (corrigé) = 0,0735< ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-2.

		Effectifs observes Population étudiée		Effectifs théoriques Population en équilibre		H- W
Système	Génotypes	Nombre	Fréquence	Nombre	Fréquence	÷² (P)
HPA-5	a/a	78	78	77	78	2,53 (0,8-0,7) p>á = 0,05
	a/b	19	19	22	19
	b/b	3	3	1	3

÷² (corrigé) = 2,53 < ÷² théorique = 3,84, donc l'hypothèse est vraisemblable. En conclusion, la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-5.

Dans notre cas, il est inutile de faire un ÷² pour le système HPA-4 pour voir que les effectifs réels ne sont pas statistiquement différents de ceux prévus. Donc, l'hypothèse est vraisemblable et la population tunisienne est en équilibre panmictique pour le locus du gène du système HPA-4.

Haplotype : L'ensemble des allèles de deux loci ou plus situés sur un même chromosome sont dits en cis sur ce chromosome est appelé un haplotype. Le nombre d'haplotype possibles est égal au produit du nombre d'allèles pour chaque gène. Les différents allèles d'un haplotype ont d'autant plus tendance à coségréger, à la méiose, que les locus des différents gènes sont physiquement proches sur ce chromosome, c'est-à-dire, génétiquement liés

Le déséquilibre de liaison : Certaines associations de spécificités a et b sont plus fréquemment associées que ne le voudrait le hasard. Elles sont dites en déséquilibre de liaison. En absence de liaison statistique entre deux allèles a, b (de fréquences respectives P_a et P_b) à deux loci différents, la fréquence du gamète portant ces deux allèles sera P_aP_b.

On appelle déséquilibre de liaison ou (delta Ä), l'écart entre la fréquence observée P_abde l'haplotype ab et la fréquence attendue P_aP_b

Pour 1 degré de liberté (ddl) au seuil á = 5% la valeur de ÷² estde 3.84 à partir de cette valeur de ÷², on dit que l'association est significative et que les deux antigènes sont en déséquilibre de liaison.

Haplotypiques des HPA-2 et HPA-3 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

D'= relative linkage disequilibrium ; paramètre qui mesure la force de l'association haplotypique

Haplotypiques des HPA-1 et HPA-2 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

Haplotypiques des HPA-1, HPA-2 et HPA-3 dans l'échantillon étudié de la population tunisienne.

Ø Estimation du risque d'alloimmunisation antiplaquettaire chez la population tunisienne :

	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4	HPA-5
n_?	38	35	34	31	31
n_?	72	70	70	71	69
Total	110	105	104	102	100
p_?	0.847	0.785	0.72	1	0.791
q_?	0.208	0.214	0.426	0	0.097
p_?	0.847	0.807	0.671	1	0.855
q_?	0.166	0.192	0.271	0	0.13
p_pop	0 .824	0.800	0.707	1	0.875
q_pop	0 .176	0.200	0.293	0	0.125

La population tunisienne est en équilibre de H-W. Elle subit un cycle de reproduction panmictique.

Chez l'homme, chaque système plaquettaire HPA est contrôlé par un gène autosomique codominant (a, b) où les allèles vont s'exprimer d'une manière équivalente.

Les fréquences alléliques et génotypiques sont les mêmes dans les deux sexes, c.á.d. tous les adultes reproducteurs possèdent une fertilité égale. La fréquence des zygotes de la génération suivante est calculée en faisant les produits des fréquences gamétiques comme le montre le tableau suivant de rencontre des gamètes.

Les mères qui peuvent donner des descendants à risque allo-immune ont des génotypes (aa) ou (bb) et les pères sont de génotypes (aa), (ab) ou (bb) (transmission par codominance). Les mères de génotypes (ab) possède les deux allèles a et b donc leurs descendants ne sont pas à risques (Tableau XVII).

Tableau XVII Les fréquences génotypiques des désendants entre différentes unions parentales.

Lorsque les pères et les mères sont de même génotypes (aa) ou (bb) ? le risque est nul.

Lorsque les mères de génotypes (bb) et les pères sont de génotypes (aa) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de p²q².

Lorsque les mères de génotypes (aa) et les pères sont de génotypes (ab) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de ½ (2p³q).

Lorsque les mères de génotypes (bb) et les pères sont de génotypes (ab) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de ½ (2pq³).

Lorsque les mères de génotypes (aa) et les pères sont de génotypes (bb) ? la fréquence des descendants à risque allo-immune est de p²q².

Donc d'après le tableau XVII, les fréquences génotypiques attendues des descendants á risque allo-immune sont :

Les résultats obtenus sont une réalité biologique car toutes les conditions envisagées ci-dessus sont réalisées. Dans les conditions de H-W, les fréquences d'allo-immunisation se maintiennent constantes de génération en génération.

Système	HPA-1	HPA-2	HPA-3	HPA-4	HPA-5
Fréquences théoriques des génotypes dans les descendants à risque allo-immuns (p.q)	0,145	0,16	0,207	0	0,109
Fréquences théoriques des descendants à risquent allo-immuns en (%)	14,5	16	20,7	0	10,9
Effectifs théoriques des allo-immunisations attendues par H.W	16,095	16,8	21,528	0	10,9

En se basant sur ces résultats, on remarque que le taux d'immunisation est variable selon l'antigène considère et qu'un nombre élevé de grossesses (jusqu'à 21,528 (20,7 %) pour le HPA-3) serait incompatible pour les allo-antigènes HPAs dans la population d'étude.

Figure 15: Fréquence théorique des descendants à risque allo-immuns en (%) pour les cinq premiers systèmes chez la population d'étude.

Les HPAs sont des allo-antigènes spécifiquement plaquettaires génétiquement déterminés. Chaque système est codé par un gène bi-allélique d'un seul locus. Les allèles sont indiqués alphabétiquement par ordre de leur fréquence. L'allèle «a» est le plus fréquent, l'allèle «b» est le plus rare. Le polymorphisme de la plupart de ces systèmes est dû à une substitution d'une seule paire de bases au niveau du gène codant.

Nous nous sommes intéressés dans notre étude aux cinq premiers systèmes : HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5 qui se présentent dans l'échantillon étudiée sous les formes alléliques suivantes : HPA-1a, HPA-1b ; HPA-2a, HPA-2b; HPA-3a, HPA-3b; HPA-4a, HPA-5a, HPA-5b.Ces allo-antigènes sont immunogènes et sont impliqués dans la pathophysiologie de la thrombopénie allo-immune qui peut être impliquée dans des syndromes cliniques bien décrits tels que la NAIT et le PTP, mais aussi chez des malades multi-transfusés qui sont réfractaires à la thérapie de la transfusion plaquettaire. Ces systèmes jouent le rôle d'antigènes d'histocompatibilité dans la transplantation d'organes aussi bien que leurs associations avec les maladies cardiaques, la thrombose coronaire et les événements cèrebro-vasculaires. Les données sur la prédominance des antigènes plaquettaires dans une population donnée sont essentielles pour le diagnostic des cas des NAITP immunes, pour la planification des programmes de criblage pour des femmes en danger de FMAIT, pour la consultation génétique et pour la thérapie des patients avec fourniture des anticorps anti-HPA (Mueller-Eckhardt. C et al., 1989; Bussel. J. B et al., 1997; Roúman. P. 2002). Excepté leur impact pratique sur la provision des transfusions des PLTs. Elles contribuent également à la compréhension des rapports évolutionnaires et offrent des informations sur les expansions démographiques (Roúman. P. 2002). En effet les allo-antigènes spécifiquement plaquettaires constituent des marqueurs génétiques.

Le génotypage des HPAs peut être utile pour le diagnostic, pour la thérapie et la prévention des syndromes thrombocytopénques allo-immunes telles que la NAIT et le PTP (Nauck. M. S et al., 1999), ainsi que dans les traitements de differentes maladies (Liu T.C et al., 2002) et dans la prévision des composants du sang en HPAs pour ces malades (Hatzidimitriou. Gr et al., 2001; Ficko. T et al., 2004).

Le typage des allo-antigènes plaquettaires ont été tout d'abord identifiés par des techniques sérologiques telles que l'ELISA, la cytométrie en flux, la technique du MAIPA (Kiefel V et al., 1987; Okomato N et al., 1998) et l'agglutination plaquettaire.

Le typage sérologique des HPAs en pratique courante est bien développé (Kekomäki., 1995; Chang. Y. W et al., 1998). Mais au fil des années, on a remarqué qu'il a plusieurs inconvénients.

D'abord, la présence à la fois d'anticorps leucocytaires humains et d'anticorps de groupes sanguins. Le système HPA-1, présente un risque de confusion (Okamoto. N et al., 1998). De plus, on a remarqué qu'il y a un manque d'alloantiserums bien caractérisés et des difficultés d'obtenir du sérum de typage de bonne qualité (Simsek et Von Dem Borne., 1994; Cavanagh. G et al., 1997), qui sont dus à la faible immunogénécité des HPAs et la contamination de ces sérums par des anticorps anti-HLA (Killick. S. B et al., 1997). Les difficultés et l'insuffisance d'obtenir des PLTs qu'on observe chez les malades avec thrombocytopénie (Boldt B et al., 1997) et chez les foetus (NAIT) rend le diagnostic difficile et peut affecter le foetus pendant le prélèvement du sang. Le phénotypage ne peut pas être réalisé pour tous les antigènes plaquettaires car on ne dispose pas d'allo-anticorps correspondants. De plus les techniques de typage sérologique présente plusieurs inconvénients ; le test de MAIPA où le risque d'un résultat négatif est élevé, qui est dû à la compétition des anticorps humains avec des anticorps monoclonaux de capture, en plus ce test nécessite une quantité de PLTs significative, et il est de réalisation longue et délicate. Ainsi que la mise en évidence des allo-anticorps maternel n'étant pas toujours facilement mis en évidence (Santoso. S . A et al., 2003).

Les méthodes de typage basées sur l'ADN sont devenues plus exactes (Kluter et al., 1996; Legler TJ et al., 1996; Bein G. H et KLuter. H. 1997; Chang. Y. W et al., 1998), plus performantes, plus rapides et sont plus préférables de ce fait, plus utilisables que les méthodes sérologiques conventionnelles. Ainsi, l'amplification de l'ADN génomique par PCR élimine le besoin des PLTs et exige seulement un petit nombre de cellules nucléées de différentes sources telles que le liquide amniotique ou la villosité chorionique pour tester les cas de NATP foetale (Boldt. B et al., 1997). Elle permet aussi d'obtenir des résultats même dans les cas de thrombopénie extrême (Cavanagh. G et al., 1997). En fait, plusieurs techniques de génotypage moléculaire basées sur la PCR se sont développées (Meyer. O et al., 1999). On cite parmi elles : La PCR allele-specefic oligonucleotide (Bray. P. F et al., 1994), PCR-ASRA : allele-specefic restriction enzyme analysis (Kuijpers. R. W. A. M et al., 1992; Simsek S et al., 2003 ; Kalb. R et al., 1994), PCR-SSCP : single-strand conformation polymorphism (Jin. Y et al., 1993; Skogen. B et al., 1994; Peyruchaud. O et al., 1995), PCR-PHFA : preferential homoduplex formation (Fuijawara et al., 1996), PCR-OLA : Oligonucleotide ligation assay (Zotz. R. B et al., 1997) (Nauck M. S et al., 1999). La PCR-RFLP (Unkelbach. K et al., 1995), RT-PCR: (Simsek et al., 1997), La PCR-SSP : sequence-specefic primers (Lyou. J.Yi et al., 2002 ; Jones. D. C et al., 2003). Cependant, toutes ces méthodes ont des inconvénients, d'ailleurs elles exigent un processus étendu de post-amplification, y compris l'électrophorèse (ASRA, SSP, SSCP, PHFA (Nauck M. S et al., 1999).

La PCR en temps réel est une méthode idéale pour le diagnostic de routine et la prévention des conditions cliniques associées aux HPAs. Elle peut être utilisée dans l'étude des populations et pour la recherche d'autres effets potentiels de ces polymorphismes ; par exemple, leurs rôles comme antigènes d'histocompatibilité dans la transplantation (Kekomaki. S et al., 2001; Jones. D. C et al., 2003), leurs effets sur le fonctionnement des intègrines et leurs associations possibles avec les maladies cardio-vasculaires (Weiss. E. J et al., 1996; Zotz. R. B et al., 1998; Ardissino et al., 1999; Jones. D. C et al., 2003).

Il est essentiel de combiner les analyses phénotypiques et génotypiques pour éviter une erreur de typage plaquettaire et rendre un diagnostic erroné dans le cadre d'un processus d'allo-immunisation. Il reste important de signaler que les résultats de typage, dans quelques cas, peuvent être confirmés par le séquençage direct.

La méthode adoptée dans notre étude est la PCR-SSP. Elle est simple, exacte et rapide (Chang. Y. W et al., 1998) car elle se fait en une seule étape (á la différence des autres techniques laborieuses comme la RFLP qui exige une étape post-amplification par digestion enzymatique). De plus, la spécificité des primers facilite la détection du produit amplifié (Kulkarni. B et al., 2005). Elle est également fiable, très sensible, complète et reproductible à faible coût. Elle a aussi la possibilité d'être appliquée sur les liquides amniotiques, ce qui mènera à un typage plus étendu et plus complet des antigènes plaquettaires et facilitera le diagnostic exact des thrombocytopénies allo-immunes et la prévision de produits du sang pour ces malades. De même, elle offre la valeur particulière dans l'identification rapide des donneurs des PLTs convenables pour les patients qui exigent la transfusion des cellules plaquettaires. Ce qui explique le fait qu'elle soit utilisée pour la routine en cas de génotypage rapide dans les laboratoires et pour les études de recherches de génétique des populations à grande échelle. De même, elle peut être mise à jour pour inclure d'autres allèles HPA de faible fréquence aussi bien que d'autres allo-antigènes plaquettaires génétiquement caractérisés (tel que le système Gov). Cette technique est optimisée dans notre laboratoire pour fournir une résolution maximale à coût minimum.

Pourtant, cette méthode présente quelques inconvénients. Un inconvénient majeur de cette méthode est que des conditions PCR différentes ont été exigées pour définir chaque paire d'allèles (Skogen. B et al., 1994; Tanaka. S et al., 1995 ; Cavanagh. G et al., 1997). De même, l'amplification des deux allèles exige deux tubes séparés ce qui nous coûte plus de dépenses et de temps (Boldt. B et al., 1997). De plus, la PCR-SSP est un processus dynamique qui exige des conditions optimum pour assurer une amplification spécifique.

De nombreux facteurs peuvent affecter l'efficacité de la PCR : erreurs de pipetage, mauvaise qualité de l'ADN, présence d'inhibiteurs... . Ainsi, le protocole associé au produit doit donc être rigoureusement respecté. L'échantillon d'ADN extrait va fournir la matrice pour l'amplification spécifique, d'où l'importance de sa qualité. La concentration et la pureté doivent se situer dans la limite des valeurs précisées dans le protocole. Il est important de noter que le BET utilisé pour la coloration de l'ADN est cancérigène potentiel et que tous les produits à base de sang doivent être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Toutefois, aucune méthode d'analyse connue ne peut garantir que des produits dérivés du sang humain ne transmettent pas d'agents infectieux. De même, il faut faire attention à l'UV susceptible d'affecter la peau et les yeux. Cependant, pour installer un programme de criblage, la PCR en temps réel serait préférée parce qu'elle prend moins du temps et évite l'utilisation de BET et l'UV.

D'après les résultats obtenus, nous avons remarqué que les fréquences des antigènes plaquettaires varient entre les différents systèmes chez l'échantillon étudié de la population tunisienne. Ainsi, bien que les fréquences alléliques HPA-a soient élevées pour les cinq systèmes HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4 et HPA-5, on note que les fréquences des allèles HPA-b sont importantes pour les quatre systèmes polymorphes HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5 contrairement au système mineur HPA-4 qui est monomorphe où l'allèle b est totalement absent chez cet échantillon. Ce qui prouve que la population tunisienne est manifestement hétérogène et que notre population est à haut risque d'allo-immunisation pour ces 4 systèmes HPA-1, 2, 3 et 5.

En effet, la Tunisie a ses propres distributions alléliques et génotypiques des systèmes HPAs qui lui sont spécifiques. D'ailleurs, les résultas obtenus montrent que la population tunisienne est hétérogène. Elle se caractérise par un haut taux de mélange ethnique. Un fait d'état qui peut être expliqué par beaucoup de raisons géographiques, historiques et sociales.

D'autre part, La Tunisie occupe une zone géographique stratégique. Elle s'ouvre sur la Méditerranée au nord et à l'est. Elle tend par le sud vers le Grand Sahara et l'Afrique. Ainsi, la Tunisie est vue comme un point de liaison entre l'Europe et l'Afrique et entre l'est et l'ouest. C'est pour ces raisons qu'elle a été une cible de conquêtes et de migrations de toutes les directions; d'abord les Phéniciens, puis les Romains et les Byzantins, ensuite les Arabes, les Turcs, la colonisation française jusqu'à l'apparition de l'état national moderne.

Ainsi, le peuplement de la Tunisie est issu de la migration de populations venues de tous les endroits (introduction de nouveaux géniteurs). Les tribus berbères (Amazigh) ont assisté à des échanges culturels et génétiques avec les autres populations et civilisations qui se sont soldés quelquefois par le refus et la révolte et par l'acceptation, l'entraide et l'échange jusqu'à la dissolution dans d'autres cas. Ces échanges entre la population autochtone et les peuples venant de l'extérieur ont joué un rôle majeur dans l'enrichissement génétique de la population.

Du coup, on parle de la diversité du peuple tunisien, un peuple où vivent des personnes de plusieurs origines.

Parmi ces peuples qui ont vécu en Tunisie on cite : Les berbères, les phéniciens, les romains, les arabes, les turcs, les andalous (mourisquioun), les africains noirs et les juifs (Hmida S et al 1995).

De plus, ce mélange peut être expliqué par la transmission des gènes entre individus appartenant à ces différents groupes ethniques par voie de reproduction sexuée (le mariage).

Bref, la population tunisienne d'aujourd'hui est un ensemble d'origines berbères, arabes, africaines et européennes. Ce qui lui procure une propriété de mixage.

L'investigation génétique réalisée nous a permis d'étudier l'équilibre de la population Tunisienne pour les locis des systèmes HPAs étudiés. D'ailleurs, cet équilibre a été vérifié en utilisant l'approche décrite par H-W. L'application de la loi H-W nous a permis de constater que l'échantillon étudié est en équilibre panmictique pour les locis précités. Cet équilibre s'explique par l'absence de grandes sélections orientées contre les génotypes HPAs (a/b) malgré l'existence de quelques cas de mort des nouveaux nés thrombopéniques à la naissance ou dans les heures qui suivent. Cet équilibre a pour origine probable l'absence de sélection orienté contres l'un des différents génotypes et les flux géniques qui sont en grande partie très anciens. De plus, la prévention, la prise en charge des thrombopénies chez les nouveaux nés et les patients polytransfusés et la thérapie des conditions cliniques dues à l'immunisation plaquettaire sont bien développés en Tunisie ; ce qui intervient directement dans la diminution des cas de mort.

La probabilité pour développer une réponse allo-immune chez les individus dépend des fréquences des antigènes qui peuvent varier d'une population à une autre.

La différence entre les fréquences alléliques (a et b) des systèmes HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5 montre que la population tunisienne est à haut risque d'allo-immunisation.

D'après nos résultats, nous avons trouvé que le système mineur HPA-4 n'est pas polymorphe et que l'allèle 4b est absent chez notre population, ces résultats suggèrent que le HPA-4 n'a pas d'importance clinique.

De même, nous avons observé la forte présence de HPA-3b suivi respectivement par HPA-2b, HPA-1b et HPA-5b.

Le système HPA-3 est donc le plus polymorphe, ce qui signifie que cette population a un plus gros risque d'allo-immunisation pour ce système. Ce système est en principe à implications cliniques importantes. Théoriquement parlant, plus le degré de polymorphisme dans un système antigénique est haut, plus il est cliniquement important, bien que ce ne soit pas toujours vrai. Il existe d'autres importants facteurs qui contribuent dans ce phénomène dont l'immunogénicité et l'accessibilité de l'antigène à l'anticorps formé.

Selon les résultats trouvés par Miadi N et al., 2003 lors de son étude sur 860 femmes tunisiennes enceintes dans son mémoire de DEA : "L'allo-immunisation anti-HPA chez les femmes enceintes tunisiennes : étude prospective", l'allo-immunisation réelle chez la population tunisienne est relativement élevée (0,34 %). Par contre, nos résultats ont donné les valeurs théoriques des fréquences des descendants à risque allo-immuns en (%) suivantes : 14,5 pour HPA-1, 16 pour HPA-2, 20,7 pour HPA-3, 10,9 pour HPA-5.

Nous remarquons que nos résultats théoriques pour l'allo-immunisation chez l'échantillon étudiés de la population tunisienne sont trop supérieurs à ceux trouvés par Miadi. N et al, une telle différence serait due à ce que l'allo-immunisation dépend de plusieurs autres facteurs.

D'ailleurs, le taux d'immunisation varie selon l'antigène considéré et dépend, en partie, de la fréquence relative des antigènes dans la population, de leur immunogénicité (l'immunogénicité de la protéine est liée à un polymorphisme naturel de la GP ou à la structure particulière de la molécule), de leur distribution cellulaire et tissulaire.

L'immunogénicité est déterminée, en partie, par quatre propriétés de l'immunogène : son caractère étranger (le degré de l'immunogénicité d'un antigène dépend du degré de son caractère étranger), sa taille moléculaire, sa capacité à être apprêté et associé à une molécule du CMH à la surface d'une cellule présentatrice de l'antigène ou d'une cellule du Soi altérée et enfin sa composition et sa complexité chimique. D'ailleurs, chaque protéine est caractérisée par ses propriétés physiques. Lorsqu'un des aa qui forme une protéine est remplacé par un autre, ce remplacement influe sur les propriétés physiques de cette dernière. Cinq aa (l'acide glutamique, l'acide aspartique, l'arginine, la lysine et l'histidine) présentent des chaînes latérales ionisables qui donnent à la protéine une charge nette caractéristique, dépendant du pH du milieu environnant. Des substitutions d'aa peuvent remplacer directement l'un de ces aa chargés, ou bien une substitution neutre près de l'un de ceux-ci peut affecter le degré d'ionisation de l'aa chargé, ou encore, une substitution au niveau de la jonction de deux hélices á peut entraîner une légère modification de la configuration tridimensionnelle du polypeptide replié. Dans tous ces cas, la charge nette du polypeptide sera modifiée car la charge nette d'une protéine n'est pas simplement la somme de toutes les charges individuelles de ses aa, mais elle dépend également de leur exposition au milieu liquide qui les entoure.

Quel que soit le système considéré, l'absence d'un antigène chez la mère ne signifie pas nécessairement qu'elle développera un anticorps lors d'une ou de plusieurs grossesses incompatibles.

Ainsi le développement de NAIT dépend également du type de HLA de la mère; néanmoins, le nombre de grossesses dans lesquelles le foetus est en danger pour la NAITP.

Il sera donc important de suivre l'allo-immunisation anti-HPA pour tous les systèmes, et si nécessaire, de rechercher une éventuelle implication des antigènes HLA. La capacité d'établir une immunisation foeto-maternelle est associée au phénotype HLA-II de la mère.

L'allo-antigène plaquettaire le plus immunogène dans la thrombocytopénie est la forme leucine 33 de la GPIIIa (Giffin. H. N et Ouwehand. W. H., 1995). L'allèle HPA-1a (Pl^A1) est responsable de la plupart des cas de purpura post transfusionnel et de thrombocytopénie néo-natale allo immune dans la population caucasienne (Okamoto. N et al., 1998).

Le polymorphisme Pl^A1/Pl^A2 pourrait être en déséquilibre de liaison avec beaucoup d'autres polymorphismes (Marian et al., 1996). Une corrélation entre l'allo-immunisation anti HPA-1a et l'haplotype HLA-B₈, DR₃(HLA-DRB3*0101) (Williamson. L. M et al., 1998) est fréquemment observée. L'allo-immunisation HPA-1a est fortement associée au génotype de type maternel HLA de classe II DRB3*0101 (phénotype DRW52a) (Décary. S. F et al., 1991) et/ou DQB1*0201 (Décary et al., 1991; L'Abbé. D et al., 1992; Cohen et al., 1995; Homans. A. 1996; Chantrain. C et al., 2000 ; Murphy et al., 2002; Koutsogianni. P. 2004). Pour les personnes de génotypes Leu33 négatifs (Pro33 homozygote), HLA DRB3*0101-positifs, l'exposition du forme Leu33 est très immunogène (Watkins. N. A et al., 2002). Les phénotypes HLA DRw6 est associés à l'allo-immunisation des antigènes HPA-5b (Bra) (Muller-Eckhard. C et al., 1989a). L'allo-immunisation maternelle contre l'antigène HPA-6b (GPIIIa-GIn489) peut être associé au différent haplotype CMH de classe II, c.-à-d. HLA-DRB1*1501, DQA1*0102, DQAB1*0602 (Westman. P et al., 1997).

Ces antigènes sont considérés comme marqueurs d'un haut risque d'allo-immunisation plaquettaire dans notre population, et c'est pour cette raison qu'on est appelé alors à y faire attention dans le cas de grossesse ou de transfusion du sang et des transplantations d'organes et de MO. Ces données sont d'importance majeure et elles ne doivent pas être négligées lors des cas des la NAIT, le PTP, en cas de greffe d'organes et essentiellement dans les traitements des différents cas des maladies associées aux implications cliniques résultant de l'incompatibilité plaquettaire telles que l'hémorragie cérébrale et l'hémiplégie des génotypes HPAs (a/b) qui présentent une allo-immunisation. C'est pourquoi Flug et al., (1994) ont proposé que toutes les femmes en grossesse soient testées pour leur système HPA-1 car les femmes HPA-1b homozygotes ont un risque très significatif pour la NAIT et le PTP (Okamoto. N et al., 1998).

De plus, ces résultats permettent la comparaison entre les sous populations aussi bien qu'entre les populations.

Une variable fondamentale en génétique des populations est la fréquence à laquelle les allèles sont présents au niveau du locus donné. La fréquence d'un allèle donné dans une population peut être modifiée par mutation (le taux de la mutation est défini comme la probabilité qu'une copie d'un allèle change de forme allélique en une génération. Supposons que la totalité d'une population soit homozygote pour a et que les mutations transformant cet allèle en b se produisent à un taux de 1/100 000), la sélection et la migration des gènes. Il est ainsi pour les systèmes HPAs. D'ailleurs, les fréquences des systèmes HPAs varient chez les différentes populations. Et chaque population est caractérisée par ses fréquences géniques. Ainsi, chaque apport extérieur d'un allèle a ou b a la chance de perturber la constitution génétique de la population.

Les êtres humains ne s'unissent pas au hasard puisque les groupes ethniques et les populations diffèrent les uns des autres par les fréquences génétiques et présentent des taux élevés d'endogamie, non seulement au sein des principales populations mais aussi dans les ethnies locales. Les Danois et les Italiens différent par la fréquence de leurs groupes plaquettaires. Les Italiens épousent des Italiennes et les Danois, des Danoises, de sorte que les unions ne se réalisent plus au hasard, même si ce n'est pas intentionnellement, en ce qui concerne les systèmes plaquettaires ainsi que d'autre antigènes tels que les groupes sanguins ABO.

Tableau XVIII : Fréquences des allèles HPA-1 à 5 dans quelques populations africaines

Systèmes/Population	HPA-1a	HPA-2a	HPA-3a	HPA-4a	HPA-5a
Tunisie (présente étude)	0,824	0,800	0,707	1	0,875
Tunisie	0,73	0,680	0,765	0,885	0,665
Algérie	0,827				0,837
Maroc	0,748	0,818	0,682	1	0,861
Berbères (Maroc)	0,747	0,817	0,682	1	0,8616
Bénin	0,896	0,708	0,679	1	0,818
Cameroun	0,907	0,763	0,614	1	0,746
Rép. Centrafricaine	1,000	0,607	0,500	1	0,595
Congo	0,904	0,776	0,596	1	0,732

On note, d'après le tableau XVIII, que les fréquences alléliques des systèmes HPA-1 les plus proches de celle de la tunisie sont respectivement : l'Algérie suivie du Bénin. Pour le système HPA-2 on note que la fréquence allélique est voisine à celles du Maroc, les berbères Marocains, puis du Congo et du Cameroun. Pour le systéme HPA-4, la Tunisie possède des fréquences alléliques HPA-4a qui varient de (1 à 0,885) et par conséquent, l'allèle HPA-4b varie de (0 à 0,115) (Saadi H et al., 2006; présente étude). On remarque, d'après ces résultats, que la Tunisie présente les fréquences des allèles HPA-4b les plus élevées (0,115) comparée à celles obtenues avec les autres études. Ceci peut être attribué aux techniques utilisées dans cette étude (Saadi H et al., 2006). Pour les systèmes HPA-3 et HPA-5 les fréquences alléliques sont très proches de celles observées chez les berbères Marocains et les Marocains. Cela s'explique par le fait qu'une partie de notre population est d'origine berbère et aussi par l'immigration d'un certain nombre d'algériens et de marocains à notre pays. Pourtant, on a remarqué une certaine différence avec les fréquences alléliques rapportées dans les pays africains subsahariens. Les pays subsahariens présentent des valeurs élevèes pour le HPA-1a, en comparaison avec ceux du nord du continent. Il existe toujours un échange génique plus ou moins important entre populations voisines.

Tableau XIX Fréquences alléliques HPA-1 à 5 dans quelques pays européens.

Population	HPA-1a	HPA-2a	HPA-3a	HPA-4a	HPA-5a
Tunisie (présente étude)	0,824	0,800	0,707	1,000	0,875
Croatie	0,830	0,880	0,640		0,890
Autriche	0,852	0,918	0,612	1,000	0,892
République du czech	0,830	0,900	0,590		0,930
Danemark	0,830	0,920	0,630	1,000	0,920
France	0,848	0,920	0,620	0,992	0,874
Grèce	0,670	0,750	0,405		0,850
Irlande	0,882	0,934	0,624	1,000	0,912
Italie	0,850	0,890	0,610	1,000	0,900
Luxembourg	0,869	0,933	0,616		0,902
Pologne	0,824	0,901	0,582	1,000	0,944
Macédonie	0,865	0,852	0,578		0,909
Slovénie	0,832	0,899	0,667		0,892
Espagne	0,810	0,900	0,650	1,000	0,880
Suisse	0,809	0,918	0,591	0,997	0,934
Le Pays de Gales	0,825	0,902	0,607	1,000	0,903
Caucasiens	0,810	0,915	0,520	1,000	0,905
Danemark	0,831	0,917	0,626	1,000	0,922
Pays Bas	0,846	0,934	0,555	1,000	0,902
Finlande	0,860	0,910	0,590		0,950
Allemagne	0,846	0,934	0,555	1,000	0,902

D'après la comparaison des frèquences des differents systèmes etudiés faite à l'aide du logiciel SAS, on remarque que les valeurs rapportées chez l'Espagne et la Suisse sont les plus proches de celles observées chez notre population. Cela peut etre demontré par les relations historiques trés anciennes qui ont relié la Tunisie et l'Espagne.

Tableau XX Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 dans quelques populations asiatiques :

Population	HPA-1a	HPA-2a	HPA-3a	HPA-4a	HPA-5a
Tunisie (présente étude)	0.824	0.800	0.707	1.000	0.875
Vietnam	0.986	0.953	0.486	1.000	0.972
Arabie Saoudite	0.8	0.805	0.88	0.97	0.845
Taiwan	0.9983	0.961	0.595	0.9983	0.9814
Thaïlande	0.985	0.938	0.507	1.000	0.963
Philippines	0.98	0.975	0.53	0.995	0.965
Corée	0.988	0.923	0.555	0.990	0.978
Chine	0.995	0.975	0.525	1.000	0.965
Indonésie	0.991	0.939	0.505	1.000	0.995
Japon	0.99	0.91	0.715	1.000	0.98
Taiwan	0.9967	0.96	0.575	0.9983	0.985

D'après la comparaison des frèquences des differents systèmes etudiés faite à l'aide du logiciel SAS, on note que, de tous les pays asiatiques, l'Arabie Saoudite présente les fréquences les plus proches de celles rapportés chez la population Tunisienne. Cela s'explique par l'appartenance des deux populations frères au cadre de communauté arabo-musulmane l'origine arabe de la plus part des tunisiens.

Tableau XXI Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 dans quelques pays américains.

Population	HPA-1a	HPA-2a	HPA-3a	HPA-4a	HPA-5a
Tunisie (présente étude)	0,824	0,800	0,707	1,000	0,875
Polynésie française	0,975	0,913	0,599	1,000	0,975
Américains (Noirs)	0,920	0,820	0,630	1,000	0,790
Américains	0,890	0,920	0,670	1,000	0,890
Amérindiens	1,000	0,957

Après comparaison des fréquences alléliques des systèmes étudiés, on signale que les fréquences du système HPA-2 chez la population tunisienne sont très proches de celles observées chez les Américains Noirs.

Tableau XXII: Fréquences alléliques des HPA-1 à 5 chez quelques pays de l'Océanie.

On remarque que les fréquences alléliques du système HPA-1 rapportées chez la population Australienne sont proches de celles de la population Tunisienne.

On a remarqué d'après les comparaisons des fréquences alléliques des systèmes HPAs entre les différentes populations que quelques populations vivant dans les mêmes régions ont des fréquences très proches pour quelques systèmes. De même, d'autres populations appartenant à des régions tout à fait distinctes pourraient aussi avoir des fréquences proches. Par exemple, on s'aperçoit que pour le système HPA-2 les fréquences observées chez la population tunisienne sont très proches de celles rapportées chez les Américains Noirs malgré la distance qui sépare la Tunisie de l'Amérique et l'absence de forte relations historiques directes entre ces deux pays.

Il nous été montré que, pour les populations africaines, les fréquences alléliques du Cameroun sont les plus proches de celles trouvées chez la population tunisienne. C'est le cas de l'Arabie Saoudite pour les populations asiatiques et de l'Espagne pour les populations européennes.

Bien que les polymorphismes du gène de quelques marqueurs génétiques tel que le polymorphisme du gène de l'inhibiteur l'acétylcholinestérase, (Wiwanitkit. V. 2003; Wiwanitkit. V. 2005), parmi les populations dans les mêmes régions a été démontré, nous n'avons pas trouvé cette observation dans le polymorphisme des gènes HPAs. Décisivement, c'est tout à fait difficile d'utiliser les gènes HPAs comme marqueurs génétiques pour déterminer la ressemblance entre les différentes populations. Bien qu'il y ait une légère variation entre les populations, ce n'est pas une différence discrète.

Ces études du polymorphisme plaquettaire parmi les différentes populations fourniraient de nouvelles données pour l'hématologie géographique, ces études qui si loin ont été basées sur les polymorphies érythrocytaires, leucocytaires et du sérum.

Cette étude nous a permis de montrer que la population tunisienne est à l'état d'équilibre panmictique pour les locis des systèmes étudiés selon la loi de H-W.

Les données présentes indiquent que la population tunisienne se caractérise par un haut taux de mélange ethnique, ce qui montre que notre population fait face à un haut risque d'allo-immunisation anti-plaquettaire pour les systèmes : HPA-1, HPA-2, HPA-3 et HPA-5.

L'étude du polymorphisme allélique des HPAs s'est avérée importante pour les études génétiques, biologiques et anthropologiques. D'ailleurs, elle permet la déduction du flux des gènes et la constitution génétique de la population, mais surtout la prédiction du risque d'allo-immunisation anti-plaquettaire. Elle aidera à anticiper la dimension et les causes de la NAIT dans notre communauté par la définition des allo-antigènes les plus probables qui soient impliqués dans ce phénomène.

Ce travail nous a permis de montrer la nécessité de vulgariser le génotypage des antigènes plaquettaires afin de réduire la survenue de l'allo-immunisation transfusionnelle ou foeto-maternelle d'origine plaquettaire. D'ailleurs, pour une population donnée, la connaissance des fréquences alléliques nous fournit des informations précises concernant les conditions cliniques spécifiques telles que la NAIT et le PTP, sur les capacités du diagnostic de la NAIT, la prévention de l'hémorragie intracrânienne des foetus et nous procure plus d'informations pour des traitements exacts des transfusions plaquettaires incompatibles. Ainsi la caractérisation du système plaquettaire à l'origine de l'incompatibilité foetomaternelle est susceptible d'améliorer la connaissance de la distribution géographique de cette affection et sa prise en charge.

Ainsi, les pédiatres, les biologistes et les spécialistes en santé publique, les obstétriciens et les personnels de la médecine transfusionnelle sont appelés à exploiter ces résultats dans leurs laboratoires et services pour le diagnostic définitif des cas de NAIT et PTP et leur traitement pendant la période néo-natale. D'ailleurs, l'agrément reçu pour la réalisation de tests de diagnostic prénatal dans le domaine des thrombopénies et thrombopathies lui permet de participer directement à la prise en charge de grossesses à haut risque.

Au cours de ce stage, j'ai pu faire un pas de plus en direction du monde de la recherche en m'immergeant dans la vie d'un laboratoire, en observant son fonctionnement, ses difficultés et ses bons moments. Cette expérience me fut très enrichissante et a confirmé mon goût pour la recherche scientifique.

Durant ce stage, je n'ai fait que commencer le travail que je devrais continuer par la suite. Car je me propose de poursuivre et d'approfondir cette étude en :

- Elargissant la taille de population et en introduisant d'autres sous populations comme les berbères, les noirs et les juifs. Ainsi, l'échantillon devient représentatif et les résultats qui seront obtenus seront proches de la réalité. Cela nous permettra d'évaluer plus précisément la signification clinique des systèmes HPA en Tunisie.

- Introduisant des malades incluant les cas de (NAIT), de PTP et de PTR pour dégager le ou les systèmes les plus impliqués dans ces réactions immunologiques.

- L'étude de la distribution des fréquences des HPAs et leurs associations avec NAIT, PTP et les autres désordres.

- La recherche des valeurs réelles du risque d'alloimmunisation chez notre population on introduisant les autres facteurs qui intervient dans les phénomènes d'alloimmunisation.

- Etudiant l'association des antigènes HPAs et les antigènes HLA pour déduire l'implication de ces deux systèmes dans les réactions alloimmunes tel que l'association entre l'alloimmunisation anti HPAs et l'haplotype DRB13*.

- Etudiant les fréquences alléliques des différents gènes des systèmes HPA qui restent et donc de définir l'haplotype des systèmes plaquettaires en Tunisie par la mise en oeuvre d'autres techniques telle que la PCR en temps réel.

- La recherche de nouveaux antigènes plaquettaires à travers l'étude de l'ADN des nouveaux nés et des patients qui montrent des réactions alloimmunes post transfusionnelles par le séquençage et par la comparaison de l'ADN étudié avec les séquences d'ADN fournies par les banques de donnés disponibles.

- L'étude de la toute nouvelle mutation découverte par Santoso en 2006 Leu33Val de l'intégrine â3 chez la population tunisienne qui peut être impliquée dans les cas de NAITP.

- Entrer en coopération avec d'autres groupes de spécialistes tunisiens et étrangers/d'origines différentes en la matière non seulement à l'échelle régionale mais aussi nationale et internationale car cela est indispensable à la progression des connaissances et des techniques dans les domaines d'immunologie plaquettaire, de biologie moléculaire et d'immuno-pathologie plaquettaire au cours de la grossesse et de son retentissement foetal, qui évoluent sans cesse.

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Polymorphisme des antigenes plaquettaires humains dans la population tunisienne

IV. ANALYSES STATISTIQUES