Memoire Online - Diversité des begomovirus infectant le gombo au Togo

UNIVERSITE Joseph KI-ZERBO			Centre National de la Recherche Scientifique et N° d'ordreMaster IA Technologique (CNRST)

Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre (UFR-SVT) Département de Biochimie-Microbiologie Laboratoire de Biotechnologie et d'Immunologie Appliquée (LaBIA)			Institut de l'Environnement et de Recherches N° d'ordre...... Agricoles (INERA)
			Centre de Recherches Environnementales, Agricoles et de Formation de Kamboinsé 'ordre... (CREAF/K)
			Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV)

Soutenu publiquement le 24/10/2019 à l'Université Joseph KI-ZERBO devant le jury ainsi composé :

Président : Pr Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université Joseph KI-ZERBO, Burkina Faso Membres : Pr Aly SAVADOGO, Professeur Titulaire, Université Joseph KI-ZERBO, Burkina Faso

Dr Cheikna ZONGO, Maitre de Conférences, Université Joseph KI-ZERBO, Burkina Faso, Directeur de mémoire

Dr Fidèle TIENDREBEOGO, Chargé de Recherche, INERA/CNRST, Ouagadougou, Burkina Faso, Co-Directeur de mémoire

À mon père AKAKPO Mamah et à ma mère ABDOU Zouréhatou : merci pour votre amour, soutien, encouragement, patience et bénédictions durant toutes mes années d'études. Permettez-moi de vous témoigner ma profonde gratitude à travers ce modeste travail. Puisse Dieu vous garde en bonne santé aussi longtemps auprès de nous afin que vous puissiez bénéficier de vos multiples sacrifices.

À ma compagne ADEKPLOVI Akouvi Rosalie : merci pour ton amour, tes encouragements, ta patience et ta compréhension tout au long de ces années studieuses.

À mes soeurs adorées : AKAKPO Améyédé et AKAKPO Tinnon, merci infiniment de vos soutiens. Je vous souhaite une vie pleine de bonheur et de réussite.

À mes adorables frères : AKAKPO Médjidon et AKAKPO Tinin, AYENA-KASSEGNE Yaovi, que Dieu vous bénisse et comble votre vie de bonheur et de réussite.

À mon oncle SABI Onyankitan : merci de votre soutien moral et financier tout au long de mes études.

Les travaux présentés dans ce mémoire ont été effectués à l'Institut de l'Environnement et de Recherches Agricoles (INERA), au Centre de Recherches Environnementales, Agricoles et de Formation de Kamboinsé (CREAF/K), plus précisément au Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV). Plusieurs personnes ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce mémoire et nous avons de la reconnaissance pour tous. Qu'il nous soit permis de remercier :

Le corps enseignant de l'UFR-SVT, Département Biochimie Microbiologie de l'Université Joseph KI-ZERBO pour l'enseignement de qualité comme facteur incontournable d'un développement durable ;

Pr Yves TRAORE, Professeur Titulaire, Directeur du Laboratoire de Biotechnologie et d'Immunologie Appliquée (LaBIA) pour nous avoir accueilli dans son Laboratoire et nous avoir offert l'opportunité de faire nos premiers pas dans la recherche scientifique ;

Dr Cheikna ZONGO, Maitre de Conférences, Directeur de ce mémoire, pour avoir cru en nous et accepté encadrer nos travaux de mémoire malgré ses multiples occupations. Il était toujours là pour répondre à nos nombreuses sollicitations. Son apport sans mesure dans cette étude, ses suggestions et remarques pertinentes, sa simplicité lors de nos échanges ont donné au travail toute sa valeur scientifique, nous avons beaucoup appris à ses côtés, merci pour tout ;

Dr Fidèle TIENDREBEOGO, Chargé de recherche, Co-Directeur de ce mémoire pour nous avoir donné l'occasion de réaliser ce travail fascinant et stimulant. Nous lui sommes reconnaissant pour la qualité de son encadrement, sa disponibilité pour répondre à nos préoccupations, son soutien lors des moments difficiles, ses apports techniques et critiques, son sens élevé de la rigueur, son goût du travail bien fait et surtout pour l'attention particulière portée à mon stage. Merci pour toutes les choses qu'il nous a faites et que nous ne pourrons pas citer ici, mais qui resteront à jamais gravées dans notre mémoire ;

Dr Kossikouma Djodji ADJATA, Maitre de Conférences, Université de Lomé, pour son soutien lors de la prospection et collecte des échantillons, sa collaboration et sa participation à la réalisation de notre travail ;

Pr Nicolas BARRO Professeur Titulaire, pour nous avoir fait l'honneur de présider ce jury ; qu'il trouve ici l'expression de notre profonde reconnaissance, nos remerciements sincères et l'assurance de notre profond respect ;

Pr Aly SAVADOGO, Professeur Titulaire, pour avoir accepté de juger ce travail et pour l'accompagnement financier qu'il nous a accordé lors du voyage pour la prospection et la collecte des échantillons. Qu'il trouve ici, l'expression de nos sincères reconnaissances.

Dr James Bouma NEYA, Maître de recherche, Directeur du Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV) et du Laboratoire Mixte International (LMI Patho-Bios), pour nous avoir accepté au sein de son laboratoire (LVBV) pour nos travaux ;

Dr Drissa SEREME, Maître de recherche et co-Directeur du Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV) pour nous avoir accepté au sein dudit laboratoire ;

Pr Kofi KOBA, Professeur Titulaire, Université de Lomé, pour ses conseils et son soutien multiforme lors de la prospection et collecte des échantillons au Togo. Grâce à son appui, nous avons pu obtenir des données relatives à la production globale du gombo au Togo auprès de la Direction des Statistiques Agricoles, de l'Information et de la Documentation (DSID). Qu'il trouve ici l'expression de notre profonde reconnaissance, nos remerciements sincères et l'assurance de notre profond respect.

M. Ézéchiel TIBIRI, doctorant du Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV) et du Laboratoire Mixte International (LMI Patho-Bios), pour son assistance technique au laboratoire, et les analyses bioinformatiques de nos séquences. Nous avons beaucoup appris de lui ; qu'il trouve ici l'expression de notre profonde gratitude ;

Mlle Monique SORO, Ingénieure de recherche, doctorante du Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV) et du Laboratoire Mixte International (LMI Patho-Bios) pour son assistance technique lors de nos travaux. Nous lui sommes vraiment reconnaissants pour sa disponibilité, sa détermination et ses apports techniques. Nous lui souhaitons une bonne santé et du courage pour la suite de ses travaux ;

Messieurs, OUATTARA Bakary, SAWADOGO Moumini, KABORE Emmanuel, DAKUO Thierry, BOUNIOUNOU Damis Yves Patrik, M^lle DRABO Salimata, M^lleFadila TINTAet Mme ZONGO PawindéÉlisabeth, pour leur précieux conseils, assistance, bonne humeur, amitié, et ces moments animés de fraternité tout au long de mon stage ; nous avons vraiment apprécié votre compagnie ;

Mlle Wendpanga TAPSOBA, Technicienne au Laboratoire de Virologie et de Biotechnologies Végétales (LVBV) et au Laboratoire Mixte International (LMI Patho-Bios), pour son assistance technique tout au long de notre stage ;

M. Salissou ATAMAO, Ingénieur Agronome, pour sa participation active à la collecte des échantillons dans la zone littorale et pour ses vas et viens à Lomé lors des formalités liées à la demande de données statistiques auprès de la Direction des Statistiques Agricoles, de l'Information et de la Documentation (DSID), merci pour tout ;

Tous les producteurs de gombo de la zone d'étude qui nous ont accueillis et qui ont contribué à la réalisation de cette étude. Nous voulons leur dire que sans eux ce travail aurait été impossible ;

Nos Camarades étudiants, SETOR A. Marius pour ses soutiens multiformes, SOME G. Fabrice, délégué de notre promotion, pour son courage et sa détermination, KERE Inès, DIANDA Ida Georgette et SIMPORE Mamouna avec qui nous avons partagé bien de meilleurs souvenirs mêmes si nous avions connu des hauts et des bas par moment. Nous leur formulons tous et toutes nos voeux de réussite dans leur vie future.

Nous ne saurons terminer ces propos sans dire merci à tous nos autres promotionnaires des Masters du Département Biochimie-Microbiologie et particulièrement nos collègues du Master Biotechnologie Microbienne et Cellulaire (BMC) avec qui nous avons partagé la vie estudiantine. Qu'ils trouvent ici l'expression de notre profonde reconnaissance.

Que toutes personnes qui de prêt ou de loin ont contribué à la réussite de ce travail trouve ici l'expression de nos sincères remerciements.

3.1. Amplification du gène de la protéine capsidiale par la PCR 37

Tableau II : Composition biochimique des fruits et des feuilles de gombo pour 100 g de partie

Tableau IV : Répartition des échantillons collectés suivant les zones agroécologiques et les

Tableau VIII: Prévalences de la maladie dans les quatre zones agroécologiques 37

Tableau IX: Récapitulatif des résultats PCR par zone agro-écologique et par localité 38

Figure 2 : Illustration des différentes parties de la plante du gombo (Abelmoschus esculentus

(L.) Moench): feuilles (a), fleurs (b), fruits (c), et graines (d) 5
Figure 3: Principaux insectes ravageurs observés sur le gombo. (A) Altise (Podagrica decolorata); (B) Mouche blanche (Bemisia tabaci Genn.); (C) Jasside (Jacobiasca sp); (D)

Puceron (Aphis gossypii); (E) Dysdercus sp ; (F) Syllepte derogata ; (G) Anomis flava 13
Figure 4 : (a) Reconstruction tridimensionnelle d'une particule géminivirale. L'échelle représente 10 nm (Zhang et al., 2001). (b) Particules géminivirales vues au microscope électronique montrant leur forme icosaédrique associée en doublets. L'échelle représente 50

nm. 14
Figure 5: Représentation de l'organisation génomique des Begomovirus (monopartites et bipartites). LIR (Long Intergenic Region); SIR (Short Intergenic Region); CR (Common

Region). 16
Figure6: Représentation des ADN â satellites et á satellites codant respectivement pour les protéines ßC1 et Rep, et des molécules défectives sans ORFs. A-rich (Adenine-rich region);

CR (Common Region); IR (Intergenic Region); SCR (Satellite Conserved Region) 18
Figure 7: Schématisation des modèles de réplication en cercle roulant (RCR) et de la

Figure 9: Symptôme (a) de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo (Okra leaf curl disease, OLCD) observé au Burkina Faso, (b) de la maladie du jaunissement des nervures du piment (Pepper yellow vein disease, PYVD) et (c) de la maladie de l'enroulement (et du jaunissement) foliaire de la tomate (Tomato yellow leaf curl disease, ToLCD-TYLCD)

Figure 10: Carte de la zone d'étude montrant les douze (12) localités prospectées 27

Figure 11: (A) broyeur à bille (Tissuelyser II) utilisé pour le broyage des échantillons ; (B)

Figure 12: Thermocycleur 2720 (Applied Bioystems) utilisé pour l'amplification 32

Figure14: (B) et (D) plants de gombo avec des feuilles déformées; (C) enroulement des feuilles de gombo sur elles même; (A) et (F) feuilles de gombo en formes de cuillères; (E)

feuilles de gombo présentant des jaunissements. 36
Figure 15 : Electrophorèse des produits d'amplification des Betasatellites sur gel d'agarose à 1%. 100 paires de bases = marqueur de taille DNA ladder. 36 ; 37 ; 39 ; 40 ; 41 ; 54 sont

positifs. 41
Figure16: (A) : Arbre phylogénique généré à partir des séquences de CP des CLCuGeV,

Annexe 2:Procédure de préparation du gel et de la migration électrophorétique des ADN

Liste des acronymes viraux selon le Comité International de Taxonomie des Virus (ICTV)

OLCCMV: Okra leaf curl Cameroon virus OLCuMLA: Okra leaf curl Mali alphasatellite OLCuMLB : Okra leaf curl Mali betasatellite

ToLCBFV : Tomato leaf curl Burkina Faso virus ToLCTGB : Tomato leaf curl Togo betasatellite

ICTV International commitee on taxonomy of viruses (Comité international de

UFR/SVT Unité de formation et de recherche/sciences de la vie et de la terre

qsp20 Quantité suffisante d'eau pour compléter un volume de réaction à 20 ìl

Résumé, Abstract

Résumé

La culture du gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench, Malvaceae) offre des produits contribuant à l'équilibre alimentaire, et à la génération de revenus pour de nombreux producteurs de beaucoup de pays de l'Afrique de l'Ouest et particulièrement ceux du Togo. Depuis plusieurs années, la maladie de l'enroulement foliaire du gombo (Okra leaf curl disease, OLCD) constitue l'une des maladies les plus dommageables dans plusieurs pays de l'Afrique de l'Ouest. Elle est occasionnée par des virus du genre Begomovirus (famille des Geminiviridae) et transmise par la mouche blanche (Bemisia tabaci Genn.) qui constitue le principal vecteur. En vue de connaître l'identité moléculaire et la diversité des Begomovirus responsables de cette maladie sur le gombo au Togo, des travaux de caractérisation moléculaire ont été effectués sur 118 échantillons de jeunes feuilles de gombo (symptomatiques et asymptomatiques) collectés dans les quatre zones agroécologiques du pays (zone littorale, zone forestière, savane humide et la savane sèche). Les ADNs totaux ont été extraits selon le protocole Doyle et Doyle modifié pour l'extraction d'ADN au Cétyl Trimétyl Ammonium Bromide (CTAB) et le diagnostic moléculaire a été réalisé par PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant un couple d'amorces dégénérées (VD360/CD1266). Un total de 12 échantillons de produits PCR a été séquencé et des analyses bioinformatiques ont été réalisées. Il ressort de ces analyses que les isolats du Togo appartiennent à deux espèces : le Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) avec une similitude de 88,71 à 96,56% avec CLCuGeV-Burkina Faso (FN554528), CLCuGeV-Niger (FJ469627) et le Okra yellow crinkle virus (OYCrV) avec une similitude de 86,52% à 97,70% avec les OYCrV de la Côte d'Ivoire (KX100572), du Mali (EU024118) et du Cameroun (FM164724). Cette étude a permis d'identifier les espèces de Begomovirus infectant le gombo au Togo. Ces virus constituent un véritable problème non seulement pour la production du gombo, mais aussi celle du coton (Gossypium sp. L.) au Togo tout comme dans les autres pays producteurs de l'Afrique de l'Ouest. Au regard des impacts socio-économiques négatifs que ces virus pourraient causer, la mise en oeuvre des stratégies de lutte efficaces s'avère nécessaire.

Résumé, Abstract

Abstract

The cultivation of okra (Abelmoschus esculentus (L.) Moench, Malvaceae) offers products that contribute to a balanced diet and income generation for many producers in many West African countries, particularly those from Togo. For many years, Okra Leaf Curl Disease (OLCD) has been one of the most damaging diseases in several West African countries. It is caused by viruses of the genus Begomovirus (Geminiviridae family) and transmitted by the whitefly (Bemisia tabaci Genn.) which is the main vector. In order to determine the molecular identity and the diversity of Begomoviruses responsible for this disease on okra in Togo, molecular characterization works were carried out on 118 samples of young okra leaves (symptomatic and asymptomatic) collected from the four agro-ecological zones of the country (littoral zone, forest zone, wet savannah and dry savannah). Total DNAs were extracted according to the modified Doyle and Doyle protocol for DNA extraction with Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) and the molecular diagnosis was carried out by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a pair of degenerate primers (VD360/CD1266). A total of 12 samples of PCR products were sequenced and bioinformatic analyzes were performed. These analyzes indicate that the isolates from Togo belong to two species: the Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) with a similarity of 88.71 to 96.56% with CLCuGeV-Burkina Faso (FN554528), CLCuGeV -Niger (FJ469627) ) and Okra yellow crinkle virus (OYCrV) with a similarity of 86.52% to 97.70% with OYCrV from Côte d'Ivoire (KX100572), Mali (EU024118) and Cameroon (FM164724). This study identified Begomovirus species infecting okra in Togo. These viruses are a real problem not only for of okra and cotton (Gossypium sp L.) production in Togo as in other West African producing countries. In view of the negative socio-economic impacts that these viruses could cause, the implementation of effective control strategies is necessary.

INTRODUCTION

Introduction

Le gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) est un légume cultivé dans la plupart des pays des régions tropicales, subtropicales et méditerranéennes d'Afrique, d'Inde et d'Amérique. Il appartient au genre Abelmoschus et à la famille des Malvaceae (Spichiger et al., 2000). Le genre Abelmoschus se répartit en 7 espèces dont A. angulosus, A. callei, A. crinitus, A. esculentus, A. ficulneus, A. manihot et A. moschatus (Hamon et Charrier, 1997). Parmi ces espèces de gombo, 4 sont cultivées (A. callei, A. esculentus, A. manihot et A. moschatus) et les 3 autres (A. angulosus, A. crinitus et A. ficulneus) sont strictement spontanées (Borssum-Waalkes, 1966). C'est une plante exceptionnelle et originale, car toutes ses parties (racines, tiges, feuilles, fruits, graines) sont valorisées sur les plans alimentaire, médicinal, artisanal et même industriel (Marius et al., 1997). Les jeunes fruits et feuilles du gombo sont couramment utilisés comme condiment ou liant dans les sauces (Hamon et Charrier, 1997). Sur le plan nutritionnel, le gombo est riche en calcium, fer, protéines, glucides, lipides, vitamines A, C et en magnésium (Charrier, 1983 ; Siemonsma et Hamon, 2004 ; Doumbia, 2010) qui sont des compléments alimentaires utiles pour des repas à base de céréales.

En Afrique et particulièrement au Togo, le gombo est hautement prisé et est le plus souvent utilisé comme condiment ou liant dans les sauces (Hamon et Charrier, 1997). Il procure également des revenus très importants aux producteurs en général les femmes en améliorant leurs conditions de vie. Ainsi, le gombo pourrait jouer un rôle essentiel dans les programmes d'amélioration de l'alimentation des populations ainsi que dans les programmes de lutte contre la pauvreté.

Cependant, la production de cette spéculation fait face à d'énormes contraintes entrainant des pertes considérables de rendement dans les pays tropicaux en général et particulièrement au Togo. Parmi ces contraintes, figure en bonne place la maladie de l'enroulement foliaire du gombo encore appelée Okra leaf curl disease (OLCD). Elle est causée par des virus appartenant au genre Begomovirus (famille des Geminiviridae) qui sont transmis par la mouche blanche (Bemisia tabaci Genn.). La maladie induit chez des plants de gombo infectés des symptômes très caractéristiques qui vont d'une déformation des feuilles en forme de cuillère à un enroulement des feuilles sur elles-mêmes (vers le bas ou vers le haut).

Face à cette situation, d'innombrables travaux de caractérisation moléculaire ont été effectués en Afrique dans le but d'identifier les espèces virales responsables de cette maladie. C'est ainsi que la maladie de l'enroulement foliaire du gombo a été décrite dans de

Introduction

nombreux pays d'Afrique sahélienne et ses environs, notamment au Burkina Faso (Barro et al., 1994), au Cameroun (Leke et al., 2013), en Côte d'Ivoire (N'Guessan et al., 1992), au Ghana (Swanson et Harrison, 1993), au Mali (Kon et al., 2009), au Niger (Shih et al., 2009), au Nigéria et au Tchad (Swanson et Harrison, 1993) et en Égypte (Bigarré et al., 2001). Mais, force est de constater qu'au Togo, la littérature demeure déficitaire, voire quasi inexistante en informations nécessaires à un contrôle satisfaisant de ces virus. Pourtant, des symptômes de repliements foliaires retardant la croissance et affectant l'appareil végétatif des plants de gombo ont été observés sur toute l'étendue du territoire. Au regard de la situation actuelle du Togo face à cette pathologie dévastatrice, on se pose des questions sur la situation réelle de cette maladie à Begomovirus au Togo : (i) quelle est l'identité moléculaire des Begomovirus qui infectent le gombo au Togo ? (ii) Quels liens existent entre les caractéristiques moléculaires des Begomovirus du Togo et ceux d'Afrique ? D'où l'initiation de cette étude dont l'objectif général est d'évaluer la diversité des Begomovirus infectant le gombo au Togo. Plus spécifiquement cette étude vise à (i) déterminer l'identité moléculaire des principaux Begomovirus infectant le gombo au Togo et (ii) d'établir la taxonomie de ces Begomovirus du Togo.

CHAPITRE I : SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I : synthèse bibliographique

Chapitre I: Synthèse bibliographique

I. Généralité sur le gombo

Les espèces de gombo cultivées et celles sauvages apparentées ont été initialement classées dans le genre Hibiscus, section Abelmoschus par Linné (1737). Medikus (1787) a proposé d'élever cette section au rang d'un genre distinct, mais la référence au genre Hibiscus

est restée jusqu'au milieu du 20^e siècle. Il a fallu attendre la réhabilitation du genre Abelmoschus par Hochreutiner (1924) pour que son emploi soit admis dans les flores et la littérature contemporaine. Ce genre se distingue du genre Hibiscus d'après les caractéristiques du calice: calice spatiforme à cinq dents courtes, soudées à la corolle et caduques après la floraison (Terrell et Winters, 1974).

1.2. Données taxonomiques

Le genre Abelmoschus appartient à la famille des Malvacées. Il comprend environ 1500 espèces. C'est une famille très facile à reconnaître par sa fleur qui a un aspect typique dû à ses pétales à préfloraison tordue et aux nombreuses étamines soudées en un tube (Guignard, 1993). Il se distingue par les caractéristiques du calice. Le genre Abelmoschus est constitué d'une série polyploïde dont l'organisation n'est pas aisée à saisir. On peut cependant distinguer trois niveaux de ploïdie. Un premier ensemble d'espèces possède des nombres chromosomiques de bases compris entre 2n=58 et 2n=78 chromosomes. Il s'agit d'Abelmoschus tubernaculatus, Abelmoschus manihot, Abelmoschus moschatus, Hibiscus coccineus, Hibiscus grandiflorus et Abelmoschus ficulneus. Le deuxième niveau comprend les polyploïdes issus directement des génomes de base (2n = 120 à 140) : ce sont Abelmoschus esculentus, Abelmoschus tetraphyllus et Abelmoschus pungens. Le dernier niveau comprend les gombos de type "Guinéen" d'Afrique occidentale à 2n=192 ou 194 chromosomes (Charrier, 1983).

2. Description de l'espèce Abelmoschus esculentus (L.) Moench 2.1. Origine géographique

Le gombo (Abelmoschus esculentus (L). Moench) est une plante cultivée d'origine controversée. En effet, si l'origine du genre Abelmoschus ne souffre d'aucun débat, deux hypothèses s'affrontent quant à l'origine géographique d'Abelmoschus esculentus (L.) Moench

Chapitre I : synthèse bibliographique

(Ouedraogo, 2009). Certains auteurs soutenant que l'un de ses ancêtres (Abelmoschus tuberculatus L.) est natif de « Uttar » Pradesh (Nord de l'Inde) suggèrent que l'espèce Abelmoschus esculentus (L.) Moench est originaire de cette aire géographique (Hamon et Sloten, 1995). Alors que d'autres, sur la base de sa culture antique en Afrique orientale et la présence de l'autre ancêtre (Abelmoschus ficulneus), suggèrent que l'aire de domestication d'Abelmoschus esculentus (L.) Moench est le nord de l'Égypte ou l'Éthiopie. Cependant, aucune preuve définitive n'est disponible aujourd'hui.

2.2. Systématiques

L'espèce Abelmoschus esculentus (L.) Moench appartient à la famille des Malvacées (Hamon et Charrier, 1983) qui comporte environ 1500 espèces surtout intertropicales. La systématique de l'espèce est consignée dans le tableau I

Le gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) est une plante herbacée annuelle, à port érigé, de 1 à 4 m de haut. Il est généralement peu ramifié, à tige cylindrique, avec des poils raides disséminés, souvent tachetés de rouge (Rohwer, 2002 ; Grubben, 2004).

Les feuilles (Figure 1a) du gombo sont simples, alternées, de forme et de taille variables. Ses stipules sont filiformes et mesurent jusqu'à 2 cm de long. Ils sont souvent fendus jusqu'à la base et couverts de poils raides. Le pétiole mesure 5 à 50 cm de long (Rohwer, 2002).

Chapitre I : synthèse bibliographique

Les fleurs (Figure 1b) sont axillaires, solitaires ou en grappe. Le pédicelle mesure jusqu'à 3 cm de long sur la fleur et 7 cm sur le fruit, avec des poils raides disséminés ; le calice mesure 2-6 cm de long, avec 5 dents à l'apex et se fendant généralement sur un côté lors de l'expansion de la corolle ; la fleur est formée de 5 pétales libres de 3-7 cm de long. (Siemonsma, 1982).

Le fruit (Figure 1c) est une capsule érigée en section ronde de 5 à 10 angles, concave entre les côtes, variant quand il est jeune d'une couleur rouge-violet et vert rougeâtre à vert foncé. Il peut, contenir jusqu'à 100 graines à la maturité (Siemonsma, 1982).

Les graines (figure 1d) de forme globuleuse à ovoïde mesurent 3-6 mm de diamètre (Siemonsma, 1982).

Figure 2 : Illustration des différentes parties de la plante du gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench): feuilles (a), fleurs (b), fruits (c), et graines (d) (photo Akakpo, 2018)

Chapitre I : synthèse bibliographique

Le gombo est un légume qui procure un apport intéressant d'antioxydants, de vitamines et de minéraux (Hamon, 1988). La composition biochimique des fruits et des feuilles de gombo pour 100 g de partie comestible est présentée dans le tableau II.

Chapitre I : synthèse bibliographique

Tableau II : Composition biochimique des fruits et des feuilles de gombo pour 100 g de partie comestible (matière fraîche)

Chapitre I : synthèse bibliographique

Les mucilages confèrent au gombo son aspect gluant qui est une caractéristique de ce fruit-légume. Les mucilages d'origine végétale sont un complexe polysaccharidique composé de galactose, de rhamnose et d'acide galacturonique (Hirose et al., 2004). Ils sont localisés dans les cellules épidermiques, le xylème primaire et le cortex périphérique (Clifford et al., 2001). Ils sont aussi présents dans le style des fleurs et à l'extrémité des racines (Macquet, 2007). Les fruits sont riches en glucides (7 à 8 % de la matière sèche) présents sous forme de mucilages (Sawadogo, 2006).

6.2. Usages et valorisation du gombo

Le gombo est une plante exceptionnelle et originale, car presque toutes ses parties (racines, tige, feuilles, fruits et graines) sont valorisées sur le plan alimentaire, médicinal, artisanal et industriel (Marius et al., 1997).

6.2.1. Valorisations nutritionnelles et sociales

Les jeunes fruits immatures de gombo constituent un légume important, consommé comme condiment ou liant dans les sauces (Hamon et Charrier, 1997). Ils sont riches en glucides, protéines, vitamines K, E, C, B9, fer, phosphore, potassium et magnésium (Leung et al., 1968 ; Hamon, 1988, Koechlin, 1989 ; Nzikou et al., 2006). Sa valeur nutritionnelle dépasse celle de la tomate (Hamon et Charrier, 1997). Selon Kumar et al., (2010), les graines de gombo pourraient servir à fabriquer une huile végétale de bonne qualité ainsi que de la farine (en vue de supplémenter une farine de céréales). Après le pressage des graines, le tourteau contient 30% de protéines (Marius et al., 1997). Les graines torréfiées sont employées dans certaines régions du Nigeria comme substitut du café (Siemonsma et Hamon, 2004). Les feuilles sont une excellente source de calcium et contiennent plus de 25% de protéines à l'état sec (Kennedy, 2012). Consommées comme salade, les feuilles fraîches ou séchées sont très intéressantes pour épaissir des soupes et ragoûts (Koechlin, 1989 ; Kennedy, 2012).

Sur le plan social, le gombo joue aussi un rôle important dans la vie d'une grande proportion des familles pauvres en améliorant leur repas quotidien, grâce à sa capacité d'épaissir les soupes, sa diversité de préparation ainsi qu'à sa valeur nutritive (Tshomba et al., 2015).

Chapitre I : synthèse bibliographique

6.2.2. Valorisations industrielles et artisanales

La tige, constituée de fibres (Igor et al., 2009) sert à l'industrie textile, à la fabrication de papier, de carton, des cordes, des sacs, des lignes de pêche et de piège à gibier (Martin, 1982 ; Marius et al., 1997 ;Shamsul et Arifuzzaman, 2007). Le gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) présente donc un certain potentiel industriel. La possibilité d'utiliser les graines pour fabriquer du biodiesel a été prouvée (Anwar et al., 2010).

6.2.3. Valorisations thérapeutiques

Le gombo possède de nombreuses vertus thérapeutiques. Il est utilisé pour le traitement de maux de dents (Lapointe, 1987), de la constipation (Nacoulma, 1996), et de la glycémie (Oyen et Lemmens, 2002). Pour Mugnier, (2008), toutes les parties de la plante sont utilisées, principalement pour traiter les maladies cardio-vasculaires ou digestives. Les feuilles sont parfois utilisées comme base de cataplasmes, comme émollient, sudorifique ou antiscorbutique et pour traiter la dysurie (Siemonsma et Hamon, 2004). Les jeunes fruits contiennent un mucilage ayant des propriétés variées de substitut de plasma sanguin, fluidifiant des systèmes liquides et sanguins (Martin et al., 1981 ; Marius et al., 1997). En plus les mucilages du gombo peuvent potentiellement être utilisés en médecine, ou comme additif alimentaire (Kumar et al., 2010). L'extrait végétal de gombo présente des propriétés médicinales dont les molécules ont des effets immuno modulateurs (Sheu et Lai, 2012). Les nanoparticules pourraient avoir un grand potentiel pharmaceutique grâce à leur activité antifongique (Jayaseelan et al., 2013).

La production mondiale du gombo était estimée à 9 641 284 de tonnes environ en 2017, répartie dans 43 pays sur une superficie légèrement supérieure à 1,1 million d'hectares (FAOSTAT, 2019). Les pays en développement d'Asie et d'Afrique concentrent environ 99% de la production mondiale du gombo (FAOSTAT, 2019).

En Afrique, sa production est caractérisée par une très faible productivité (2,7 tonnes/ha) par rapport à la moyenne mondiale de 10 tonnes/ha (FAOSTAT, 2019). Les cinq premiers pays producteurs en 2017 ont été: l'Inde (6,35 millions de tonnes), le Nigeria (1,1 million de tonnes), l'Iraq (142 mille tonnes), la Côte d'Ivoire (139 mille tonnes) et le Pakistan (108 mille tonnes). Au Togo, selon la Direction des Statistiques Agricoles, de l'Informatique et de la Documentation (DSID), la production annuelle du gombo s'élevait à 1279,66 tonnes en 2016.

Chapitre I : synthèse bibliographique

II. Maladies et insectes ravageurs du gombo 1. Maladies causées par les champignons

Selon le Programme PIP (2008), les principales maladies fongiques qui s'attaquent au gombo sont :

Les symptômes sont des taches blanches, poudreuses, surtout sur la face inférieure des feuilles. La progression est rapide, et entraine le dessèchement des vieilles feuilles. Les conditions favorables à ce champignon sont : temps assez chaud (24 à 30°C), sans pluie avec des taux d'humidité relative modérés entre 50 et 90% (PIP, 2008).

Elle se manifeste par la présence de taches foliaires chlorotiques diffuses, de forme et dimension variables. À la face inférieure des feuilles, on trouve un amas pulvérulent brun noirâtre. La maladie progresse des feuilles du bas de la plante vers le haut de la plante. Les taches peuvent envahir tout le limbe. Les feuilles se dessèchent et tombent. La saison chaude et humide est la période favorable (PIP, 2008).

Elle peut intervenir à tous les stades de croissance du gombo, mais surtout au stade préfloraison. Elle provoque le flétrissement de la plante qui peut finir par mourir (PIP, 2008).

La bactériose est la principale maladie bactérienne du gombo. La plante est sensible à cette maladie à n'importe quel stade de son développement. Cette maladie est occasionnée par Xanthomonas axonopodis. Elle se manifeste par des petites taches circulaires sur les cotylédons, des fontes de semis et des pertes de jeunes plants et des taches vitreuses et circulaires sur le fruit (PIP, 2008).

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3.1. Virus responsables de la maladie de l'enroulement des feuilles du gombo (Okra Mosaic Desease)

Les travaux de caractérisation moléculaire ont permis de décrire plusieurs espèces de virus du genre Begomovirus responsables de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo en Afrique. Ces virus sont résumés dans le tableau III.

3.2. Maladie de l'enroulement foliaire du gombo

La maladie de l'enroulement foliaire du gombo ou Okra leaf curl disease (OLCD) est une maladie virale du gombo occasionnée par des virus du genre Begomovirus. Les plantes atteintes présentent un retard de croissance avec un repliement des feuilles (vers le haut ou vers le bas) et un épaississement de nervures associés ou non à un jaunissement. Ce qui affecte significativement la capacité de la plante à produire. Le Okra leaf curl disease (OLCD) est répandue dans toute la région tropicale et constitue une contrainte majeure pour la production du gombo parce qu'il occasionne des pertes considérables de rendement (Barro, 1994 ; Tiendrébéogo, 2010). Les études entreprises ces dernières années ont permis de décrire cette maladie sur le gombo dans de nombreux pays d'Afrique sahélienne et ses environs: en Côte d'Ivoire (N'Guessan et al., 1992 ; Séka et al., 2016), au Ghana, au Nigéria et au Tchad (Swanson et Harrison, 1993), en Égypte (Bigarré et al., 2001), au Mali (Kon et al., 2009), au

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Niger (Shih et al., 2009), au Burkina Faso (Tiendrébéogo et al., 2010), au Cameroun (Leke et al., 2013).

Le gombo en comparaison avec la plupart des plantes de la famille des Malvaceae est considéré comme une plante entomologique par excellence compte tenu du nombre d'espèces d'insectes qui l'attaquent (De Lannoy, 2001; PIP, 2008). On rencontre:

Les altises sont de petits coléoptères d'environ 3 mm de long (figure 2, A). Les oeufs sont pondus aux pieds des plantes à proximité du sol. Les larves se nourrissent des racines de la plante. Les dommages sont négligeables sur les racines. Les dégâts sont causés par les adultes qui rongent les feuilles et laissent généralement des petits trous ronds donnant une apparence criblée aux plantes. Les dégâts sont surtout dommageables sur les jeunes plants. Les conditions favorables à cet insecte sont: les sols légers, l'excès d'azote, les plantes chétives, le sol pauvre en matière organique et un fort ensoleillement (De Lannoy, 2001).

Elle se reconnait par le dessèchement et la tombée des jeunes fruits, des taches sur les fruits à maturité avancée et parfois leur dessèchement (figure 2, E). Elle apparait de la floraison jusqu'à la récolte (De Lannoy, 2001).

Ce puceron a une coloration variable, jaune, vert ou brun. De forme ailée, elle a la tête et le thorax noir, et l'abdomen vert à jaune (figure 2, D). Ce puceron suceur affaiblit la plante et provoque une déformation des feuilles quand ils sont en grand nombre. Ils produisent un miellat sur lequel un champignon saprophyte peut se développer. Ce champignon empêche une bonne photosynthèse (De Lannoy, 2001).

C'est une cicadelle dont l'adulte fait 2,5 à 3 mm de long, de couleur vert clair à vert jaunâtre (figure 2, C). Pendant la journée, elles sont sous les feuilles, mais passent sur le dessus des feuilles le soir. Les nymphes et les adultes sucent la sève des feuilles en sécrétant une salive toxique. Cela entraîne une décoloration des feuilles, d'abord aux bords puis aux

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tissus inter-nervaires. Une couleur brunâtre et rougeâtre peut ensuite apparaître. En cas de forte infestation, la croissance de la plante peut être bloquée (De Lannoy, 2001).

C'est un aleurode extrêmement polyphage rencontré dans les zones de production agricole des cultures maraîchères en général et particulièrement celles du gombo. Les adultes de l'insecte mesurent entre 0,8 et 1 mm de long (figure 2, B). Tous les stades du développement du gombo sont attaqués par les mouches blanches. Par ailleurs, les attaques précoces par des individus porteurs de virus constituent de véritables dangers pour les plantules qui cessent de croître, compromettant ainsi la culture toute entière (PIP, 2008).

Les chenilles sont vert translucide à pattes et tête noires (figure 2, F). Les feuilles attaquées sont découpées et enroulées. Ces chenilles sont le plus souvent cachées dans les feuilles enroulées. Si les attaques sont fortes, la croissance de la plante peut être freinée. Les dégâts sont généralement limités à quelques plantes dans un champ (De Lannoy, 2001).

Figure 3: Principaux insectes ravageurs observés sur le gombo. (A) Altise (Podagrica decolorata); (B) Mouche blanche (Bemisia tabaci Genn.); (C) Jasside (Jacobiasca sp); (D) Puceron (Aphis gossypii); (E) Dysdercus sp ; (F) Syllepte derogata ; (G) Anomis flava (Ekra, 2010)

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III. Famille des Geminiviridae 1. Généralité et classification

Les Begomovirus appartiennent à la famille des Geminiviridae. Du latin « geminus » qui signifie « jumeau ». Cette famille comprend des virus dont le génome est constitué d'une molécule (monopartite) ou de deux molécules (bipartites) d'ADN simple brin (ADNsb) de tailles identique (environ 2,8 kilobases). Les molécules d'ADNsb sont protégées par une capside de forme icosaédrique, en doublet d'une taille d'environ 18-20 nm de diamètre et 30 nm de long (figure 3, Zhang et al., 2001; Jeske, 2009).

Figure 4 : (a) Reconstruction tridimensionnelle d'une particule géminivirale. L'échelle représente 10 nm (Zhang et al., 2001). (b) Particules géminivirales vues au microscope électronique montrant leur forme icosaédrique associée en doublets. L'échelle représente 50 nm (Brown et al., 2011).

Les virus appartenant à cette famille avaient été classés en quatre genres en se basant sur leur gamme d'hôtes, leur insecte vecteur et leur organisation génomique (Brown et al., 2011). Il s'agissait : des virus du genre Begomovirus qui infectent principalement les plantes dicotylédones et transmis exclusivement par l'aleurode Bemisia tabaci Genn., ceux du genre Curtovirus infectant des plantes dicotylédones et transmis par des cicadelles, ceux du genre Mastrevirus, infectant principalement des plantes monocotylédones et transmis par des cicadelles, et enfin ceux du genre Topocuvirus infectant des plantes dicotylédones et transmis par un membracide (Rojas et al., 2005). Le genre Begomovirus tire son nom du Bean golden mosaic virus responsable de la mosaïque dorée du haricot (Regenmortel et al., 2000). Ce genre comporte le plus grand nombre d'espèces décrites, avec plus de 388 espèces reconnues

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par l'ICTV (Brown et al., 2015). Il est suivi du genre Mastrevirus avec plus de 30 espèces reconnues (Zerbiniet al., 2017). Selon leur répartition géographique, il faut distinguer les Begomovirus de l'Ancien Monde regroupant des Begomovirus originaires d'Europe, d'Inde, d'Afrique et d'Asie et les Begomovirus du Nouveau Monde originaires d'Amérique. Grâce aux nouvelles techniques de caractérisation moléculaire développées ces dernières années, 5 nouveaux genres ont vu le jour. Il s'agit: des Becurtovirus, des Eragrosvirus, des Turncurtovirus (Varsani et al., 2014) puis des Capulavirus, et des Grablovirus (Varsani et al., 2017). En outre, quatre autres espèces de virus étroitement liés aux géminivirus ont été découvertes et acceptées par le Comité exécutif de l'ICTV pour inclusion dans la famille des Geminiviridae. Mais ces espèces resteront non attribuées à un genre, en attendant l'identification de leurs espèces vectrices et la confirmation de la morphologie de la particule virale (Varsani et al., 2017). Il s'agit des espèces Apple geminivirus (Liang et al., 2015), Citrus chlorotic dwarf associated virus (Loconsoleet al., 2012; Guo et al., 2015), Grapevine geminivirus A (Al Rwahnih et al., 2017), Mulberry mosaic dwarf associated virus (Lu et al., 2015; Ma et al., 2015) et Tomato associated geminivirus 1 (Fontenele et al., 2017).

2. Origine des géminivirus

Les géminivirus actuels auraient évolué à partir de réplicons d'ADN extra-chromosomiques présents chez les ancêtres procaryotes ou eucaryotes primitifs des plantes modernes (Koonin et Ilyina, 1992; Rojas et al., 2005). Dans ce scénario, le géminivirus ancestral est envisagé sous la forme d'un plasmide extra-chromosomique circulaire d'ADN sb qui se serait répliqué par un mécanisme de cercle roulant impliquant une forme réplicative d'ADN db. Les relations phylogénétiques étroites des protéines Rep des géminivirus avec celles des protéines Rep des plasmides des phytoplasmes, ainsi que la ressemblance structurelle forte entre la CP des géminivirus et celle des virus icosaédriques à ARNsb ont permis de proposer un deuxième scénario évolutif dans lequel l'acquisition du gène codant pour la protéine de capside d'un virus de plante à ARNsb par un plasmide de phytoplasme a donné naissance à l'ancêtre des géminivirus (Krupovic et al., 2009).

3. Le genre Begomovirus

3.1. Organisation génomique du genre Begomovirus

Selon l'organisation génomique, les Begomovirus ont été scindés en deux groupes: les Begomovirus monopartites ayant un ADN simple brin circulaire d'environ 2,8 kilobases (ADN-A) et les Begomovirus bipartites ayant deux ADN simples brins circulaires d'environ 2,8 kilobases chacun (ADN-A et ADN-B ; Jeske, 2009 ; ICTV, 2012). Chacun des deux

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composants (ADN-A et ADN-B) possède des gènes qui codent pour plusieurs protéines et une région intergénique (Intergenic Region, IR) d'environ 200 paires de bases comprenant l'origine de réplication (ori), les itérons (courtes séquences répétées), la région commune (Common Region, CR) et la tige boucle (5' TAATATT?AC 3') (Brown et al., 2011; Zerbini et al., 2017) (figure 5).

Figure 5: Représentation de l'organisation génomique des Begomovirus (monopartites et bipartites). LIR (Long Intergenic Region); SIR (Short Intergenic Region); CR (Common Region) (Zerbini et al., 2017).

L'ADN-A porte une région intergénique (IR) et 6 cadres ouverts de lecture ou ORFs (Open Reading Frames) dont certains sont chevauchants (Brown et al., 2011; Fondong, 2013). Sur le brin viral, l'ORF V1 (AV1 chez les bipartites) code pour la Protéine de Capside CP qui est l'unité de base dans la constitution de la particule virale en doublet des Begomovirus. L'ORF V2 (AV2 chez les bipartites) code pour la Protéine de Mouvement MP qui associé à la CP permet de diffusion du virus dans la plante hôte (Brown et al., 2011; Fondong, 2013). Par ailleurs, des études ont montré que les Begomovirus bipartites du Nouveau Monde ne possèdent pas l'ORF AV2 (Rojas et al., 2001; Bull et al., 2007; Fondong, 2013; Hanley-Bowdoin et al., 2013). Les ORFs portés par le brin complémentaire codent pour la protéine associée à la réplication (Rep) du virus au sein de la plante (ORF C1), la protéine activatrice de la transcription (TrAP) (ORF ) (Wezel et al., 2001), la protéine activatrice de la réplication (REn) (ORF C3) et la protéine C4 (ORF C4). La protéine C4 semble intervenir dans l'expression de la sévérité des symptômes et dans le déplacement du virus dans la gamme d'hôtes (Krake et al., 1998; Vanitharani et al., 2005). Associé à la REn, la Rep permet

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l'accumulation de la charge virale dans les cellules de la plante (Hanley-bowdoin et al., 1989).

L'ADN-B des Begomovirus bipartites porte deux ORFs non chevauchants qui codent pour deux protéines. La protéine MP (ORF BC1) qui est impliquée dans le mouvement de cellule à cellule de l'ADN viral et la protéine NSP (Nuclear Shuttle Protein, ORF BV1) qui est impliquée dans le transport de l'ADN viral du noyau vers le cytoplasme à travers la membrane nucléaire (Sanderfoot et al., 1996; Gafni et Epel, 2002).

3.2. Association des Begomovirus avec des satellites

Les Begomovirus monopartites de l'Ancien Monde ont été associés à la description de trois types de molécules d'ADNsb circulaires. Il s'agit des á satellites et des f3 satellites d'une taille d'environ 1350 nucléotides chacun (Briddon et Stanley, 2006; Zhou, 2013) et les satellites défectifs d'une taille d'environ 682 nucléotides (Lozano et al., 2016 ; Zhou, 2013).

Les á satellites sont capables d'autoréplication dans les cellules végétales, mais dépendent de leurs Begomovirus assistants, également nommés « helper », pour le mouvement au sein de la plante hôte et la transmission inter-plantes via l'insecte vecteur (Mansoor et al., 1999; Saunders et Stanley, 1999). Ils codent pour une seule protéine associée à la réplication (Zhou, 2013). Ils semblent jouer un rôle de modulation de la virulence du complexe Begomovirus-f3 satellite (Idris et al., 2011) en diminuant, voire en supprimant l'expression des symptômes de certaines maladies à Begomovirus.

Les f3 satellites quant à eux sont entièrement dépendants de leur association avec les Begomovirus pour leur réplication, leur encapsidation et leur dissémination. Ils contiennent trois régions conservées : une séquence riche en Adénine (A-richsequence), une séquence conservée connue sous le nom de région conservée des satellites (satellite conserved region, SCR) et un seul gène dans le sens complémentaire qui code pour une petite protéine (~118 acides aminés) connue sous le nom de f3C1. La protéine f3C1 est une protéine multifonctionnelle intervenant dans la sévérité de la maladie et la suppression de certains mécanismes de résistance de la plante.

Les satellites défectifs (deltasatellites), troisième classe d'ADN satellites en association avec des Begomovirus, ont récemment été définis (Fiallo-Olivé et al., 2012; Zhou, 2013; Lozano et al., 2016). Ils sont distincts des á satellites et des f3 satellites en raison de la petite taille de leur génome (~ 682 nucléotides) et de l'absence d'ORF.

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Figure6: Représentation des ADN â satellites et á satellites codant respectivement pour les protéines ßC1 et Rep, et des molécules défectives sans ORFs. A-rich (Adenine-rich region); CR (Common Region); IR (Intergenic Region); SCR (Satellite Conserved Region) (Zhou, 2013).

3.3. Réplication des Begomovirus

Les Begomovirus utilisent deux mécanismes pour la réplication de leur génome. Une fois dans le cytoplasme cellulaire de la plante hôte, l'ADN simple brin viral, décapsidé, rejoint le noyau pour être converti en forme réplicative ADN double brin (ADNdb) par la polymérase cellulaire de l'hôte. L'ADN double brin est capable de se répliquer par un mécanisme de cercle roulant (RCR), de manière analogue aux plasmides bactériens et phages à ADN sb circulaire, et par un mécanisme de réplication dépendante de la recombinaison (RDR) (Hanley-Bowdoin et al., 1999; Jeske et al., 2001; Preiss et Jeske, 2003 ; figure 6). La protéine Rep seule est suffisante à l'initiation de la réplication RCR en introduisant une ouverture au sein du motif conservé de la tige boucle (TAATATT?AC) contenant le site d'initiation (?) de la RCR (Hanley-Bowdoinet al., 2000). Ainsi, elle dérégule le cycle cellulaire et fournit les facteurs cellulaires compatibles avec la réplication de l'ADN. Une dernière étape permet le transport des génomes filles d'ADNsb vers les cellules adjacentes via les plasmodesmes, ou leur encapsidation pour former de nouvelles particules virales (Gutierrez, 1999).

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Figure7: Schématisation des modèles de réplication en cercle roulant (RCR) et de la réplication dépendante de la recombinaison (RDR) des Begomovirus (Bernardi et Timchenko, 2008 ; Jeske et al., 2001).

Synthèse de la forme réplicative ADN db : Après décapsidation, il y a la synthèse d'une amorce complémentaire à la région intergénique JR. La synthèse du brin complémentaire est initiée à partir de cette amorce. L'ADNdb circulaire servira pour la réplication.

Etape a : accrochage de la protéine associée à la réplication (Rep) à l'origine de réplication (ori).

Etape b : ouverture de l'ADN et liaison covalente de la Rep à l'extrémité 5'.

Etape d : nouvelle ouverture de l'ADN, fermeture des ADN simple brin et relargage de la Rep.

Etape e : interaction entre un ADN simple brin incomplet et la forme super-enroulée de l'ADN viral (cccDNA) à

Etape h: synthèse de l'ADN complémentaire et obtention d'un ADN double brin.

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3.4. Variabilité génétique des Begomovirus

3.4.1. Mutations

Les mutations sont des erreurs de copies générées lors de la réplication du génome par les polymérases ARN ou ADN. Le taux de ces erreurs varie grandement entre les ADN polymérases, présentant divers mécanismes de correction et des taux d'erreurs relativement faibles (entre 10^-6 et 10^-8 erreurs par nucléotide et par réplication; Garcia-Diaz et Bebenek, 2007) et les ARN polymérases aux taux d'erreurs nettement plus élevés (entre 10^-3et 10^-5erreurs par nucléotide et par réplication; Jenkins et al., 2002). Chez les géminivirus, plusieurs études ont estimé des taux de substitution de l'ordre de 10^-3 à 10^-4substitutions par position nucléotidique et par année (Isnard et al., 1998; Ge et al., 2007; van der Walt et al., 2008; Duffy et Holmes, 2009). Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ces taux élevés, tels que l'incompatibilité entre les enzymes de correction et le génome viral, la présence de structures secondaires favorisant les erreurs, ou bien le rôle potentiel de protéines virales dans l'altération de la fidélité de la polymérase (Gutierrez, 1999; Arguello-Astorga et al., 2007). Le taux de substitution élevé des Begomovirus en tant que moteur de leur diversification est associé à un deuxième processus évolutif majeur chez les géminivirus: la recombinaison.

3.4.2. Survenue des phénomènes de recombinaisons

La recombinaison virale est un processus permettant la genèse d'un nouveau virus issu de nouvelles combinaisons génomiques à partir de l'information génétique de deux virus parentaux et de la création de nouveaux types d'arrangement génomiques. Elle permet l'acquisition en une seule étape d'une grande variabilité génétique et donc la création de nouveaux types d'arrangements dans le génome. La recombinaison a été largement décrite chez les géminivirus. Les phénomènes de recombinaison ont été décrits à la fois entre des virus de la même espèce (Zhou et al., 1997), d'espèces différentes (Monci et al., 2002) et aussi entre virus appartenant à différents genres (Saunders et Stanley, 1999). En ce qui concerne le genre Begomovirus, une multiplicité et une variété de description d'évènements de recombinaison conduisant à une diversité moléculaire élevée ont été décrites ces dernières années (Lefeuvre et al., 2007 ; Tiendrébéogo et al., 2010).

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3.5. Dissémination spatiale et temporelle des Begomovirus

L'émergence des maladies à Begomovirus ces dernières années est due non seulement à la capacité de recombinaison et d'adaptation de ces virus, mais également et surtout à la dissémination vectorielle et aux activités humaines.

3.5.1. Insecte vecteur

Les Begomovirus sont transmis des plantes malades aux plantes saines par l'intermédiaire d'une mouche blanche, Bemisia tabaci Genn. (ICTV, 2012).C'est une mouche d'origine tropicale faisant partie de l'ordre des Hemiptera, de la famille des Aleyrodidae et de la sous- famille des Aleyrodinae (De Barro et al., 2011). Bemisia tabaci Genn. est un aleurode mesurant 1 à 1,5 millimètre de long, de couleur blanc-jaunâtre et disposant de 2 paires d'ailes blanches (Figure 7). C'est un polyphage piqueur-suceur qui se nourrit de plusieurs espèces végétales (Osborne, 1988). Considérée comme l'une des espèces les plus envahissantes au monde, la mouche blanche se nourrit des liquides intracellulaires des plantes hôtes. Présente sur la majorité des continents, elle prolifère surtout dans l'hémisphère sud et aurait favorisé l'émergence et l'évolution des populations bégomovirales dans les régions tropicales et subtropicales (Jeske, 2009).

Des études récentes ont permis de décrire plusieurs biotypes à travers les différentes régions du monde. Parmi ces biotypes, le biotype B a beaucoup contribué à l'expression des Begomovirus sur de nouveaux hôtes, car il est très fécond, plus répandu et est

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le plus redoutable ravageur des plantes (Perring et al., 1991; Delatte et al., 2007). La transmission des Begomovirus aux plantes se fait selon le mode circulant et persistant (Czosnek, 2007). Le virus est acquis passivement lors de prise d'aliment de Bemisia tabaci Genn. et se retrouve ensuite dans les glandes salivaires de l'insecte. Le virus sera donc transmis à une nouvelle plante par salivation lors d'une nouvelle alimentation de l'insecte sur une plante saine.

3.5.2. Activités humaines

L'activité humaine a également été reconnue dans l'émergence des Begomovirus. Le mode de culture basé sur la monoculture et le transfert d'espèces végétales hors de leurs zones géographiques ont contribué énormément à la mise en place de conditions favorables à la transmission par Bemisia tabaci Genn. de virus indigènes vers les plantes exotiques introduites (Jones, 2009). Ainsi, les échanges de matériel végétal contaminé et les pratiques culturales inappropriées favorisent l'élargissement des aires de distributions des virus.

3.6. Hôtes et symptômes causés par les Begomovirus

Les Begomovirus sont rencontrés sur une large gamme d'espèces de plante. Les plantes hôtes les plus répertoriées dans la littérature appartiennent à la famille des dicotylédones : Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Convolvulaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Labiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Solanaceae et Verbenaceae (Silva et al., 2017). Les principaux symptômes observés (Figure 8) chez les plantes atteintes de maladies associés aux Begomovirus sont : (1) des déformations foliaires associées ou non à des mosaïques, comme la mosaïque du manioc (Cassava Mosaic Disease, CMD) (Legg et al., 2014a,b),(2) des repliements foliaires en forme de cuillère associés ou non à du jaunissement et du nanisme, comme la maladie de l'enroulement et/ou du jaunissement foliaire de la tomate (tomato (yellow) leaf curl disease, ToLCD-TYLCD) (Tiendrébéogo et al., 2010 ; Navas-Castillo et al., 2011; Péréfarres et al., 2014 ; Mivedor et al., 2017) et la maladie de l'enroulement foliaire du gombo (okra leaf curl disease, OLCD ; Tiendrébéogo et al., 2010), et (3) des jaunissements des nervures, comme la maladie du jaunissement des nervures du piment (pepper yellow vein disease, PYVD, Tiendrébéogo et al., 2008).

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Figure 9: Symptôme (a) de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo (Okra leaf curl disease, OLCD) observé au Burkina Faso, (b) de la maladie du jaunissement des nervures du piment (Pepper yellow vein disease, PYVD ; Tiendrebeogo et al., 2008) et (c) de la maladie de l'enroulement (et du jaunissement) foliaire de la tomate (Tomato (yellow) leaf curl disease, ToLCD-TYLCD) observé au Togo (Mivedor et al., 2017)

4. Principales méthodes de diagnostics des Begomovirus

Les symptômes caractéristiques d'une infection à Begomovirus précédemment décrits sont généralement utilisés pour diagnostiquer les plantes atteintes de la maladie. Cependant, l'état de ces symptômes et même l'état général de la plante peuvent être influencés par d'autres facteurs. Ces facteurs sont entre autres l'action des insectes ravageurs des feuilles, des insectes piqueurs-suceurs et aussi du stress hydrique (Jones, 2003). Face à cette difficulté rencontrée par cette méthode de diagnostic, plusieurs méthodes de laboratoire ont été développées (Matthews, 1991). Il s'agit des tests de diagnostic sérologique (Al Bitar et Luisoni, 1995; Wu et al., 2012) et moléculaire (Patel et al., 1993; Inoue-Nagata et al., 2004).

Le test sérologique est basé sur l'utilisation des techniques de précipitation en immuno-diffusion (ID) et des tests immuno-enzymatiques (ELISA). Les anticorps utilisant les tests ELISA ont permis la détection des Begomovirus dans différents extraits végétaux (Konaté et al., 1995; Harrison et Robinson,1999). La variante TAS-ELISA utilisant les anticorps monoclonaux a été utilisée pour la détection et la classification de ce groupe de virus (Barro, 1994; Konaté et al., 1995; Tiendrébéogo et al., 2006). Par ailleurs, d'autres tests sérologiques utilisant des sérums polyclonaux sont utilisés avec succès. Ce sont: "Western

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blots", "Leafimprint blots", "Tissue blots", "Transmission electronmicroscopy and immunolabeling" (Abouzid et al., 2002).

4.2. Tests moléculaires

Les techniques moléculaires de détection et d'identification des virus sont basées sur la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Des couples d'amorces spécifiques ou universelles ont été développés pour la détection respectivement de certaines espèces de Begomovirus ou de certains groupes de Begomovirus, notamment à partir d'informations sur la séquence des régions conservées de l'ADN-A (Wyatt et Brown, 1996; Atzmon et al., 1998; Brown et al., 2001). De nos jours, les comparaisons de séquences nucléotidiques et la phylogénie permettent de distinguer avec précision les espèces virales (Padidam et al., 1995; Brown, 1997; Fauquet et al., 2003). Ces comparaisons sont généralement basées sur la séquence de la région intergénique (IR) et celle du gène de la protéine de capside (CP) en l'absence de séquence complète de l'ADN-A (Brown, 1997; Brown et al., 2001). Mais pour une taxonomie définitive, la séquence complète de l'ADN-A est nécessaire. Le seuil de distinction taxonomique des Begomovirus actuellement admis par le comité international de taxonomie virale (CITV) est de 89% pour l'ADN-A (Fauquet et al., 2008 ; Brown et al., 2015).

Les maladies virales des plantes occasionnent de pertes importantes à la fois sur le rendement et la qualité des produits agricoles. De nos jours, peu de méthodes de lutte sont disponibles dans le cas d'une infection virale et surtout, aucun traitement curatif ne peut être appliqué. Les principales mesures de lutte contre les Begomovirus visent surtout à réduire les sources de l'inoculum viral et la population du vecteur. Ces moyens de lutte sont essentiellement biologiques, chimiques, culturaux et physiques. La lutte peut être également génétique et basée sur l'utilisation de variétés résistantes ou tolérantes au virus et/ou au vecteur (Brown et Bird, 1992; Brown, 1994; Thresh et Otim-Nape, 1994; Pico et al., 1996; Polston et Anderson, 1997; Varma et Malathi, 2003).

5.1. Pratiques culturales, prophylaxie

Ce sont des pratiques qui consistent à empêcher ou réduire considérablement l'arrivée du virus sur les parcelles de production. Ils consistent donc à empêcher les introductions et les mouvements de plants infectés par le virus vers les zones encore indemnes (saines). Ces pratiques constituent une priorité dans la lutte contre les Begomovirus (Anderson

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et al., 2004). Dans les zones déjà contaminées, l'emploi de plants sains et certifiés ainsi que l'élimination des plantes adventices hôtes de Begomovirus à proximité des parcelles de production constituent les premières mesures qui tendent à repousser l'infestation (Sánchez-Campos et al., 1999; Papayiannis et al., 2011). Également, la rotation des cultures d'une saison à une autre et l'élimination des résidus de culture sont également recommandées (Morilla et al., 2005).

Le contrôle de l'insecte vecteur constitue aussi un élément très important de la lutte contre les Begomovirus. Ce moyen de lutte peut se baser sur l'utilisation de barrières physiques (Cohen et Antignus, 1994), de méthodes qui perturbent le comportement de l'insecte (modification du rayonnement UV dans les serres, Antignus et al., 2001), de la lutte biologique avec des insectes auxiliaires des cultures (insectes des genres Eretmocerus et Encarsia par exemple pour la lutte contre B. tabaci; Picó et al., 1996) et bien sûr de la lutte chimique à travers des pulvérisations d'insecticides. Toutefois, les emplois répétés d'insecticide favorisent le développement de résistances chez les insectes vecteurs.

5.2. Résistance variétale

Les pratiques culturales et la prophylaxie peuvent aider à contrôler l'apparition ou le développement de la maladie, mais sont en général insuffisantes (Antignus, 2007; Polston et Lapidot, 2007). Une autre méthode plus "simple" à mettre en oeuvre est l'utilisation de variétés résistantes aux virus. Cette méthode est la plus commode et la plus rentable pour le contrôle des maladies virales (Hall, 1980; Yang et al., 2004 ; De Castro, 2005). Elle reste la meilleure stratégie pour assurer une production acceptable en quantité et en qualité. La sélection de plantes naturellement résistantes à la maladie s'effectue par des croisements. Le plus souvent des successions de rétrocroisements sont effectuées entre une variété résistante et une variété sensible présentant des caractères agronomiques intéressants. Les plantes résistantes ayant les meilleures qualités agronomiques issues de ces croisements sont conservées pour être de nouveau croisées avec la variété sensible. Ce processus est répété plusieurs fois jusqu'à l'obtention d'une plante résistante et ayant des qualités agronomiques optimales. La lutte génétique contre les virus en général demeure longue à mettre en oeuvre. Il s'écoule parfois plus de 10 ans entre le moment où l'on découvre une résistance et le moment où cette résistance sera intégrée dans une variété intéressante. Dans certains cas, la résistance est spécifique et sera surmontée par des souches particulières du virus. Il faudra donc créer des variétés multi résistantes (possédant des résistances à plusieurs virus à la fois) pour obtenir une protection optimale des cultures.

CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES

Chapitre II : Matériel et méthodes

Chapitre II: Matériel et méthodes

I. Matériel d'étude

La présente étude s'est déroulée au Burkina Faso et plus précisément au Centre de Recherches Environnementales, Agricoles et de Formation (CREAF) de Kamboinsé. C'est un centre de l'Institut de l'Environnement et de Recherches Agricoles du Centre National de la Recherche Scientifique et Technologique (INERA/CNRST). Il est situé à l'ouest de Ouagadougou sur l'axe Ouagadougou-Kongoussi, à proximité du barrage de Kamboinsé. Les coordonnées géographiques sont les suivantes : latitude 12°28N, longitude 1°32W avec une altitude de 296 m du niveau de la mer. Les travaux de laboratoire ont été effectués au Laboratoire de Virologie et Biotechnologies Végétales (LVBV) dudit centre durant 11 mois (3 septembre 2018 au 3 août 2019). Les 4 zones agroécologiques du Togo, notamment (1) la zone agroécologique de la savane sèche, (2) la zone agroécologique de la savane humide, (3) la zone agroécologique de la forêt et (4) la zone agroécologique du littoral ont servi de sites de prospections et de collectes des échantillons. La prospection et la collecte des échantillons a été faite en juillet 2018 avec l'aide des Techniciens Spécialisés en Production Végétale (TSPV) des Instituts de Conseil et d'Appui Technique (ICAT). Ces techniciens agricoles travaillent pour le compte de l'état et ont pour rôle d'appuyer les producteurs dans leurs activités agricoles. Au total 12 localités (figure 9) à grande production du gombo ont été prospectées.

Chapitre II : Matériel et méthodes

Figure 10: Carte de la zone d'étude montrant les douze (12) localités prospectées (Photo Akakpo, 2019)

Le matériel de laboratoire est constitué principalement des outils du plateau technique du Laboratoire de Virologie et de Biotechnologie Végétale (LVBV) et du Laboratoire Mixte International (LMI) pour les analyses moléculaires. Le matériel de prospection a été composé de fiches d'échantillonnage et de collecte des données, un appareil

Chapitre II : Matériel et méthodes

photo numérique, un GPS (GARMIN 62s), des enveloppes, un stylo à bille, un marqueur et un sac en jute pour le transport des échantillons.

II. Méthodologie

1. Collecte des échantillons

Au total 118 échantillons (tableau IV) de jeunes feuilles (une feuille par échantillon) de gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench) présentant des symptômes caractéristiques d'une infection à Begomovirus (repliement foliaire, enroulement et/ou jaunissement) et des feuilles asymptomatiques ont été collectées. La collecte a été effectuée selon la méthode d'échantillonnage basant sur les diagonales `X' décrite par Sseruwagi et al (2004). Les feuilles échantillonnées ont été photographiées, mises dans des enveloppes et les coordonnées géographiques des localités prospectées ont été notées à l'aide d'un GPS (GARMIN V.62s). Sur chaque enveloppe a été inscrit le nom de la localité, numéro de l'échantillon et les coordonnées géographiques. Les échantillons prélevés ont été convoyés puis séchés à l'étuve à 37°C pendant 5 jours.

Tableau IV : Répartition des échantillons collectés suivant les zones agroécologiques et les localités

Zones agro écologiques	Localités	Nombre d'échantillons					Date de collecte	Référence GPS
		Infectés			Saines	Total
		RH	RB	JN	Saines	Total
Savane sèche	Kantindi	3	3	3	1	10	06/07/2018	N10°54.625/E000°16.353/276m
	Batambouaré	3	2	2	1	8	23/07/2018	N10°49,129/E000°14,359/274m
	Nanergou	3	3	3	1	10	23/02/2018	N10°53.377/E000°15.945/282m
Savane humide	Agbo	3	3	3	1	10	13/07/2018	N07,51363°/E001,14212°/893
	Talo	3	3	3	1	10	13/07/2018	N07,48825°/E001,15353°/822
	Kolokopé	3	3	3	1	10	20/07/2018	N07,40802°/E000,60630°/554
	Anie	3	3	3	1	10	20/07/2018	N07,77417°/E001,22226°/584
Forêt	Kpété-béna	3	3	3	1	10	14/07/2018	N07,42464°/E000,60711°/832
Forêt	Otandjobo	3	3	3	1	10	16/07/2018	N07,42397°/E000,60704°/1492
Littorale	Tsévié	3	3	3	1	10	10/07/2018	N06°26,521/E001°12,179/104m
	Adetikopé	3	3	3	1	10	10/07/2018	N06°18,756/E001°13,512/53m
	Djagble	3	3	3	1	10	10/07/2018	N06°15,046/E001°16,613/23m

RH=Repliement vers le haut ; RB= Repliement vers le bas ; JN=Jaunissement 2. Extraction des ADNs totaux

L'extraction de l'ADN total des échantillons de feuilles de gombo collectées a été réalisée selon le protocole de Doyle et Doyle (1987) modifié pour l'extraction d'ADN au

Chapitre II : Matériel et méthodes

Cétyl Trimétyl Ammonium Bromide (CTAB). Pour ce faire, 20 à 30 mg de feuilles sèches a été pesé à l'aide d'une balance (figure 10 B) et mis dans un tube eppendorf de 2 ml auquel ont été ajoutées 3 billes stériles. Le tube a été ensuite placé sur le portoir du broyeur à bille (figure10, A) pour le broyage pendant 30 s. Cela nous a permis d'obtenir une poudre bien fine. Ensuite, nous avons retiré les billes et y ajouté 1,5 ml du tampon d'extraction CTAB (2% CetylTrimetyl Ammonium Bromide (CTAB), 1,4 M NaCl, 0,2 % beta mercapto éthanol, 20 mM Etylene Diamine Tetra acetic Acid (EDTA) et 100 mM Tris-HCl ou Trizma base, pH8) préchauffé à 60°C au bain-marie. Après vortexage, nous avons incubé l'échantillon à 60°C au bain-marie sous agitation douce (toutes les 10 min) pendant 60 min. Après une centrifugation à 12000 rpm pendant 15 min, 1 ml du surnageant a été prélevé et transféré dans un nouveau tube eppendorf de 2 ml. Un égal volume de mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (CIA ; 24:1) a été ajouté au surnageant suivi d'une agitation douce pendant 5 min. Une deuxième centrifugation à 12000 rpm pendant 15 min a été réalisée en vue de concentrer les phases. Cela pour se débarrasser des débris en suspension dans la phase aqueuse. Après cette opération, 800 tl du surnageant ont été transféré dans un tube eppendorf de 1.5 ml auquel nous avons ajouté 0.8 de volume d'isopropanol (640 tl) pour permettre la précipitation des acides nucléiques. L'échantillon a été ensuite incubé à -20°C pendant 30 min et centrifugé à 12000 rpm pendant 15 min. Le surnageant a été jeté et 500 tl d'éthanol 70% ont été ajouté au culot pour le lavage. Après vortexage, l'échantillon a été laissé à température ambiante pendant au moins 20 min. L'échantillon a été centrifugé une nouvelle fois à 12000 rpm pendant 15 min et l'éthanol a été vidé soigneusement. Nous avons ensuite procédé à un séchage à température ambiante pour éliminer l'éthanol. Les ADNs obtenus ont été suspendus dans 100 ìl d'eau distillée stérile puis gardés à 4°C pour dissoudre les ADNs. Cet ADN total a été dosé au Nanodrop pour vérifier sa qualité (bonne qualité avec un ratio DO260/DO280 ~1,8-2,0) et sa concentration (en ng/tl) puis conservés à -20°C pour les analyses.

Chapitre II : Matériel et méthodes

Figure 11: (A) broyeur à bille (Tissuelyser II) utilisé pour le broyage des échantillons ; (B) balance électronique utilisée pour peser les échantillons (Photo Akakpo, 2019)

Pour l'identification des Begomovirus et des satellites (Betasatellites), nous avons utilisé la PCR conventionnelle avec des amorces dégénérées. L'ADN total extrait a été dilué à 100 ng/ul et a servi de matrice pour l'amplification.

3.1. Amorces utilisées

Les amorces consignées dans le tableau V ont été utilisées pour la détection des Begomovirus et des éventuels ADN Betasatellites dans les échantillons. Le couple d'amorces VD360/CD1266 est spécifique aux gènes codant pour la protéine de la capside (CP) localisés sur l'ADN-A des Begomovirus. Le couple d'amorces Beta01/Beta02 est spécifique d'une région conservée de l'ADN Betasatellite.

Tableau V: Liste des amorces utilisées pour les différentes réactions PCR

Chapitre II : Matériel et méthodes

Les réactions PCR ont été conduites selon les protocoles de Briddon et al. (2002), Bull et al. (2003) et Delatte et al. (2005). Pour les deux couples d'amorcesVD360/CD1266 et Beta01/Beta02, la composition des mix PCR a été conforme aux indications des auteurs ci-dessus et est consignée dans les tableaux VI et VII ci-dessous :

Réactifs	Volume pour une réaction (pd)	Conc. Initiale	Conc. finale
ADN	2
VD360	1	10 uM	0,5 uM
CD1266	1	10 uM	0,5 uM
H2O qsp 20	13
Taq Polymerase (Hot firepol)	3	5U/ul	1U
Vol total mix	20

Réactifs	Volume pour une réaction (pd)	Conc. Initiale	Conc. Finale
ADN	2
Beta 01	1	10 uM	0,5 uM
Beta 02	1	10 uM	0,5 uM
H2O qsp 20	13
Taq Polymerase (Hot firepol)	3	5U/ul	1U
Vol total mix	20

Pour la réalisation de la PCR proprement dite, nous avons utilisé des tubes de 0,2 ml dans lesquels nous avons préparé nos mix PCR composés des éléments listés dans le tableau VI et VII et 5. L'amplification a été effectuée à l'aide d'un thermocycleur (figure 12). Le programme d'amplification était le suivant :

Chapitre II : Matériel et méthodes

94°C pendant 30s pour la dénaturation 55°C pendant 30s pour l'hybridation 72°C pendant 1min pour l'élongation

Figure 12: Thermocycleur 2720 (Applied Bioystems) utilisé pour l'amplification (Photo Akakpo, 2019)

Afin de vérifier l'efficacité des amplifications, les produits de la PCR ont été analysés. À cet effet, un gel d'agarose (sigma grade biologie moléculaire) à 1% (p/v) a été préparé dans du tampon TAE 0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8). La

Chapitre II : Matériel et méthodes

préparation a été faite comme suit : 1 g d'agarose a été additionné à 100 ml de tampon TAE 0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8). Le mélange a été porté au micro-onde afin de solubiliser la solution. 4ul de bromure d'éthydium (BET) ont été incorporées au gel. Le mélange a été coulé sur un support de gel pour l'électrophorèse. Un peigne formé de 13 dents a été préalablement placé sur le support afin de former 13 puits. Le gel a été laissé à température ambiante pour gélification.

4.2. Électrophorèse et visualisation

Après gélification, le gel a été plongé dans une cuve d'électrophorèse contenant du tampon TAE 0,5X (Tris base, acide acétique glacial, EDTA 0,5M pH 8) de sorte à immerger totalement le gel dans la cuve. Une quantité de 12,5 ìl des produits d'amplification a été prélevée à l'aide d'une micropipette et déposée dans les puits du gel d'agarose à 1%. Dans le premier puits, a été déposé le marqueur de poids moléculaire 100 paires de bases DNA ladder (Solis BioDyne) afin de servir de référentiel pour mesurer la taille de nos bandes. L'eau (H2O), un témoin positif constitué de l'ADN du manioc infecté par le ACMV (African cassava mosaic virus) et un témoin négatif constitué de l'ADN du manioc non infecté par un Begomovirus ont été également déposés dans les trois derniers puits. La migration électrophorétique a été faite à 100 volts pendant 35 minutes. La visualisation a été faite à l'aide d'un transilluminateur UV (figure 13).

Figure 13: GEL DOC Major Science (ms) UVDI utilisé pour la visualisation (Photo Akakpo, 2019)

Chapitre II : Matériel et méthodes

Le logiciel Microsoft Excel version 2013 a été utilisé pour les calculs de moyennes, de la prévalence de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo et pour la construction des graphiques. Les pourcentages sont calculés en appliquant la formule suivante :

6.2. Analyses phylogénétiques

Pour mieux comprendre les informations obtenues, différents programmes bioinformatiques ont été utilisés. Les fragments de séquençage appelés "contigs" issus du séquençage, ont été édités et assemblés à l'aide du logiciel Geneious 10.2.3. Après obtention des séquences consensus, l'algorithme BLASTn du site NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) a été utilisé pour la recherche de l'identité des virus par comparaison à des séquences existantes dans des banques de données nucléotidiques (GenBank-EMBL-DDBJ). À travers le même site, nous avions procédé à la recherche de séquences proches des nôtres pour la construction de l'arbre phylogénétique. Le RDP 5.3 a été utilisé pour sélectionner les séquences d'intérêt. Le logiciel MEGA X 10.0.5 a servi à l'alignement des séquences obtenues et à la construction de l'arbre phylogénétique selon la méthode du maximum de vraisemblance (Maximum Likelihood method). Les arbres phylogénétiques ont été construits par le logiciel avec 1000 répétitions de bootstrap. Le logiciel FigTreev1.4.3 a été utilisé pour la visualisation de l'arbre et le logiciel Inkscape 0.92.4 pour l'édition des noms des espèces virales sur l'arbre.

CHAPITRE III : RÉSULTATS ET DISCUSSION

Chapitre III : Résultats et discussion

Chapitre III: Résultats et discussion

I. Résultats

1. Symptômes observés dans les parcelles de production de gombo au Togo

Les prospections des champs de gombo dans les 4 zones agro écologiques du Togo ont permis d'observer divers types de symptômes caractéristiques d'une infection à Begomovirus chez le gombo. Toutes les variétés de gombo rencontrées présentaient des symptômes.

La Figure 14 illustre la diversité des symptômes observés sur le gombo lors des prospections. Les symptômes observés sont des déformations, jaunissements et des enroulements foliaires en forme de cuillères ou des enroulements des feuilles sur elle-même. Dans certains cas les feuilles de gombo sont repliées vers le bas. D'autres plants infectés présentent des nervures épaisses, subissent un rabougrissement avec des feuilles de très petite taille.

Dans l'ensemble, la majorité des champs prospectés étaient infectés à l'exception de quelques champs dont les plants étaient au stade levé.

Chapitre III : Résultats et discussion

Figure14: (B) et (D) plants de gombo avec des feuilles déformées (les feuilles présentent des déformations du limbe avec un épaississement des nervures); (C) enroulement des feuilles de gombo sur elles même (repliement des feuilles sur elle-même vers le haut ou vers le bas avec rabougrissement du plant); (A) et (F) feuilles de gombo en formes de cuillères (une forme de repliement des feuilles vers le haut en forme d'une cuillère accompagné parfois de petites déformations du limbe); (E) feuilles

Chapitre III : Résultats et discussion

de gombo présentant des jaunissements (feuilles présentant de petites tâches chlorotiques (jaune) en mosaïque sur le limbe) . (Photo Akakpo, 2018)

2. Évaluation de la prévalence de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo au Togo

L'évaluation de la prévalence de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo au Togo a été faite en considérant les 4 zones agro- écologiques du Togo. Pour se faire, un total de 118 échantillons de feuilles de gombo (symptomatiques et asymptomatiques) a été collecté dans 12 localités (Kantindi, Batambouaré, Nanergou, Agbo, Talo, Kolokopé, Anié, Kpété-béna, Otandjobo, Tsévié, Adetikopé, Djagblé) appartenant à ces 4 zones agroécologiques qui sont : la zone littorale, la zone forestière, la savane humide et la savane sèche. La maladie a été identifiée dans toutes les localités. Les analyses statistiques des résultats obtenus après analyses révèlent que la prévalence de cette maladie au Togo varie d'une localité à une autre ainsi que d'une zone agroécologique à une autre. Elle est de l'ordre de 60% dans la zone forestière, 53,33% dans la zone littorale, 50% dans la savane humide et 64,29% dans la savane sèche (tableau VIII). Sur le plan national, la prévalence moyenne de la maladie était de 56,91%.

Tableau VIII: Prévalences de la maladie dans les quatre zones agroécologiques

3. Caractérisation moléculaire des espèces virales associées à la maladie de l'enroulement foliaire du gombo

3.1. Amplification du gène de la protéine capsidiale par la PCR

L'analyse moléculaire a consisté à faire une amplification du gène de la protéine capsidiale (CP), utilisé comme le marqueur de diversité chez les Begomovirus. La Figure 15 illustre les résultats d'amplification du gène de la CP (protéine capsidiale) en utilisant les couples d'amorces VD 360/CD 1266. L'amplification a permis d'obtenir une bande d'environ 906 paires de bases pour les différents échantillons suspectés d'infection à Begomovirus. Ce test a permis de détecter 66 échantillons positifs sur 118 échantillons collectés (tableau IX).

Chapitre III : Résultats et discussion

Figure15 : Gel d'électrophorèse présentant les produits d'amplification du gène de la CP (fragments attendus de 906 paires de bases) sur gel d'agarose à 1%. 100pb = marqueur de taille DNA ladder, 1 ; 5 ; 7 ; 8 ; 9 ; 85 ; 86 ; 87 ; 91 = échantillons positifs, C+= témoin positif (échantillon positif à l'ACMV,African cassava mosaic virus), C-=témoin négatif (échantillon Begomovirus négatif), H2O=Contrôle eau.

Tableau IX: Récapitulatif des résultats PCR par zone agro-écologique et par localité

Zone agro-écologique Ville/village Coordonnées_GPS Code_éch symptômes Résultats_PCR

Littorale

Adetikope N06°18,447/E001°14,172 61AK Saine -

Adetikope 62AK JN +

Adetikope 63AK JN +

Adetikope 64AK JN +

Adetikope 65AK RH +

Adetikope 66AK RH -

Adetikope 67AK RH +

Adetikope 68AK RB -

Adetikope 69AK RB +

Adetikope 70AK RB -

Tsevie N06°26,521/E001°12,179 91AK RB +

Tsevie 92AK RB -

Tsevie 93AK RH +

Tsevie 94AK RH +

Tsevie 95AK RH +

Tsevie 96AK JN +

Tsevie 97AK JN +

Tsevie 98AK JN +

Tsevie 99AK saine -

Tsevie 100AK RB -

Djagble N06°15,046/E001°16,613 101AK saine -

Djagble 102AK RH +

Djagble 103AK RH -

			*Chapitre III : Résultats et discussion*

Zone agro-écologique	Ville/village	Coordonnées_GPS	Code_éch	symptômes	Résultats_PCR
	Djagble Djagble Djagble Djagble Djagble Djagble Djagble		104AK 105AK 106AK 107AK 108AK 109AK 110AK	RH JN JN JN RB RB RB	+ + - - - - -
Forêt	Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Kpété-béna Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo Otandjobo	N07,42464°/E000,60711° N07,42397°/E000,60704°	1AK 2AK 3AK 4AK 5AK 6AK 7AK 8AK 9AK 10AK 41AK 42AK 43AK 44AK 45AK 46AK 47AK 48AK 49AK 50AK	RH Saine RB RB RB JN JN JN RH RH Saine RH RH RH JN JN JN RB RB RB	+ - + + + + + + + - + - - - + - + + - -
Savane humide	Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Agbo Talo Talo Talo Talo Talo Talo Talo Talo Talo	N07,51363°/E001,14212° N07,48825°/E001,15353°	71AK 72AK 73AK 74AK 75AK 76AK 77AK 78AK 79AK 80AK 51AK 52AK 53AK 54AK 55AK 56AK 57AK 58AK 59AK	Saine RB RB RB JN JN JN RH RH RH Saine RB RB RB RH RH RH JN JN	- - - + - - - + - - + - + + + - - - -

Chapitre III : Résultats et discussion

Zone agro-écologique Ville/village Coordonnées_GPS Code_éch symptômes Résultats_PCR

Savane sèche

Batambouare N10°49,129/E000°14,359 111AK RH -

Batambouare 112AK RH -

Batambouare 113AK RH +

Batambouare 114AK RB -

Batambouare 115AK RB +

Batambouare 116AK JN +

Batambouare 117AK Saine +

Batambouare 118AK JN +

Kantindi N10°54,176/E000°19,453 11AK RH -

Kantindi 12AK RH -

Kantindi 13AK RH +

Kantindi 14AK RB +

Kantindi 15AK RB +

Kantindi 16AK RB +

Kantindi 17AK JN -

Kantindi 18AK JN +

Kantindi 19AK JN +

Kantindi 20AK Saine +

Nanergou N10°53.377/E000°15.945 31AK RB -

Nanergou 32AK RB -

Nanergou 33AK RB +

Nanergou 34AK RH -

Nanergou 35AK RH +

Nanergou 36AK RH +

Nanergou 37AK Saine +

Chapitre III : Résultats et discussion

RH : repliement vers le haut ; RB : repliement vers le bas ; JN : jaunissement

3.2. Amplification des â satellites

Afin de vérifier une éventuelle association des Begomovirus détectés avec le â satellite, une amplification a été conduite sur les 66 isolats positifs. Cette amplification a permis de détecter la présence de â satellite dans 25 isolats sur 66 isolats soit 37,88%. La Figure 16 illustre les résultats d'amplification des â satellites en utilisant les couples d'amorces Beta01/Beta02. La bande attendue d'environ 1400 nucléotides a été obtenue dans certains échantillons avec succès.

Figure 15 : Electrophorèse des produits d'amplification des â satellites (fragments attendus de 1400 paires de bases) sur gel d'agarose à 1%. 100 paires de bases = marqueur de taille DNA ladder. 36 ; 37 ; 39 ; 40 ; 41 ; 54 sont positifs.

3.3. Séquençage des produits PCR du gène de la protéine capsidiale

Le séquençage des produits PCR a permis d'avoir l'identité des différentes espèces de Begomovirus infectant le gombo au Togo. En effet, les produits du séquençage ont permis d'obtenir des séquences dites partielles, car concernant seulement le gène de la protéine de capside (CP) des virus détectés. Au total neuf (9) séquences ont été obtenues avec succès après éditions et assemblages des contigs issus des produits de séquençage. Cela a permis de générer neuf (9) séquences virales que sont : 5AK, 6AK, 28AK, 39AK, 47AK, 62AK, 85AK, 93AK, 118AK. Ces séquences partielles soumises aux bases de données génomiques (NCBI, EMBL et DDBJ) à l'aide de l'algorithme BLAST ont révélé l'identité des différents Begomovirus infectant le gombo au Togo. Les « Blast search » ont révélé que les séquences

Chapitre III : Résultats et discussion

du Togo sont très proches de deux espèces de Begomovirus. Il s'agit du Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) et du Okra yellow crinkle virus (OYCrV). Les pourcentages d'homologie entre les isolats de Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) du Togo sont compris entre 88,71% et 96,56% avec CLCuGeV-Burkina Faso (FN554528), CLCuGeV - Niger (FJ469627). Les isolats de Okra yellow crinkle virus (OYCrV) du Togo quant à eux ont entre 86,52% et 97,70% d'identité nucléotique avec des isolats de Okra yellow crinkle virus (OYCrV) de la Côte d'Ivoire (KX100572), du Mali (EU024118) et du Cameroun (FM164724).

4. Diversité des virus responsables de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo au Togo

Afin d'apprécier la diversité des espèces de Begomovirus obtenues après identification, une analyse phylogénétique a été conduite. L'arbre phylogénétique a été construit selon la méthode dite du «Maximum likelihood» avec 1000 répétitions de bootstrap. L'isolat MaLCV-[CN:Fuj:06] (FJ712189) a été utilisé comme racine de l'arbre. Ainsi, la topologie de l'arbre phylogénique construite à partir des 9 isolats du Togo a permis de confirmer cette proximité des isolats du Togo avec les deux espèces virales susmentionnées. Parmi les neuf (9) isolats, 7 ont formé un groupe homogène (bootstrap égale à 100) avec des souches de Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) du Burkina Faso, du Niger et du Nigeria. Les 2 autres souches forment un groupe homogène (bootstrap égale à 100) avec des souches de Okra yellow crinkle virus (OYCrV) du Mali, de la Côte d'Ivoire et du Cameroun (figure 16 A).

L'alignement des séquences réalisé par la méthode des distances a permis de comparer les séquences deux à deux et de faire ressortir les similitudes entre elles. La figure 16 B présente les similitudes entre les séquences de la CP des isolats caractérisés et ceux existant dans la banque de données génomiques GenBank. Ces résultats mettent en évidence une divergence nucléotidique assez variable entre les différentes séquences.

Chapitre III : Résultats et discussion

Figure16: (A) : Arbre phylogénique généré à partir des séquences de CP des CLCuGeV, OYCrV du Togo et d'autres Begomovirus existant dans le GenBank. L'arbre a été construit selon la méthode dite du «Maximum likelihood» avec 1000 répétitions de bootstrap dont les pourcentages sont indiqués aux différents noeuds. (B) : Matrice d'identité des 9 isolats par rapport aux autres isolats recueillis sur GenBank.

Chapitre III : Résultats et discussion

II. Discussion

Le gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench), de par son importance nutritionnelle et économique constitue l'un des légumes les plus cultivés en Afrique. Au Togo il est cultivé durant toute l'année sur presque toute l'étendue du territoire. Cependant, force est de constater que la production de ce légume en Afrique de façon générale et particulièrement au Togo est confrontée à un certain nombre de contraintes occasionnant des pertes importantes de rendement. Parmi ces contraintes, figure en bonne place la maladie de l'enroulement foliaire du gombo (OLCD). Cette maladie induisant des symptômes de repliements foliaires est fréquemment observée sur le gombo ces dernières années au Togo tout comme dans plusieurs pays de l'Afrique de l'Ouest. Aussi c'est un légume longtemps délaissé par la recherche et considéré comme « culture de femme » dans la plupart des pays dans lesquels il est cultivé.

Dans le but d'identifier les espèces virales associées à cette maladie et leur diversité au Togo, des travaux de caractérisation moléculaire ont été menés sur 118 échantillons de feuilles de gombo (symptomatiques et asymptomatiques) collectés dans les 4 zones agro écologiques (Foret, littoral, savane humide et savane sèche) du Togo. Au total 12 localités à grande production ont été prospectées. Divers symptômes caractéristiques d'une infection à Begomovirus ont été observés sur la plupart des parcelles prospectées. Bien que l'observation des symptômes soit utile pour l'identification de la maladie de l'enroulement foliaire du gombo, elle n'est pas appropriée pour déterminer des espèces virales responsables de l'OLCD. Ainsi les ADNs totaux des échantillons ont été extraits et soumis à un diagnostic moléculaire par PCR (Polymerase Chain Reaction) conventionnelle à l'aide d'une amorce dégénérée (VD 360/CD 1266) (Dellate et al., 2005) spécifique au gène codant pour la protéine de capside (CP) des Begomovirus. La CP a été amplifié avec succès à partir de certains échantillons (65/118). Ce couple d'amorces semblerait le mieux adapté à la détection moléculaire des Begomovirus en Afrique de l'Ouest. Les résultats obtenus ont permis d'associer les divers symptômes observés au groupe des Begomovirus, corroborant ainsi les travaux antérieurs portant sur le OLCD dans certains pays de l'Afrique de l'Ouest dont le Burkina Faso (Barro et al., 2007 ; Konaté et al., 1995 ; Tiendrébéogo et al., 2010), la Côte d'Ivoire (Séka et al., 2016 ), le Niger (Shih et al., 2009 ), le Mali (Kon et al., 2009), le Ghana (Swanson et Harrison, 1993), le Nigéria (Swanson et Harrison, 1993) et du centre comme le Cameroun (Leke et al., 2007) et le Tchad (Swanson et Harrison, 1993). Afin de déterminer les espèces de Begomovirus responsables, un séquençage s'avérait nécessaire. À cet effet, les

Chapitre III : Résultats et discussion

produits PCR de 12 échantillons (3 par zone agro écologique) ont été séquencés (par Macrogen Europe). Après séquençage, 9 produits de séquençage étaient exploitables. L'analyse des neuf (9) séquences obtenues a révélé une identité élevée avec deux espèces virales ; le Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) et le Okra yellow crinkle virus (OYCrV). C'est la première fois que ces 2 espèces virales ont été identifiées sur le gombo au Togo. Le Okra yellow crinkle virus (OYCrV) a été décrit pour la première fois en Afrique de l'Ouest au Mali (Shih et al., 2007; Kon et al., 2009), puis quelques années après en Côte d'Ivoire (Séka et al., 2016). Le Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) quant à lui, il a été identifié à la base au Soudan (Idris et Brown, 2002, 2005) puis par la suite au Niger (Shih et al., 2009), au Burkina Faso (Tiendrébéogo et al., 2010) et en Côte d'Ivoire (Séka et al., 2016) sur le gombo. Il a été également associé à la maladie de l'enroulement foliaire du cotonnier (Gossypium sp. L.) au Soudan (Idris et al., 2000), en Inde (Sohrab et al., 2014) et au Pakistan (Iqbal et al., 2014 ). Au regard de la dynamique de ces deux espèces virales dans la sous-région ouest-africaine ces dernières années, leur découverte au Togo n'est pas surprenante. La propagation de ces virus pourrait s'expliquer par la dissémination des populations de mouche blanche qui constituent les principaux vecteurs. Notre étude a montré que le CLCuGeV est majoritaire et se retrouve dans les 4 zones agro écologiques comparativement à OYCrV qui a été identifié que dans deux zones agro écologiques (Littoral et Savane sèche). Ces résultats montrent que cette maladie est méconnue au Togo. L'impact du Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) sur le rendement (nombre de fruits par plante, longueur, diamètre et poids du fruit) a été évalué au Burkina Faso sur quatre accessions de gombo (cultivar local,`Man Yanga') et quatre cultivars commerciaux (Clemson spineless, Indiana, Lima et Volta) auchamp en 2007 et 2008 (Tiendrébéogo et al., 2010). Des pertes de rendement importantes ont été observées pour le cultivar local (26-55%) comparativement aux cultivars commerciaux (4,4-9,6%). Ces pertes ont été estimées économiquement à 11100 et 1950 dollars à l'hectare, respectivement chez le cultivar local et les cultivars commerciaux. Ainsi, la présence de ces deux espèces virales (CLCuGeV et OYCrV) constituerait un véritable problème non seulement pour la production du gombo, mais aussi pour celle du coton au Togo comme les autres pays producteurs du coton en Afrique de l'Ouest notamment : le Burkina Faso, le Bénin, la Côte d'Ivoire, le Mali et le Sénégal. Pour cela, des mesures rigoureuses doivent être prises en vue d'un contrôle efficace de la propagation de ces virus afin de sécuriser durablement la culture du gombo et celle du coton dont l'exportation contribue considérablement au PIB des différents pays producteurs.

CONCLUSION, RECOMMANDATIONS

Conclusion, recommandations et perspectives

Conclusion

Première du genre au Togo, cette étude a été conduite au Burkina Faso au Centre de Recherches Environnementales, Agricoles et de Formation de Kamboinsé (CREAF/K) de l'Institut de l'Environnement et de Recherches Agricoles (INERA). L'objectif était d'évaluer la diversité des Begomovirus infectant le gombo au Togo. La prospection et la collecte des échantillons ont été effectuées dans les 4 zones agroécologiques. Cependant, divers symptômes ont été observés : déformation, enroulement et jaunissement des feuilles. L'analyse moléculaire effectuée sur la base du gène codant pour la protéine de capside (CP) a permis d'associer 2 espèces de Begomovirus à la maladie de l'enroulement foliaire du gombo au Togo. Il s'agit du Cotton leaf curl Gezira virus (CLCuGeV) et du Okra yellow crinkle virus (OYCrV). Le CLCuGeV a été retrouvé dans toutes les zones prospectées tandis que OYCrV quant à lui, a été identifié que dans le littoral et la savane sèche. Cette caractérisation a permis non seulement de connaitre la diversité génétique de ces 2 espèces virales, mais également de déterminer leur répartition géographique. Toutefois ces deux espèces virales constituent une menace pour la culture du gombo et du coton au Togo tout comme dans les autres pays de l'Afrique de l'Ouest. Ainsi, des mesures de contrôle s'avèrent indispensables pour contrer la propagation de ces virus afin d'accroitre les rendements de la production du gombo et celle du coton.

Au vu des résultats obtenus dans cette étude, les recommandations suivantes peuvent être formulées à l'endroit du Ministère de l'Agriculture, de la Production Animale et Halieutique (MAPAH):

? D'accorder une importance particulière aux deux espèces virales identifiées afin de sécuriser durablement la culture du gombo et du coton au Togo.

? De renforcer la capacité des agents techniques d'agriculture sur la reconnaissance des symptômes et les stratégies de lutte contre ces virus à travers des ateliers de formation. Ces derniers pourraient donc accompagner les producteurs dans la mise en oeuvre de ces stratégies.

Tout cela, afin d'intensifier la production du gombo et celle du coton au Togo et partant de là à lutter contre l'insécurité alimentaire tout en améliorant les conditions de vie des producteurs.

Conclusion, recommandations et perspectives

Le travail réalisé dans le cadre de ce mémoire est loin d'être exhaustif. Afin de prendre en compte de façon exhaustive toute la diversité de ces espèces virales au Togo, il serait judicieux de :(i) poursuivre les travaux de caractérisation moléculaire sur un grand nombre d'échantillons collectés aussi bien sur le gombo que sur le cotonnier. Cela permettra de mieux appréhender la diversité des deux espèces virales dans les différentes régions du pays. (ii) Faire une RCA (Rolling Circle Amplification) et un clonage des deux virus identifiés afin d'obtenir leur génome complet. Cela nous renseignera davantage sur l'identité réelle de ces virus et nous permettra d'avoir une taxonomie définitive. Aussi, il serait intéressant d'étendre l'étude sur d'autres cultures comme les cultures maraichères (Tomate, poivron, piment, etc.), les fruitiers et les mauvaises herbes. Tous ces travaux permettront d'obtenir des informations scientifiques à l'endroit des producteurs et des décideurs politiques pour une agriculture durable et plus rentable.

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ANNEXES

Annexes

Annexe 1:Procédure d'extraction des ADNs

Annexes

Annexe 2:Procédure de préparation du gel et de la migration électrophorétique des ADN amplifiés par PCR

Annexe 3:Préparation des Mix et programmes PCR ? Composition du Mix de détection des virus

				*Annexes*

Réactifs	Volume pour une réaction (ìl)	Conc. initiale		Conc. Finale
ADN	2
VD360	1	10 uM		0,5 uM
CD1266	1	10 uM		0,5 uM
H2O qsp20	13
Taq Polymerase (Hot firepol)	3	5U/ul		1U
Vol total mix	20
V' Composition du Mix de détection des Betasatellites
Réactifs	Volume pour une réaction (ìl)		Conc. initiale		Conc. finale
ADN	2
Beta 01	1		10 uM		0,5 uM
Beta 02	1		10 uM		0,5 uM
H2O qsp20	13
Taq Polymerase (Hot firepol)	3		5U/ul		1U
Vol total mix	20
V' Composition du Mix pour l'amplification des isolats à séquencer
Réactifs	Volume pour une réaction (ìl)		Conc. initiale		Conc. finale
ADN	2
Beta 01	1		10 uM		0,5 uM
Beta 02	1		10 uM		0,5 uM
H2O qsp20	13
Taq Polymerase (Hot firepol)	3		5U/ul		1U
Vol total mix	20

Annexes

Annexe 4: Composition de quelques tampons utilisés

Ajuster à pH 8,5 avant de mélanger 10 ml de TAE 50X avec 990 ml d'eau distillée pour les électrophorèses.