Développement d'une technologie en bactériologie : l'aromatogramme

ANNEXE X : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE HEKTOEN, BIO-

RAD

HEKTOEN REF 54386

REF I 63894 IR&I 64284

MILIEU D' ISOLEMENT SELECTIF DES SALMONELLA SP. ET SHIGELLA SP.

IVD		CE
	2014104

1- APPLICATION

La gélose Hektoen est un milieu sélectif pour l'isolement et la différenciation des bacilles Gram (-) entéropathogènes, en particulier les Salmonelles sp. et les Shigella sp.

2- PRINCIPE

La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence de sels biliaires, de bleu de bromothymol et de fuchsine acide (inhibition des bactéries à Gram (+), des E cou et dans une moindre mesure, des Proteus et des Citrobacter).

La qualité nutritive des peptones et des sucres neutralise l'effet inhibiteur des sels biliaires vis à vis de certaines bactéries délicates et permet une bonne culture des Shigefla.

La différenciation des entérobactéries est basée sur leur capacité à fermenter différents sucres : le lactose, le saccharose, la salicine. Deux indicateurs permettent de visualiser la réaction : le bleu de bromothymol qui vire au jaune en présence d'acide et la fuchsine qui se colore en rouge en présence d'aldéhyde.

Une différenciation supplémentaire reposant sur la production d'hydrogène sulfuré est possible grace à la présence de thiosulfate de sodium et de citrate de fer. Elle se traduit par des colonies à centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer.

3- PRESENTATION.

· Milieu prêt à l'emploi :

- coffret de 20 boites de Petri (90 mm) (HEKT) code 63894

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir)

- 6 flacons de 100 ml (HEKT) code 54386

· Milieu déshydraté

- Flacon de 500g code 64284

4- COMPOSITION THEORIQUE (en gll d'eau distillée) Le milieu Hektoen est préparé selon la formule décrite par S. Kings et al (1).

Protéose peptone		12	Extrait de levure
3		Chlorure de sodium
5		Thiosulfate de sodium
5		Sels biliaires
9		Citrate de fer ammoniacal
1,5		Salicine
2		Lactose
12		Saccharose
12		Fuchsine acide
0,1		Bleu de bromothymol
0,065		Agar
14		pH final
7,5 #177; 0,2

Préparation du milieu :

Homogénéiser la poudre contenue dans le flacon.

Mettre 75 grammes de milieu déshydraté dans un litre d'eau fraîchement distillée. Chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu'à dissolution complète. Laisser refroidir à 50°C avant répartition en boites de Petri ou en flacon. Précaution d'utilisation : NE PAS AUTOCLAVER.

5- CONSERVATION

· Milieu prêt à l'emploi : à +2-8°C

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir) : à +2-8T

· Milieu déshydraté : flacon soigneusement fermé dans un endroit sec à +15-25°C. La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le conditionnement.

1

46

6- UTILISATION

Matériel :

· Matériel fourni : milieu Hektoen.

Ensemencement:

Ensemencer en stries à partir de l'échantillon à étudier (suspension de selles ou écouvillon). Pour la conservation des échantillons biologiques, se référer aux recommandations en vigueur (2).

Incubation :

Incuber pendant 24-48 heures à 37°C.

Lecture :

La fermentation d'au moins un des sucres se traduit par une coloration "saumon" des colonies. L'absence de fermentation se traduit par une coloration bleue ou verte des colonies.

La production d'hydrogène sulfuré (H2S) est caractérisée par des colonies à centre noir.

· Colonies "saumon" : Escherichta, Levinea, Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Yersinia.

· Colonies "saumon" à centre noir : Proteus vulgaris.

- Colonies bleues-vertes ou vertes : suspicion de Shigefla ou de Salmonella à différencier de Proteus morganti ou rettgeri de Providencia, Hafnia, Levinea, Plesiomonas, Pseudomonas (le test de l'oxydase permet de différencier les Pseudomonas).

· Colonies bleues-vertes ou vertes à centre noir : suspicion de Salmonella ou de Proteus mirabilis (la recherche de l'uréase permet de différencier P. mirabilis).

7- PERFORMANCES f CONTROLE QUALITE DU TEST - Aspect du milieu prêt à l'emploi : gélose limpide verte - Aspect du milieu déshydraté : poudre rosée

· Les performances culturales du milieu Hektoen sont contrôlées à l'aide des souches suivantes :

SOUCHES	RESULTAT DE LA CULTURE EN 24-48h à 37°C
Escherichta colt ATCC 25922	Colonies saumon, inhibition partielle
Enterobacter aerogens ATCC 13048	Colonies saumon
Shigella tfexnert ATCC 12022	Colonies vertes
Shigella sonnet ATCC 25931	Colonies vertes
Proteus mirabilis ATCC 25933	Colonies bleues-vertes à centre noir
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Inhibition totale

8- CONTROLE QUALITE DU FABRICANT

Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

9- LIMITES D'UTILISATION

· Certaines Salmonella arizonae, Shigella sonnet et Vibrio cholerae peuvent se développer en colonies jaunes rosées.

· Les Pseudomonas peuvent se développer en petites colonies brunes et bleuàtres.

· II est nécessaire de faire des tests complémentaires pour une identification d'espèce de la souche isolée.

10- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Kings S. et al, 1968. A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. IL Comparison of hektoen enteric agar with SS and EMB agar. Appl. Microbiol. 16 : p.577-578.

2. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva.1991. 1st edition.

3. TAYLOR W.I et al, 1971. Appl Microbial. 21 : p.32-37.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel_ : [phone] Fax : [phone] www.bio-rad.com		CE 2014/04

47

ANNEXE XI : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE MUELLER-HINTON, BIO-RAD

MUELLER - HINTON 56137 - 63824 - 63901 - 64884 - 64888

MUELLER-HINTON + SANG DE MOUTON 63825 - 63902

MUELLER-HINTON + SANG DE CHEVAL + I3-NAD 63524

MILIEU DE CULTURE POUR L'ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS

IVD

1- APPLICATION

La gélose Mueller--Hinton est un milieu solide standardisé recommandé pour l'étude de la sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion ou de dilution en gélose_

2- PRINCIPE

La standardisation du milieu de Mueller-Hinton est nécessaire pour obtenir des résultats fiables au niveau de l'antibiogramme.

Celle-ci concerne la composition du milieu avec des concentrations limites de CaCl2, MgCl2 et ZnClz.

2+ 2+

En effet, il est reconnu que des variations dans les concentrations de cations Mg et Ça affectent les résultats obtenus (diamètres et concentrations minimales inhibitrices ou C.MJ.) sur les Pseudomonas aeruginosa avec les aminosides et sur les staphylocoques avec la tétracycline ra, 4, s, 6y

De plus, la faible teneur en thymidine diminue les phénomènes de repousse autour des disques de fiméthopnme-sulfamides et de tnméthopnme seul.

3- PRESENTATION

· Milieu prêt à l'emploi

- coffret de 20 bottes de Petri rondes (90 mm) (MH) code 63824

- coffret de 10 boites de Petri carrées (120 mm) (MH) code 63901

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir)

- 6 flacons de 200 ml (MH) code 56137

·

code 64884

Milieu déshydraté :

- flacon de 500 g

- fût de 5 kg code 64888

· Milieu au sang de mouton prêt à l'emploi :

- coffret de 20 boîtes de Petri rondes (90 mm) (MHB) code 63825

- coffret de 10 boites de Petri canées (120 mm) (MHB) code 63902

· Milieu au sang de cheval additionné de 13-NAD prêt à remploi

coffret de 20 boites de Petri rondes (90 mm) (MHF) code 63524

4-COMPOSITION THEORIQUE (en g!I d'eau distillée)'

Le milieu Mueller-Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval est préparé selon la formule décrite par W.H.O.

Peptones		3,0	Hydrolysat de caséine
17,5		Agar
15		Ca^z+
20 - 25 mg1L		Mg^t-.
10 - 12,5 mgfL		pH final
7,4 #177; 0,2		Suppléments : + 5% sang de mouton (pour le milieu MHB) ou 5% sang de cheval (pour le milieu MHF)
		13-NAD (pour le milieu MHF)
20 mgfL

p-NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

formule adaptée pour assurer les meilleures performances du milieu.

Préparation du milieu :

Homogénéiser la poudre contenue dans le flacon.

Mettre 35 grammes de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau fraichement distillée. Porter à ébullition jusqu'à dissolution complète

1

BIO RAD

48

Stériliser à l'autoclave i 121°C + 1°C pendant 15 minutes. Répartir dans des tubes ou dans des flacons stériles_

Au moment de l'emploi, faire tondre le milieu au bain-mane bouillant et répartir en bodes de Petri rondes l'intégralité du flacon ou des tubes. L'épaisseur de la couche de gélose doit être de 4 mm. Sécher les boites 30 min à 37°C. Le volume de Mueller-Hinton permettant d'obtenir exactement une épaisseur de 4 mm est de 25 ml pour une boite de 90 mm, de 60 ml pour une boite carrée de 120 mm, de 70 ml pour une boite ronde de 150 mm.

Au moment de l'emploi (avant la répartition), il est possible d'ajouter :

· 5 % de sang de mouton ou de cheval pour le milieu Mueller-Hinton au sang,

· 5 % de chlorure de sodium (NaCI) pour le milieu Mueller-Hinton hypersalé_

5- CONSERVATION

· Milieu prêt à l'emploi : à +2-20°C

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir) à +2-25°C

· Milieu au sang pré! A l'emploi à +2-8°C

· Milieu déshydraté : tacon soigneusement fermé dans un endroit sec à +15-25°C_ La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le conditionnement.

6- UTILISATION

Matériel :

Matériel fourni : Milieu Mueller-Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval Matériel spécifique non fourni :

· Témoin d'opacité équivalent au standard Mac Farland 0.5

· Matériel de laboratoire nécessaire pour la réalisation des antibiogrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé.

Précautions d'utilisation : Suivre les instructions d'utilisation des recommandations en vigueur CLSI ^4,e, CA-SFM ^{91, EUCAST ^(1°11.12r. Observer à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matière de protection contre les dangers microbiologiques.

Ensemencement :

A partir d'une culture pure et fraiche prélevée sur milieu gélosé, préparer une suspension d'une opacité équivalente au standard de Mac Farland 0,5. Le protocole de standardisation de l'inoculum est décrit dans les différentes recommandations émises par le CLSI, le CA-SFM ou l'EUCAST pour la méthode en diffusion et la méthode de dilution en gélose.

Si le milieu est conservé à 4°C, le ramener à température ambiante (18-30°C)

Si un excès d'humidité est observé en surface, il est conseillé, avant utilisation, de sécher les boites pendant 10 à 30 min à l'étuve à 35°C_

METHODE EN DIFFUSION

Ensemencement par inondation (méthode préconisée par le CA-SFM)

A partir de l'inoculum standardisé, suivre la procédure indiquée par le CA-SFM concernant la dilution de la suspension initiale

en fonction des espèces bactériennes testées

Inonder la boite entière avec la suspension obtenue puis enlever l'excès de suspension_

Ensemencement par écouvillonnage (méthode de Kirby-Bauer préconisée par le CLSI, le CA-SFM ou l'EUCAST) : A partir de l'inoculum standardisé, suivre les recommandations du CLSI pour ensemencer la boite

· Plonger un écouvillon stérile, non toxique dans la suspension

· L'essorer doucement sur les parois.

· Ensemencer la boite à l'aide de l'écouvillon afin d'obtenir une culture de colonies confluantes_ Appliquer les disques à l'aide d'un distributeur ou à la pince en appuyant légèrement.

METHODE DE DILUTION EN GELOSE

L'ensemencement et le protocole opératoire sont détaillés dans les recommandations du CLSI et du CA-SFM.

Incubation :

Suivre les recommandations en vigueur du CLSI ou du CA-SFM ou de l'EUCAST. Les conditions d'incubation varient selon l'espèce bactérienne testée.

7-INTERPRETATION DES RESULTATS

L'interprétation du test de sensibilité aux antibiotiques selon la méthode des disques ou la méthode de dilution en gélose est détaillée dans les mises A jour périodiques du CASFM, du CLSI ou de l'EUCAST.

8- PERFORMANCES I CONTROLE QUALITE DU TEST

· Aspect du milieu Mueller-Hinton prêt à l'emploi : gélose limpide à opalescente, ambrée.

· Aspect du milieu Mueller-Hinton déshydraté : poudre beige

· Aspect du milieu Mueller-Hinton + sang prêt à l'emploi : gélose rouge_

·	2
1310 RAD

49

Les performances culturales du milieu Mueller Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval sont contrôlées à l'aide des souches suivantes :

SOUCHES	RÉSULTAT DE LA CULTURE EN 24 H à 37°C
Escherichia coltATCC 259221 CIP 7624	Culture correcte
Pseudomonas aeruginosa ATCC 278531 CIP76110	Culture correcte
Staphylococcus aureus ATCC 259231 CIP 7625	Culture correcte
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619	Culture correcte
Haemophifus intluenzae NCTC 84681 CIP 54.94	Culture correcte

Le contrôle de la composition du milieu MH s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive):

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Escherichia cari ATCC 259221 CIP 7624 - Amikacine 30 pg - Ampicilline 10 pg - Tetracycline 30 pg	Diamètres d'inhibition conformes aux normes en vigueur (CLSI et/ou CA-SFM) ")
Staphylococcus aureus ATCC 25923 i CIP 7625 - Amikacine 30 pg - Cefalotine 30 pg - Tetracycline 30 pg
Pseudomonas aeruginosa ATCC 278531 CIP 76110 - Amikacine 30 pg - Cefotaxime 30 pg - Ciprofloxacine 5 pg

Le contrôle de la composition du milieu MHB s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive) :

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Erythromycine 15 pg - Penicilline 10 UI - Tetracycline 30pg	Diamètres d'inhibition conformes aux normes CLSI en vigueur °.
aeruginosa aeruginosa ATCC 27853 / CIP 76110 - Amikacine 30 pg - Cefotaxime 30 pg - Ciprofloxacine 5 pg

Le contrôle de la composition du milieu MHF s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive) :

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Haemophifus intluenzae NCTC 8468 f CIP 54.94 - Ampicilline 2 pg - Cefaclor 30 pg - Tetracycline 30 pg	Diamètres d'inhibition conformesz1 aux normes EUCAST en vigueur
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Erythromycine 15 pg - Norfloxacin 10 pg - Rifampin 5 pg - Tetracycline 30 pg

9-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT

Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

3

10- LIMITES D'UTILISATION

Il est indispensable de procéder à partir de cultures pures et fraîches sous peine de faux résultats_

Certaines bactéries peuvent ne pas se développer sur le milieu MH du fait de leurs exigences nutritionnelles_ II est alors recommandé d'utiliser un milieu approprié HTM pour Haemophilus, Mueller-Hinton additionné de 5% de sang de mouton pour Streptococcus poeumonfae et les streptocoques 13 hémolytiques, GC agar pour Neisseria gonorrhoae_ Ces recommandations sont bien décrites dans les différents référentiels CLSI, CASFM ou EUCAST_

Un certain nombre de facteurs peuvent affecter les résultats (taille de l'inoculum, durée et atmosphère d'incubation _-)_ Il est donc impératif de respecter le protocole décrit dans la procédure en vigueur (CLSI, CASFM, EUCAST._.).

Le milieu Mueller-Hinton au sang frais n'est pas recommandé pour tester la sensibilité de S_ pneumoniae au cotrimoxazole en

11- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1981. Technical report series 673 (Révision 1981) W_H_O_, Geneva - p156-192_

2- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization_ 1992. Technical report series 822 W_H d_, Geneva

3- Casillas, E,Kenny, M.A., Minshew B.H., Schoenknecht, F. 1981. Effect of ionized calcium and soluble magnesium on the predictability of the performance of Mueller-Hinton agar susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa with Gentamicin. Antimicrob_ Agents Chemother_ 79987-992_

4- Murray, P_R_ Zeitinger, J_ R 1981 Evaluation of Mueller-Hinton agar for disk diffusion susceptibility tests J Clin_ Microbiol_ 18- 1269-1271

5_ D'Amato, RE_, Thomsberry C., Baker C_N_, Kirven, L A_ 1976_ Effect of calcium and magnesium ions on the susceptibility
of Pseudomonas species to Tetracycline, Gentamicin Polymyxin B, and Carbenicillin_ Antimicrob_ Agents Chemother_ 7^.596-600. 596-600.

6_ U'Amato, RE_, Thornsberry C 1979. Calcium and Magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion
susceptibility results. Current Microbiol_2:135-138

7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial
susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa.

8_ Clinical and Laboratory Standards Institute_ 2010_ CLSI document M100-S19 Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa.

9. Comité de l'antibiogramme. 2010. French Society of Microbiology.

10. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. Media preparation for disc diffusion testing V1.0.

11. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method summary- V1.0.

12. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2010. EUCAST QC Tables V1.1.

CE

06/2010

50

Bio-Rad

3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: [phone] Fax : [phone]