Développement d'une technologie en bactériologie : l'aromatogramme

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DÉVELOPPEMENT D'UNE

TECHNOLOGIE EN

BACTÉRIOLOGIE :

L'AROMATOGRAMME

MÉMOIRE DE STAGE

Présenté et soutenu le 26 Mai 2021
par Elisa CHAROUSSET

Organisme d'accueil et Maître de stage
Dr Ernst-Peter ANDRESEN

11 route de la Celle, 78120 Clairefontaine

Enseignant référent

Mme Florence CONSTANTINESCO-BECKER

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REMERCIEMENTS

Je tiens tout d'abord à remercier le Dr Ernst-Peter ANDRESEN, qui a bien voulu m'accueillir à ses côtés pour ce stage, et a été à l'initiative de ce projet. Il m'a permis de réaliser un travail de recherche d'un réel intérêt, en m'aidant et m'aiguillant au quotidien, m'apprenant les différentes techniques de laboratoire et m'expliquant le principe de chaque technique utilisée. Ce fût un réel plaisir de travailler à ses côtés dans le cadre de ce stage.

Je remercie également les laboratoires BACTOLAB (Lausanne, Suisse), LABOVET CONSEIL (Les Essarts-en-Bocage, France) et VEBIO (Arcueil, France), qui ont accepté de partager avec moi leurs connaissances et techniques, ce qui m'a grandement aidé dans mon travail. Je remercie tout particulièrement Mr Pierre-Alain GRAS, pharmacien et biologiste chez BACTOLAB, qui m'a offert de son temps pour répondre à de nombreuses questions et m'apporter des remarques et suggestions précieuses.

Enfin, je tiens à remercier Mme Florence CONSTANTINESCO-BECKER, pour avoir accepté de juger ce travail, et pour le suivi effectué au long du stage, ainsi que sa disponibilité face aux questions que j'ai pu me poser. Cela m'a permis d'aborder ce stage et ce travail sereinement.

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TABLE DES MATIERES

REMERCIEMENTS 2

TABLE DES MATIERES 3

Introduction 5

Revue bibliographique 5

1. Bactéries 5

1.1. Généralités 5

1.2. Classification de Gram 6

1.3. Les germes considérés dans notre étude 6

2. Huiles essentielles 7

2.1. Définition et obtention des huiles essentielles 7

2.2. Composition chimique 7

2.3. Mode d'action antibactérien 8

3. Aromatogramme 8

Matériel et méthodes 9

1. MATÉRIEL 9

1.1. Huiles essentielles 9

1.2. Souches bactériennes 9

2. MÉTHODES 10

Résultats 11

1. Milieux de culture 11

2. Disques et volumes déposés 11

3. Composition de la solution 12

4. Conditions de dépôts et nombre de disques 12

5. Mesures réalisées 12

Discussion 13

1. Milieux de culture 13

2. Disques et volumes déposés 13

3. Composition de la solution 14

4. Conditions de dépôt et nombre de disques 14

5. Cohérence des mesures 14

6. Limites d'interprétation 14

Conclusion 15

BIBLIOGRAPHIE 16

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ANNEXES 21

Annexe I : Retranscription d'un entretien avec Madame MARTINEAU Martine, technicienne de

laboratoire chez Labovet Conseil, site les Essarts, France, le 29 Avril 2021 21

Annexe II : Retranscription d'un entretien avec Monsieur GRAS Pierre Alain, pharmacien-biologiste FAMH et responsable scientifique et spécialiste en microbiologie chez Bactolab à Lausanne, Suisse, le 7 Mai

2021 22

Annexe III : Retranscription d'une interview avec une technicienne de laboratoire chez Vebio à Arcueil,

France, le 7 Mai 2021 24

Annexe IV : Protocole de réalisation d'aromatogramme de Bactolab, laboratoire spécialisé en

microbiologie, par LELOUP A., DELACRETAZ D. et approuvé par TAILLENS S. 25

Annexe V : Tableau des aromatogrammes réalisés 26

Annexe VI : Photographies des aromatogrammes réalisés 33

Annexe VII : Fiche technique de la Gélose chromid^TM CPS, biomérieux 37

Annexe VIII : Fiche Technique de la gélose Chapman, Bio-Rad 40

Annexe IX : Fiche technique de la Gélose MacConkey, BD 42

Annexe X : Fiche technique de la Gélose Hektoen, Bio-Rad 45

Annexe XI : Fiche technique de la gélose Mueller-Hinton, Bio-Rad 47

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INTRODUCTION

L'utilisation habituelle des antibiotiques en traitement et prévention des infections bactériennes a contribué au développement de l'antibiorésistance, qui est aujourd'hui une menace importante pour la santé : elle peut être source d'échecs thérapeutiques, que ce soit en médecine vétérinaire ou humaine (1)(2)(3). Il est donc important de limiter la prescription d'antibiotiques (par exemple le plan Écoantibio a permis une réduction de 45% de l'utilisation d'antibiotiques vétérinaires (4)), ce qui passe notamment par des mesures de prévention sanitaire et zootechniques, la vaccination, la réduction de l'introduction et de la dissémination des agents pathogènes, et enfin la substitution, et ainsi la recherche de traitements alternatifs (phytothérapie, aromathérapie, phagothérapie...) (5).

L'aromathérapie, soit l'utilisation des huiles essentielles (HE) à des fins thérapeutiques en bactériologie, est une alternative intéressante (6), de part les propriétés antibactériennes des HE, leur coût relativement faible (7), ainsi que l'essor que connaît la médecine dite « douce ». Les HE sont par exemple employées dans le traitement des mammites des ruminants (8), ou en prévention de l'apparition de pathologies respiratoires (9) dans les élevages. Néanmoins, ces traitements alternatifs sont encore mal définis, et peuvent présenter un risque de par la toxicité de certaines HE (10). De nombreuses études supplémentaires sont ainsi nécessaires afin de pouvoir assurer la qualité, la sécurité et l'efficacité de leur utilisation en thérapeutique. L'aromatogramme (AG) est une technique qui peut être utilisée pour caractériser in vitro l'activité antibactérienne des HE sur des germes particuliers, notamment ceux présentant des résistances aux antibiotiques. Néanmoins, il n'existe à ce jour aucun protocole expérimental validé ou recommandé par les autorités réglementaires, et ces techniques doivent encore être développées et expérimentées (11).

L'objectif de ce travail sera donc de développer la technique de l'AG, avec pour but l'utilisation des HE dans la lutte contre les infections bactériennes couramment rencontrées en médecine vétérinaire.

Dans une première partie, une revue bibliographique sera présentée sur les bactéries (notamment les bactéries pathogènes rencontrées en médecine vétérinaire), les huiles essentielles, et l'aromathérapie. Dans une seconde partie seront présentés le matériel et les méthodes utilisés pour la réalisation de l'AG, dans l'étude de l'activité antibactérienne des huiles essentielles. La troisième partie comportera les résultats suivis de la discussion. Enfin, la conclusion et les perspectives feront l'objet de la quatrième partie. Les références bibliographiques seront présentées à la fin de ce manuscrit.

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Bactéries

1.1. Généralités

Une bactérie est un organisme unicellulaire de l'ordre des procaryotes (ne possédant donc pas de noyau, mais un ADN chromosomique circulaire situé dans le cytoplasme), dont la taille varie de 1 à 10 um. Chaque genre de bactéries a une morphologie et des caractéristiques propres. (12)(13)

Pour les différencier et ainsi mieux les identifier, on utilise de nombreux critères de classification des bactéries. Les critères les plus utilisés sont leur morphologie microscopique,

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ainsi que le résultat de la coloration de Gram (14). L'identification se fait aussi grâce à d'autres caractères, comme leur forme (les coques ou cocci, soit une forme sphérique, les bacilles, en forme de bâtonnets, ou les spirales/hélices), l'aspect macroscopique des colonies, leur mode de groupement, leur taille, leur mobilité, la présence de spores, la présence d'une capsule ou encore des critères biochimiques (mode de respiration, fermentation de différents substrats) (15).

La majorité des bactéries n'est en conditions normales pas pathogène, et est présente en grande quantité dans le corps, notamment au sein du microbiote. Elles colonisent alors un organisme avec lequel elles forment une symbiose ou du commensalisme (16). Néanmoins, des bactéries présentes en concentration trop importante, ou dans des zones où elles sont normalement absentes, peuvent êtres responsables d'états maladifs : certaines sont responsables de maladies infectieuses courantes en médecine vétérinaire.

1.2. Classification de Gram

La coloration de Gram permet de différencier les bactéries en 2 catégories : les bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif. Elles se différencient principalement par la structure de leur paroi. Cette différenciation permet une première classification des bactéries, qui sera utile dans leur étude.

Ø Les bactéries à Gram positif ont une paroi composée jusqu'à 90% de peptidoglycane (ou muréine), un polymère complexe, composé d'une chaîne de N-acétylglucosamine et d'acide N-acétylmuramique, ainsi que d'un ensemble de chaînes latérales peptidiques. Leur paroi est épaisse, composée de peu ou pas de protéine (17). Elles apparaissent bleues/violettes suite à une coloration de Gram, le violet de gentiane, ou crystal violet CV⁺ se fixant aux composants cytoplasmiques chargés négativement, et n'étant pas expulsés grâce à la paroi imperméable (18).

Ø Les bactéries à Gram négatif ne comportent qu'une voir deux couches de peptidoglycane, qui ne représentent que 10 à 20% de la paroi : celle-ci est plus fine que chez les bactéries à Gram positif. Ces bactéries comportent également une membrane externe, composée d'une double couche de phospholipides, et de lipoprotéines. Elles apparaissent roses suite à une coloration de Gram, les complexes violets étant expulsés suite à la perte de la membrane externe durant la décoloration, et les bactéries étant ensuite recolorées à la fuschine (19)(20)(21)(22).

1.3. Les germes considérés dans notre étude

Le Staphylococcus est une coque Gram positif, caractérisée par sa disposition en amas dans les tissus (sous forme de grappes de raisin), immobile et non sporulée (17). Il s'agit d'un commensal de la peau et des muqueuses des animaux, qui peut être responsable d'infections cutanées (infections de plaies, pyodermites), septicémies et otites (23). On peut citer notamment les mammites, une inflammation des tissus mammaires, fréquemment rencontrées en élevage (24).

Escherichia coli, une bacille Gram négatif, la plupart du temps commensale, c'est-à-dire résidant dans l'intestin sans danger pour l'organisme hôte, peut-être responsable de nombreuses maladies : diarrhées, mammite, septicémie, dysentérie, gastro entérite (25).

Klebsiella est une bacille Gram négatif, de la famille des entérobactéries, non mobile et généralement encapsulée, qui vit dans l'intestin. Elle peut être responsable d'un grand nombre

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de maladies infectieuses : pneumonies, septicémies, infections urinaires, métrites (26)(27)(28)...

Pasteurella est un genre de bactérie Gram négatif, à la forme intermédiaire entre des coques et des bacilles. Elle peut-être responsable d'infection des muqueuses au niveau du système respiratoire ou de la cavité buccale notamment (29).

Corynebacterium est un genre de bacilles Gram positif. Il s'agit d'un germe pyogène (c'est-à-dire responsable d'infections aiguës provoquant une accumulation de polynucléaires neutrophiles, ce qui se traduit par la présence de pus), principalement chez les ruminants et le cheval (30).

2. Huiles essentielles

2.1. Définition et obtention des huiles essentielles

Les plantes contiennent un grand nombre de principes actifs, soit des molécules présentant un intérêt thérapeutique curatif ou préventif. On peut citer parmi eux les alcaloïdes (des composés organiques azotés et basiques), les substances amères, les tanins (substance amorphe, autrefois utilisée dans la production du cuir), les flavonoïdes ainsi que les huiles essentielles (1 à 3% de la plante). Ces dernières sont des mélanges de molécules volatiles et odorantes (31)(32).

Le concept d'huile essentielle (HE) est définie par la Pharmacopée Européenne VI^e édition comme « un produit odorant, généralement de composition complexe, obtenu à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, soit par extraction à la vapeur, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L'huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n'entrainant pas de changement significatif de sa composition » (33).

2.2. Composition chimique

Les HE ont une composition très complexe et variée : plusieurs dizaines, voir plusieurs centaines de molécules organiques volatiles. Les propriétés de chaque HE résultent ainsi des proportions de chaque molécule qui les composent, de leurs différentes propriétés et de leurs interactions (34). De nombreux facteurs influent sur la composition d'une HE : l'espèce botanique, le chémotype, le cycle végétatif, la période de récolte, l'organe végétal, certains facteurs environnementaux ainsi que les procédés d'obtention (35).

La notion de chémotype (soit la race chimique) reflète une spécificité biochimique des huiles essentielles : en effet, une même espèce botanique peut produire des HE de composition chimique distincte, en fonction du pays d'origine ou du climat notamment (36). Il est donc important que les huiles essentielles utilisées soient chémotypées par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (37)(38). Les HE sont alors décrites en fonction de leurs composés principaux, permettant de prévoir au mieux leurs propriétés.

Les constituants des huiles essentielles sont répartis en 2 classes : les terpénoïdes, qui dérivent de l'isopenténylpyrophosphate, et les phénylpropanoïdes, biosynthétisés à partir d'acides aminés aromatiques : la phénylalanine et la tyrosine (38)(39). Certaines de ces molécules ont un effet anti-bactérien important : les phénols, les monoterpénols et les aldéhydes aromatiques notamment sont des anti-infectieux puissants à large spectre. On peut également citer les cétones et les oxydes terpéniques, qui ont un effet antibactérien, antiviral et

antiparasitaire. Il est néanmoins important d'être très précautionneux dans l'utilisation des HE : en effet, certains de leurs composés peuvent être très toxiques (10). Par exemple, les cétones peuvent avoir un effet neurotoxique, en destructurant la gaine de myéline qui entoure les axones des nerfs, de par leur action lipolytique (40).

2.3. Mode d'action antibactérien

L'activité antibactérienne des HE repose sur plusieurs modes d'action, et plusieurs cibles cellulaires spécifiques en fonction des molécules qu'elles contiennent. Le principal est la perméabilisation de la membrane : de par leur caractère lipophile, les molécules des HE traversent la paroi cellulaire et la membrane cytoplasmique, ce qui perturbe leur structure et les rend perméables. Chez les bactéries, on observe alors une perte de nombreux constituants cytoplasmiques, d'ions (entraînant une réduction du potentiel de membrane), de substrats énergétiques (ATP, glucose), de protons (ce qui provoque une diminution de la force protomotrice et ainsi empêche la synthèse d'ATP) et de sels. On peut également observer une coagulation du cytoplasme provoquée par certaines molécules. Ces mécanismes peuvent ainsi mener à l'apoptose ou à la nécrose de certaines bactéries (41)(42)(43).

3. Aromatogramme

L'AG est une technique créée en 1973 par GIRAULT, à partir de la technique de l'antibiogramme, et qui permet de mesurer in vitro le pouvoir antibactérien des HE (44)(45).

Le principe est semblable à celui de l'antibiogramme : une gélose est ensemencée et on y place des disques de papiers buvards imbibés d'HE. Après incubation, on observe alors des halos d'inhibition, dont on peut mesurer le diamètre, ce qui permet ainsi de quantifier le pouvoir antibactérien de chaque HE (44).

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Figure 1 - Illustration d'un résultat d'aromatogramme (d'après DOLISI Georges (2013) et retravaillé par RENOUL Hugues-Antoine (2014) "Le Docteur Valnet, le soin par la nature")

Cette technique ne comporte pas encore de protocole normalisé, mais est pratiquée par certains laboratoires (notamment LABOVET CONSEIL aux Essarts-en-Bocage, France, BACTOLAB à Lausanne, Suisse, et VEBIO à Arcueil, France : voir Annexe I, II et III), et ce en utilisant différentes compositions (HE pure ou diluée, avec utilisation ou non d'un dispersant) et différentes quantitées déposées sur les disques (46).

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MATERIEL ET METHODES

1. MATÉRIEL

1.1. Huiles essentielles

Nous avons sélectionné 6 HE, pour leurs potentielles activités antibactériennes décrites dans la littérature, et en éliminant les HE les plus toxiques. Elles ont été achetées via le site MYRTÉA OSHADI. Le tableau ci-dessous présente ces HE.

Figure 2 - Huiles essentielles utilisées dans cette étude et leurs caractéristiques (d'après MYRTÉA OSHADI)

Huile essentielle	Nom scientifique	Provenance géographique	Partie de la plante	Chémotype
Origan vulgaire	Origanum vulgare	France	Plante	Carvacrol, Linalool, Thymol, Paracymene, gamma-Terpinene
Tea Tree	Melaleuca alternifolia	Australie	Feuilles	Terpinene-4-ol, gamma-Terpinene, alpha-Terpinene, Paracymene, 1,8- Cineol
Achillée millefeuille bleue	Achillea millefolium	Hongrie	Fleurs/Plante	alpha- & beta-Pinene, Sabinene, 1,8-Cineol, Camphene, Chamazulene, Isoartemisia cetone, Borneone
Pin sylvestre	Pinus sylvestris	France	Aiguille	alpha- & beta-Pinene, Limonen, Camphene, delta-3-Carene, Myrcene
Eucalyptus globuleux	Eucalyptus globulus	Espagne	Feuilles	1,8-Cineol, alpha-Pinene, Limonene, Paracymen, Aromadendrene, Globulol, trans- Pinocarveol
Lavande	Lavandula augustifolia	France	Fleurs	acétate de linalyle

1.2. Souches bactériennes

- Staphylococcus pseudointermedius issus de prélèvements au niveau d'infections cuantées au niveau du pli du paturon de chevaux (prélèvements sur 4 chevaux, numérotés de 1 à 4 pour différencier des germes issus de souches différentes)

- Escherichia coli issu des selles d'un chat souffrant d'une infection plasmo-lymphocytaire

- Klebsiella spp. issu des selles d'un chat (numéroté 1) ou de la fourchette infectée d'un cheval (numéroté 2)

- Pasteurella multocida issu d'un prélèvement au niveau de la bouche d'un chat victime d'infection

- Corynebacterium pyogenes issu d'un prélèvement au niveau de la fourchette infectée d'un cheval

Le genre et l'espèce de ces bactéries ont été déterminées par diagnostic indirect (analyse de l'effet de la bactérie sur l'organisme où elle a été prélevée) et diagnostic direct : aspect au Gram et isolements sur divers milieux de culture : CHROMID CPS ELITE OPAQUE (voir

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Annexe VII), CHAPMAN (voir Annexe VIII), MACCONKEY (voir Annexe IX), HEKTOEN (voir Annexe X), et MUELLER-HINTON BLOOD (Voir Annexe XI).

Une identification plus sûre et plus précise aurait pu être réalisée via la réalisation d'un test PCR ou l'utilisation d'une galerie API. Néanmoins, ces méthodes sont plus coûteuses, et ne sont pas forcément nécessaires dans le cas de notre étude sur l'AG, dont l'objectif principal est la détermination d'un protocole permettant de déterminer l'effet antibactérien des HE, et non pas la quantification de cet effet sur une bactérie specifique.

2. MÉTHODES

La réalisation d'un AG est semblable à celle d'un antibiogramme : on ensemence un milieu de culture gélosé, puis on y dépose des disques imbibés d'huile essentielle, à l'aide de micropipettes de 5 et de 10 uL. Les géloses sont ensuite retournées et mises à incuber à 37°C. La lecture des résultats se fait après 18 à 24h d'incubation. Le diamètre du halo d'inhibition pour chaque huile essentielle testée est ensuite mesuré.

Dans cette étude, nous cherchons un protocole qui permette de comparer les effets antibactériens in vitro de différentes huiles essentielles sur un même germe, comme on le ferait pour les antibiotiques avec un antibiogramme : il permettrait d'observer des halos d'inhibition autour des disques, plus ou moins grands selon les huiles essentielles. Nous utiliserons un témoin négatif, c'est-à-dire un disque seul ou un disque imbibé d'huile végétale (HV), ici de l'huile de sésame, qui nous permettra de confirmer que les halos d'inhibition observés, et donc les effets antibactériens, sont bien dûs à l'effet de l'huile essentielle et non à une contamination des disques, ou encore une inhibition par la phase huileuse. La répétabilité du protocole est également un critère : avec un même protocole, des germes et des HE identiques, on doit obtenir le même résultat.

Nous avons considéré plusieurs paramètres nous permettant d'optimiser notre protocole : le milieu de culture utilisé, les disques utilisés et le volume déposé sur le disque, la composition déposée sur le disque (utilisation ou non d'un dispersant, dilution de l'HE ou non), la condition de dépôt de l'HE et enfin la quantité de disques à disposer sur une même plaque. Nous nous sommes appuyés pour cela sur des articles de la littérature (34) (35) (38) (41) (44) (47) (48) (49) ainsi que sur des informations issues de laboratoires pratiquant les AG, comme LABOVET CONSEIL, VEBIO ou BACTOLAB.

Nous avons utilisé des milieux gélosés Mueller-Hinton (voir Annexe IX), le milieu standardisé recommandé pour les antibiogrammes : celui-ci est non sélectif et permet la culture de l'ensemble des bactéries peu exigeantes. Néanmoins, celui-ci ne permet parfois pas la culture de certaines bactéries particulièrement exigeantes (Haemophilus ssp. par exemple) : nous avons donc également testé l'utilisation d'une gélose Mueller-Hinton enrichie au sang.

Différents disques ont été testés : des disques de papier buvard classique de 4 mm de diamètre, ces mêmes disques utilisés en double épaisseur (superposition de deux disques) et des disques en cellulose de 6 mm de diamètre (DUTSCHER ref 074074), classiquement utilisés pour les antibiogrammes. Des volumes de 10 uL et de 5 uL d'HE ont été testés.

Nous avons considéré différentes compositions de solution à déposer sur le disque : HE pure ou HE diluée (à des dilutions 4/5, 3/5, 2/5 et 1/5), en utilisant de l'huile végétale (HV) de sésame pour effectuer ces dilutions. Nous avons également testé l'utilisation d'un dispersant, le Diméthylsulfoxyde (DMSO), permettant la solubilisation des huiles et ainsi potentiellement une meilleure diffusion de celles-ci sur la gélose.

Deux conditions de dépôt de l'HE ont été testées : le dépôt de l'HE sur le disque alors que celui-ci n'avait pas encore été déposé sur la gélose, et le dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la gélose.

Enfin, nous avons testé divers nombres de disques imbibés d'HE sur une même plaque : 3, 5, 6 et 10.

Le protocole exact de chaque AG réalisé est décrit en Annexe V. Les diamètres des halos d'inhibition ont ensuite été mesurés à la règle directement sur la boîte de Pétri ainsi que via le logiciel ImageJ, suite aux photographies réalisées. L'échelle a été faite en se basant sur le diamètre des disques, qui était connu pour chaque AG, et offrait une meilleure précision que la taille de la boîte de Pétri.

RESULTATS

1. Milieux de culture

Sur les plaques Mueller-Hinton enrichies au sang, nous observons au niveau de certains disques un halo jaune, qui peut gêner la lisibilité de la plaque.

Figure 3 - Aromatogramme n°8, réalisé avec Staphylococci en utilisant une double épaisseur de disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 10 uL ou de 5 uL d'HE d'origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E), après une incubation de 18h à 37°C. Nous observons notamment ce phénomène au niveau des disques imbibés d'HE d'Origan vulgaire (voir Figure 2). Au contraire, les géloses Mueller-Hinton non enrichies permettent une bonne lisibilité des halos d'inhibition.

2. Disques et volumes déposés

Figure 4 - Aromatogramme n°12, réalisé avec Klebsiella en utilisant des disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 5 mL d'HE d'Origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E) ou disque seul (1), après une incubation de 18 h à 37°C

Figure 5 - Aromatogramme n°5, réalisé avec Klebsiella et Escherichia coli, en utilisant des disques de papier buvard de 4 mm de diamètre, imbibés d'un volume de 10 mL d'HE de Tea Tree (T) et de Lavande (L), ou disque seul (1), après une incubation de 18h à 37°C

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Lors de l'utilisation de disques de papiers buvard classiques de 4 mm, nous avons constaté que peu importe le volume utilisé, celui-ci est trop important, et l'huile déborde autour du disque (voir Figure 3 et 4).

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Au contraire, l'utilisation d'une double épaisseur de ces mêmes disques a permis une imprégnation des disques de manière homogène, sans que l'huile ne déborde sur la gélose, et ce peu importe le volume utilisé. Nous observons alors des halos réguliers, bien identifiables. Nous observons par ailleurs des halos d'inhibition plus nettes et plus larges pour un volume de 5 uL, montrant une meilleure diffusion de l'huile sur la gélose.

L'utilisation de disques de cellulose de 6 mm a permis une absorption optimale de l'huile. Néanmoins nous observons parfois des halos d'inhibition peu nets, montrant une moins bonne diffusion de l'huile qu'avec l'utilisation d'une double épaisseur de disques. Nous ne remarquons pas de différence significative entre un dépôt de 5 uL ou de 10 uL.

3. Composition de la solution

L'utilisation d'HE diluée n'a donné que peu de résultats : nous n'observons alors que des halos faibles voir inexistants.

Les dispersants utilisés, disposés seuls (savon liquide ou DMSO), n'ont pas montré d'action antibactérienne (on n'observe aucun halo d'inhibition autour du témoin négatif). Néanmoins, leur utilisation n'a pas donné de différences au niveau des résultats. Au contraire, leur utilisation avait pour effet une concentration moins importante d'HE dans le disque, et ainsi des halos d'inhibition moins importants.

4. Conditions de dépôts et nombre de disques

Lorsque le dépôt de l'HE sur le disque est réalisé avant que le disque ne soit déposé sur la gélose, nous observons alors que l'huile/la solution déposée a tendance à transpercer, laissant des traces sur le plan de travail : on ne peut alors plus quantifier de manière précise la quantité d'HE contenue par le disque une fois celui-ci déposé sur la gélose.

5. Mesures réalisées

Nous n'avons observé aucune différence entre les plaques sur lesquelles étaient disposées 3, 5 ou 6 disques d'HE, qu'il s'agisse de la croissance bactérienne ou des halos d'inhibition. Néanmoins, au niveau des géloses sur lesquels 10 disques d'HE ont été déposés, nous observons parfois une croissance bactérienne moindre. De plus, les halos d'inhibition étant parfois confondus, la lecture des résultats est difficile (voir Figure 5).

Figure 6 - Aromatogramme n°9, réalisé avec Escherichia coui en utilisant une double épaisseur de disques de papier buvard de 4 mm, imbibés d'un volume de 10 uL ou de 5 uL d'HE d'origan (O), de Tea Tree (T), d'Achillée (A), de Pin (P) et d'Eucalyptus (E), après une incubation de 18h à 37°C.

Via l'utilisation des différentes techniques énoncées, nous avons pu mesurer des diamètres de halos d'inhibition. Vous trouverez dans le tableau suivant ces différents diamètres. La mention « > 15 mm » est indiquée lorsque le halo d'inhibition est trop grand et se confond avec ceux des autres HE, ce qui empêche une mesure plus précise. La mention « Æ » est indiquée lorsqu'aucun halo n'est observé. Les photographies des AG correspondants sont visibles dans l'Annexe VI.

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Figure 7 - Diamètres des halos d'inhibition pour chaque HE testée et pour chaque germe testé.

HE testée Bactérie testée	Achillée millefeuille	Eucalyptus globuleux	Origan vulgaire	Pin sylvestre	Tea Tree
Staphylococcus pseudointermedius 1 (A8, A10)	8 mm	9 mm	22 mm	0	12 mm
Staphylococcus pseudointermedius 2 (A13)	12 mm	11 mm	21 mm	10 mm	16 mm
Staphylococcus pseudointermedius 3 (A14, A16)	12 mm	17 mm	28 mm	14 mm	17 mm
Staphylococcus pseudointermedius 4 (A18)	0	0	27 mm	10 mm	0
Klebsiella ssp. 1 (A12)	10 mm	8 mm	27 mm	0	23 mm
Klebsiella ssp. 2 (A19)	16 mm	> 15 mm	> 15 mm	> 15 mm	> 15 mm
Escherichia coli (A9, A11)	8 mm	9 mm	22 mm	0	12 mm
Pasteurella multocida (A15, A17)	0	12 mm	40 mm	10 mm	14 mm
Corynebacterium pyogenes (A19)	12 mm	18 mm	> 15 mm	14 mm	14 mm

DISCUSSION

1. Milieux de culture

La teinte jaune observée au niveau de certains disques d'HE correspond certainement à la bilirubine, un pigment jaune issu de la dégradation des hématies. En effet, d'après GRAS PA. de BACTOLAB (voir Annexe II et IV), l'utilisation d'une gélose enrichie au sang est incompatible avec la réalisation d'un AG de part la capacité d'hémolyse de certaines HE. On préfèrera donc lorsque cela est possible l'utilisation d'une gélose Mueller-Hinton non enrichie. Cela limite néanmoins l'utilisation des AG aux bactéries non exigeantes. Il pourrait alors être intéressant de tester l'utilisation d'autres milieux enrichis pour les AG, permettant la culture des bactéries très exigeantes sans qu'il puisse y avoir hémolyse.

2. Disques et volumes déposés

Les disques de papiers buvards de 4 mm de diamètre ne disposent pas d'une capacité d'absorption suffisante pour la réalisation d'AG. L'utilisation d'une double épaisseur de ces disques permet de résoudre ce problème, alors l'absorption de 10 uL ou de 5 uL est possible et donne de bons résultats. De même, les disques de cellulose de 6 mm ont une absorption suffisante pour 5 uL et pour 10 uL, et sont plus pratiques d'utilisation, mais donnent lieu à des résultats moins nets. Ces deux techniques pourront donc être utilisées pour la réalisation d'AG. En ce qui concerne la littérature, d'après CUNTZMANN A. (48), FONTANAY S. et al. (11), TOURE D. (38) et DE BILLERBECK V-G. (46), les disques de cellulose de 6 mm sont les plus utilisés. Il pourrait être intéressant de tester l'utilisation de disques de 6 mm d'une plus grande

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épaisseur, qui pourrait permettre une diffusion de l'HE plus homogène et ainsi des résultats plus nets. Le volume déposé des études précédentes est variable : 20 uL pour TOURE D. (38), 15 uL pour GUINOISEAU E. (39), 10 uL pour FONTANAY S. et al. (11), CUNTZMANN A. (48), VEBIO et BACTOLAB, 8 uL pour CHABENAT H. (41) et enfin 5 uL pour LABOVET CONSEIL. En effet, tant qu'on dispose de disques avec une absorption suffisante, la quantité déposée semble importer peu sur les résultats obtenus. Ces différences entre les études empêchent par contre une comparaison rigoureuse entre elles : cela justifie à nouveau la nécessité de la mise en place d'un protocole standardisé.

3. Composition de la solution

Contrairement à ce que l'on retrouve dans la littérature, où il est fait usage de DMSO comme dispersant, permettant de pallier à des difficultés de diffusion des huiles (BOUTABIA L. et al. (47), TOURE D. (38), GUINOISEAU E. (39), FONTANAYS S. et al. (11), CHABENAT H. (41)), nous avons obtenus de meilleurs résultats via l'utilisation d'une solution d'HE pure. Cela permet d'éviter de possibles interactions entre l'HE et le dispersant, qui inhiberaient le pouvoir antibactérien (le Tween 80, un dispersant, était par exemple recommandé par CRÉMIEUX A. et al. en 1981 comme neutralisateur des désinfectants phénoliques (41)). Il s'agit d'ailleurs de la procédure utilisée par les laboratoires VEBIO, LABOVET CONSEIL et BACTOLAB (Annexe I, II, III et IV).

4. Conditions de dépôt et nombre de disques

Le dépôt de l'HE sur les disques avant que ceux-ci ne soient déposés sur la gélose donnant lieu à un risque d'imprécision sur le volume contenu par le disque, nous préfèrerons effectuer les dépôts après avoir positionné les disques sur la gélose.

Les HE étant des composés volatiles, on peut expliquer une croissance bactérienne moindre lorsqu'un nombre trop important de disques d'HE est déposé sur une seule gélose. En effet, la culture bactérienne subit alors l'effet d'une concentration trop importante d'HE. On préfèrera donc limiter le nombre de disques d'HE sur une même gélose à un maximum de 6, nombre pour lequel nous n'observons aucun impact au niveau de la croissance bactérienne, et pour lequel la lecture du diamètre des halos d'inhibition est possible. L'idéal serait de ne disposer qu'un seul disque par plaque, l'assurance que les résultats ne soient pas faussés par la volatilité des huiles. Nous n'avons pas trouvé d'informations sur ces paramètres dans la bibliographie.

5. Cohérence des mesures

Nous avons obtenu des résultats qui sont répétables d'une expérience à l'autre (même diamètre obtenu pour un couple bactérie/HE à plus ou moins 1 mm près). Ces résultats sont cohérents avec la littérature : par exemple, l'HE d'Origan vulgaire, citée comme HE majeure (d'après BELAICHE P., DA SILVA F. ^(45), LAURENT J.), avec un effet antibactérien à large spectre, nous laisse observer de larges halos d'inhibition pour tous les germes testés.

6. Limites d'interprétation

Grâce à l'utilisation de l'AG, nous avons pu quantifier et observer l'effet antibactérien de certaines HE sur des souches bactériennes spécifiques. Néanmoins, il est important de savoir que ces résultats ne sont pas généralisables. En effet, les HE sont des composés complexes (voir la notion de chémotype explicitée précédemment), qui peuvent avoir une composition sensiblement différente selon différents paramètres. De même, différents variants chez les

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bactéries peuvent expliquer leur résistance ou leur sensibilité plus ou moins accrue à certains composés (comme on peut l'observer avec les antibiogrammes). Il est difficile d'affirmer qu'une HE en général est efficace sur une espèce bactérienne en général. L'AG est donc plutôt une technique à utiliser au cas par cas, dans le but de trouver la (ou les) HE adaptée(s) à un patient, et non pas de définir des cas généraux. Cette limite est soulignée par ZITI-FREVILLE N. (34) et DA SILVA F. (45).

Par ailleurs, nous avons pu observer que l'HE d'Origan vulgaire est efficace sur l'ensemble des germes testés, tandis que l'HE de Pin sylvestre n'est que très peu efficace. Ces résultats sont à nuancer : en effet, ils peuvent être dûs à une différence de pouvoir antibactérien, mais également à une différence de capacité de diffusion. L'AG en milieu solide favorise les HE ayant une grande capacité de diffusion en milieu solide, au détriment d'autres HE diffusant moins bien mais pouvant être tout autant efficaces, limite énnoncée par DA SILVA F. (45) et FONTANAY S. et al. (11).

CONCLUSION

Nous proposons ainsi un protocole d'AG permettant de déterminer des HE efficaces sur des bactéries spécifiques. On utilisera une gélose Mueller-Hinton, qu'on ensemencera et sur laquelle on déposera des disques de cellulose de 6 mm (maximum 6 disques par plaque). On effectuera un dépôt de 5 uL de chaque HE testée, pure, et la plaque sera incubée à 37°C durant 18 à 24h.

Néanmoins, ce protocole pourrait être encore amélioré par la régularisation de son utilisation, permettant d'acquérir un meilleur geste technique et ainsi d'éviter de possibles erreurs de manipulations. Certains paramètres pourraient être encore optimisés, via l'expérimentation d'autres conditions : au vu de nos résultats, des disques de cellulose de 6 mm d'épaisseur supérieure pourrait permettre l'obtention de mesures plus nettes. L'objectif à l'avenir serait la normalisation d'un protocole qui serait répétable, ce qui permettrait la validation, l'interprétation et l'exploitation des résultats (sans référentiel, toute interprétation demeure hasardeuse). De plus, d'autres techniques pourraient être explorées permettant de croiser nos résultats et de ne pas se limiter à la méthode de la diffusion en milieu solide (qui favorise les HE diffusibles au détriment des autres). On peut citer notamment la microdilution en plaque, permettant de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), et ce en milieu liquide (46), ou encore l'AG en micro-atmosphère, où le disque est disposé sur le couvercle de la boîte de Pétri, permettant d'observer le pouvoir bactéricide de l'HE au niveau de leur aire d'évaporation (45). Ces techniques nécessiteraient également des études supplémentaires afin de déterminer un protocole normalisé, utilisable en laboratoire, pour chacunes d'elles.

Finalement, à condition d'être précautionneux face à leur toxicité, les huiles essentielles peuvent offrir une alternative ou un complément intéressant au traitement par antibiotiques. Des progrès scientifiques ont été faits dans la compréhension de la composition ainsi que des propriétés de ces composés, mais ils ne sont pas encore suffisants. Il est essentiel que des expérimentations cliniques soient menées, afin d'une part de confirmer l'existence d'une corrélation entre les résultats in vivo et in vitro (certaines caractéristiques physiologiques des patients pourraient influencer l'action des HE), et d'autre part de déterminer les modes d'utilisation et les posologies des HE en application sur les animaux. La création de normes dans l'utilisation de ces produits et les différentes techniques qui y sont liées est une nécessité à l'avenir, permettant ainsi une généralisation de leur utilisation, tout en conservant efficacité et sécurité.

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ANNEXES

ANNEXE I : RETRANSCRIPTION D'UN ENTRETIEN AVEC
MADAME MARTINEAU MARTINE, TECHNICIENNE DE
LABORATOIRE CHEZ LABOVET CONSEIL, SITE LES ESSARTS,
FRANCE, LE 29 AVRIL 2021

Dans quelles indications réalisez-vous des aromatogrammes et/ou phytogrammes ?

Pour ce qui est des phytogrammes, c'est le vétérinaire qui nous dit si on doit en faire un ou pas, mais c'est surtout préconisé dans le cas où ce sont des poulets sans antibio, des poulets certifiés BIO, les dindes BIO. Quand on a une autopsie avec des lésions infectieuses et qu'on fait une bactériologie, on va faire un phytogramme plutôt qu'un antibiogramme. Cela permet de valider la prescription qui va être faite derrière. Les aromatogrammes sont plus réalisés au niveau « étude », pour l'élaboration d'un nouveau produit, par exemple. Le vétérinaire va alors me demander de faire plusieurs essais à partir d'huiles essentielles, et en fonction des résultats obtenus il va choisir celles qui sont le plus appropriées pour incorporer dans son mélange.

Quel protocole suivez-vous pour la méthode des aromatogrammes ?

On utilise la méthode des disques pour les aromatogrammes, pour les phytogrammes ce sera plutôt la méthode des puits.

Quel milieu de culture utilisez-vous pour la réalisation de ces tests bactériologiques ?

En principe on utilise le GMH (Gélose Mueller-Hinton), soit ordinaire soit supplémenté de sang suivant les bactéries qu'on va tester.

Quel posologie d'huiles essentielles utilisez vous au niveau des disques ?

On met 5 uL seulement, d'huiles essentielles pures, qu'on met directement sur le disque. Après on a fait plusieurs essais en testant 10, 5, 3 uL. Comme ces aromatogrammes là consistent plutôt en des études, c'est le vétérinaire qui va nous orienter sur la marche à suivre. On pourra donc être amené à utiliser différentes concentrations, et après on ajuste. On ne peut pas mettre plus de 10 uL sur notre disque parce qu'après il va être vite noyé.

Utilisez-vous un dispersant ?

Non, quand on utilise les Huiles Essentielles pures sur buvard on n'a pas forcément besoin de dispersant. Ça marche très bien même sur milieu solide. Pour ce qui est des phytogrammes, il s'agit déjà de mélanges d'huiles essentielles avec des dispersants, donc c'est pareil on n'a pas forcément besoin d'en rajouter pour faire nos phytogrammes.

Est-ce que vous avez beaucoup de demandes en terme de phytogramme et d'aromatogrammes ?

Ça dépend ce que vous entendez par beaucoup. On n'en fait pas forcément tous les jours, après tout dépend des autopsies qu'on reçoit, c'est très variable.

Merci beaucoup pour vos réponses.

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ANNEXE II : RETRANSCRIPTION D'UN ENTRETIEN AVEC
MONSIEUR GRAS PIERRE ALAIN, PHARMACIEN-BIOLOGISTE
FAMH ET RESPONSABLE SCIENTIFIQUE ET SPECIALISTE EN
MICROBIOLOGIE CHEZ BACTOLAB A LAUSANNE, SUISSE, LE 7
MAI 2021

J'ai vu que vous réalisiez des aromatogramme au sein de votre laboratoire et j'aimerais pouvoir vous poser des questions à ce propos. Je travaille plutôt sur leur utilisation en science vétérinaire, mais bien que votre laboratoire est centré sur la médecine humaine je pense que ce sont deux domaines semblables.

C'est intéressant car vous n'êtes pas la première à me le demander, j'ai une personne d'origine allemande qui fait une thèse dans une université vétérinaire Suisse, et on a eu un vétérinaire français qui est venu se former trois jours ici pour faire lui-même des aromatogrammes dans le sud de la France, donc on voit que c'est quelque chose qui commence à prendre de l'ampleur dans le domaine vétérinaire. On sait maintenant que les résistances aux antibiotiques ne sont pas dues qu'à la médecine humaine mais que la médecine vétérinaire a joué un grand rôle là dedans. Les vétérinaires à une époque ont utilisé à tour de bras des antibiotiques, qui se sont retrouvés après dans la terre. Les bactéries les ont retrouvé ensuite dans la terre, plus facilement, d'où le départ de d'autres résistances. On pense que les vétérinaires ont joué un grand rôle. Je pense que maintenant ils y sont sensibles et ils essayent de trouver d'autres solutions, c'est bien.

Et sinon dans quelles indications utilisez-vous les aromatogrammes généralement ?

Alors nous on fait principalement en médecine humaine, on a quelques demandes en vétérinaire, très très rares. D'abord il faut trouver une bactérie pour faire un aromatogramme, comme pour un antibiogramme, donc on a nous principalement des urines de femmes qui font des infections à répétitions, et qui en ont marre de prendre des antibiotiques et donc demandent à leur médecin de faire des aromatogramme. Ensuite on a différent frottis, des frottis vaginals, frottis de plaies, frottis de nez, etc... On peut avoir les selles aussi mais c'est beaucoup plus rare car dans ce cas avec le microbiote ce sont des milliards de bactéries qui sont analysées donc on ne fait pas d'antibiogramme ou d'aromatogramme dessus, on prend plutôt des probiotiques pour corriger.

Et quels protocoles utilisez-vous dans la réalisation des aromatogrammes ? Comme il n'existe pas de protocole normalisé il est difficile de s'y retrouver.

Absolument. Alors nous on utilise une technique qui a été mise au point il y a plus de 25 ans par le docteur Roussianos qui a mis au point la technique. Vous avez raison, c'est une technique qui n'est pas normalisée, on trouve 2, 3 choses sur internet mais il n'y a pas grand-chose c'est vrai. Nous pour cette technique on utilise le même papier buvard qui est utilisé pour les antibiotiques sauf que nous mettons directement la goutte de l'huile essentielle qu'on va tester. On en teste environ une vingtaine, et on pose la goutte sur le disque. Quand on a la bactérie qui a poussé, vous l'isolez, après vous la recoulez sur une gélose, sur laquelle on pose ensuite nos disques de papier buvard et dessus on met une goutte d'huile essentielle. On calibre ça : on met 10 uL, mais c'est quelque chose qui reste « fait-maison » on va dire. Nous on fait ça depuis des années, et ça marche très bien. Ensuite on rend 0, 1 croix, 2 croix, 3 croix. 0 ça veut dire que cela ne marche pas du tout que l'huile essentielle n'est pas adaptée à ce type de germes dans ce contexte. 1 croix c'est bien mais c'est pas sûr que ça fonctionne. 2 croix, 3 croix, c'est que ça fonctionne très bien, et alors le médecin ou le vétérinaire peut prescrire cette huile essentielle, avec les risques que vous connaissez. En effet les huiles essentielles peuvent être dangereuses. Nous on utilise une vingtaine d'huiles essentielles.

23

Et quel type de milieu de culture utilisez-vous ?

Comme pour les antibiogramme, par exemple un Mueller-Hinton, ou une gélose au sang pour certaines germes. L'essentiel c'est que le germe pousse, donc on prend les mêmes géloses qui potentialisent la croissance du germe, après l'huile essentielle ou l'antibiotique va diffuser de la même façon, pour inhiber la croissance ou pas.

Niveau utilisation/prescription des huiles essentielles, comment sont-elles utilisées ?

Alors elles sont utilisées principalement par voie orale, sauf s'il y a des plaies et qu'il faut alors appliquer. Par voie orale il faut faire attention, les huiles essentielles peuvent-être très toxiques. Il faut passer par un pharmacien qui connaît bien les huiles essentielles. Souvent ce qui est intéressant ce sont les mélanges de 3 huiles essentielles qui fonctionnent bien, principalement à 3 croix si possible, 2 croix sinon. Ensuite on fait un mélange, qu'on utilise effectivement par voie orale. Je pense que pour les animaux ce serait la même chose. Il faut juste calculer en fonction du poids, et pour ça il faut voir avec des pharmaciens vétérinaires ou médecins vétérinaires peut-être qui savent ce qu'ils peuvent donner. Il faut faire particulièrement attention pour les animaux qui ne pèsent pas grand-chose, il ne faut pas leur donner la même quantité qu'à un animal plus lourd.

Est-ce que vous avez beaucoup de demandes en terme d'aromatogramme, et quelle est la tendance sur ces dernières années ?

Oui ça a tendance à monter, on en fait à peu près un dizaine par semaine on n'en fait pas beaucoup car nous sommes un laboratoire de taille assez petite. Ça a tendance à monter parce qu'on en parle, parce qu'on a une grande expérience là dedans. Il y a des gens qui nous trouvent sur internet parce qu'ils en ont marre des antibiotiques, des patients qui font pression sur leur médecin parce qu'ils se bourrent d'antibiotiques et finissent par en avoir marre. On parle nous même on fait un peu de promotion. En Suisse on a le droit d'aller parler aux médecins, de leur expliquer que l'on fait des aromatogrammes. Maintenant on a généralement plus de gynécologues qui s'y intéressent, alors qu'avant c'était plutôt des médecins « exotiques » qui s'intéressent aux médecines alternatives et pas seulement à la médecine conventionnelle. On peut avoir aussi des nutritionnistes qui demandent également. Maintenant il y a pas mal de généralistes qui s'intérèssent à ça. Le problème ce que s'ils n'ont pas eu de formation là-dessus pendant leurs études ils ont tendance à oublier ou à ne pas connaître donc c'est aussi à nous d'en parler. Vous aurez le même problème chez les vétérinaires. C'est pour cela qu'il faut en parler. Je pense que c'est une question de temps, nous ça fait 25 ans qu'on les fait mais ce n'est pas quelque chose qui explose non plus. Ça monte tranquillement. En tout cas je ne peux que vous encourager dans votre étude, vous verrez que c'est très intéressant. Et effectivement on ne peut pas se baser sur des choses très normalisées, très calibrées, mais vous allez avec l'expérience acquérir un certain savoir qui vous permettra de les faire comme il faut. Il faut simplement essayer de le faire avec une bonne répétabilité.

Avez-vous quelque chose à ajouter ?

Il ne faut pas non plus rejeter l'antibiogramme car on peut se baser là-dessus. Ils sont beaucoup plus calibrés, on sait exactement comment les faire et les produits dessus sont également calibrés alors que les huiles essentielles ne le sont pas. On avait à un moment donné décidé de faire comme les antibiogramme, au lieu des indices de croix de mettre « sensible », « résistant » et « intermédiaire ». On s'est ensuite aperçu que ce n'était peut-être pas intéressant de faire la même chose que l'antibiogramme à ce point dans le sens où mettre des croix c'était mieux, cela laisse un plus grand choix. On mesure cela avec le diamètre d'inhibition.

Merci beaucoup pour toutes ces réponses.

24

ANNEXE III : RETRANSCRIPTION D'UNE INTERVIEW AVEC UNE TECHNICIENNE DE LABORATOIRE CHEZ VEBIO A ARCUEIL, FRANCE, LE 7 MAI 2021

Sous quelles indications réalisez-vous des aromatogrammes ?

Ce sont plutôt les vétérinaires qui décident si ils veulent faire ou pas un aromatogramme, en général ce sont sur des germes qui sont plutôt résistants aux antibiotiques, ou sinon ceux qui veulent faire de l'aromatothérapie pour éviter l'utilisation d'antibiotique.

Quelles protocole suivez-vous pour la réalisation de ces aromatogramme, étant donné qu'il n'existe actuellement pas de protocole normalisé ?

Effectivement il n'y a pas de protocoles réellement normalisé. On a des huiles essentielles, on en met une goutte sur un disque non imprégné sur une gélose, soit une gélose au sang soit une gélose classique.

Quelle quantité d'HE utilisez-vous pour imprégner ces disques ?

Nous on met 10 uL généralement, mais des fois c'est un peu trop donc ça peut arriver qu'on en mette un peu moins.

Est-ce que vous avez beaucoup de demandes d'aromatogrammes ? Quelle est la tendance sur ces dernières années ?

Alors ça va ça vient. Parfois on a des mois où on en a 4, et pendant d'autres périodes de l'année on en aura aucun. Parfois on ressent l'impact d'un article qui a été paru sur l'aromatogramme, et du coup il y a pleins de véto qui se disent qu'ils aimeraient utiliser l'aromatogramme, et puis après ça passe. Là ça fait un moment qu'on n'en a pas eu.

Merci pour ces réponses.

Zone d'inhibition (mm)	Rendu des résultats	Compte rendu
<9	Pas d'activité	0
9-11	Sensible	+
>11	Très Sensible	++

1

25

ANNEXE IV : PROTOCOLE DE REALISATION
D'AROMATOGRAMME DE BACTOLAB, LABORATOIRE
SPECIALISE EN MICROBIOLOGIE, PAR LELOUP A., DELACRETAZ

D. ET APPROUVE PAR TAILLENS S.

	MOS Aromathérapie 5.5.2.41 : Aromatogramme		Analytique
Version : 1
Créé le 29.03.2017 V1 par Audrey Leloup		Approuvé le 29.03.2017 par Suzanne Taillens
Modifié le 10.03.2020 par Dominique Delacrétaz

I. INFORMATION : Les plaques au sang ne sont pas compatibles avec les HE qui hémolysent le sang et rendent la lecture illisible. Les aromatogrammes peuvent s'effectuer sur les staphylocoques, certains streptocoques, entérobactéries, Pseudomonas. Candida : difficile à lire, incuber minimum 48h. La réalisation d'aromatogrammes n'est pas possible sur H. influenzae, Moraxella catarrhalis, germes anaérobies et champignons dermatophytes.

II. CHOIX DES PLAQUES ET PREPARATION DE L'INOCULUM :

Sortir au préalable 2 plaques carrées de MH-E 120 x 120 (Mueller Hinton E). Noter le numéro de

dossier dans un coin de chaque plaque.

Prendre un tube 2 ml de NaCl 0.85% et faire une suspension bactérienne de MF 0.5 selon Kirby Bauer. Ensemencer les plaques à l'aide d'un écouvillon stérile par 3 quadrants.

Déposer à l'aide du distributeur 15 disques par plaque. Noter le N^° d'HE sur chaque disque.

Distribuer les HE à raison de 10ul par disque en respectant l'ordre des HE de 1-30. Incuber 18-24h à 35°C (+/- 2^°C) sous atmosphère normale, (CO2 pour les streptocoques)

Entreposer les aromatogrammes à l'écart des autres plaques de patients dans l'étuve.

III. LECTURE ET INTERPRETATION :

26

ANNEXE V : TABLEAU DES AROMATOGRAMMES REALISES

Numéro	Disques utilisés	Germe utilisé	Gélose utilisée	Conditions de dépôt	Volume déposé	Dépôt exact
A1	disques	Staphylococcus	Mueller	Dépôt de	10 uL	HE de Tea
	en papier	pseudointermedius	Hinton	l'HE avant		Tree diluée
	buvard de 4mm	1		dépôt du disque sur la plaque		à l'HV de sésame 1 = 80 %
						2 = 60 %
						3 = 40 %
						4 = 20 %
						5 = HV
A2	disques	Staphylococcus	Mueller	Dépôt de	10 uL	HE de Tea
	en papier	pseudointermedius	Hinton	l'HE avant		Tree dilué à
	buvard de 4mm	1		dépôt du disque sur la plaque		l'HV de sésame, et ajout de savon
						1 = 5/6 HE
						+ 1/6 savon
						2 = 4/6 HE
						+ 1/6 savon
						3 = 3/6 HE
						+ 1/6 savon
						4 = 2/6 HE
						+ 1/6 savon
						5 = 1/6 HE
						+ 1/6 savon
						6 = HV seule
						(témoin négatif)
A3	disques	Staphylococcus	Mueller	Dépôt de	10 uL	HE de Tea
	en papier	pseudointermedius	Hinton	l'HE avant		Tree ou de
	buvard de 4mm	1		dépôt du disque sur la plaque		Lavande, dilué à l'HV de sésame, et ajout de
						DMSO

27

						1 = 5/7 HE Tea Tree + 2/7 DMSO 2 = 4/7 HE Tea Tree + 2/7 DMSO 3 = 3/7 HE Tea Tree + 2/7 DMSO 4 = 2/7 HE Tea Tree + 2/7 DMSO 5 = 1/7 HE Tea Tree + 2/7 DMSO 6 = 5/7 HE Lavande + 2/7 DMSO 7 = 4/7 HE Lavande + 2/7 DMSO 8 = 3/7 HE Lavande + 2/7 DMSO 9 = 2/7 HE Lavande + 2/7 DMSO 10 = 1/7 HE Lavande + 2/7 DMSO D = DMSO seul (témoin négatif)
A4	disques en papier buvard de 4mm	Staphylococcus pseudointermedius 1	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	T = HE de Tea Tree L = HE de Lavande 1 = disque seul (témoin négatif)
A5	disques en papier buvard de 4mm	Klebsiella ssp. 1 et Escherichia coli	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà	10 uL	Pour chaque germe :

28

				déposé sur la plaque		T = HE de Tea Tree L = HE de Lavande 1 = HV seule (témoin négatif)
A6	double épaisseur de disques en papier buvard de 4mm	Staphylococcus pseudointermedius 1	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	T = HE de Tea Tree L = HE de Lavande 1 = disque seul (témoin négatif)
A7	double épaisseur de disques en papier buvard de 4mm	Klebsiella ssp. 1 et Escherichia coli	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	Pour chaque germe : T = HE de Tea Tree L = HE de Lavande 1 = HV seule (témoin négatif)
A8	double épaisseur de disques en papier buvard de 4mm	Staphylococcus pseudointermedius 1	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus
					5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée

29

						P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus
A9	double épaisseur de disques en papier buvard de 4mm	Escherichia coli	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus
					5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus
A10	disques en papier buvard de 4mm	Staphylococcus pseudointermedius 1	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A11	disques en papier buvard de 4mm	Escherichia coli	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree

30

						A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A12	disques en papier buvard de 4mm	Klebsiella ssp. 1	Mueller Hinton enrichie au sang	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A13	double épaisseur de disques en papier buvard de 4mm	Staphylococcus pseudointermedius 2	Mueller Hinton	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A14	disque en cellulose de 6 mm de diamètre (Dutscher ref 074074)	Staphylococcus pseudointermedius 3	Mueller Hinton	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée

31

						P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A15	disque en cellulose de 6 mm de diamètre (Dutscher ref 074074)	Pasteurella multocida	Mueller Hinton	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	5 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A16	disque en cellulose de 6 mm de diamètre (Dutscher ref 074074)	Staphylococcus pseudointermedius 3	Mueller Hinton	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A17	disque en cellulose de 6 mm de diamètre (Dutscher ref 074074)	Pasteurella multocida	Mueller Hinton	Dépôt de l'HE sur le disque déjà déposé sur la plaque	10 uL	O = HE d'origan T = HE de Tea Tree A = HE d'achillée P = HE de Pin

32

						E = HE d'eucalyptus 1 = disque seul (témoin négatif)
A18	disque en	Staphylococcus	Mueller	Dépôt de	5 uL	O = HE
	cellulose	pseudointermedius	Hinton	l'HE sur le		d'origan
	de 6 mm de diamètre	4		disque déjà déposé sur la plaque		T = HE de Tea Tree
	(Dutscher ref					A = HE d'achillée
	074074)					P = HE de
						Pin
						E = HE d'eucalyptus
A19	disque en	Klebsiella ssp. 2 et	Mueller	Dépôt de	5 uL	pour chaque
	cellulose	Corynebacterium	Hinton	l'HE sur le		germe :
	de 6 mm de diamètre	pyogenes		disque déjà déposé sur la plaque		O = HE d'origan
	(Dutscher ref					T = HE de Tea Tree
	074074)					A = HE d'achillée
						P = HE de
						Pin
						E = HE d'eucalyptus
						1 = disque seul (témoin négatif)

33

ANNEXE VI : PHOTOGRAPHIES DES AROMATOGRAMMES

REALISES

A1	A2
A3	A4

34

A5		A6
A7		A8
A9		A10

35

A11	A12
A13	A14
A15	A16

A17

A19

A18

36

15439 B - fr - 2010/06 Q

EVD

urinaires et l'identification directe d'Escherichia coli,

ANNEXE VII : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE CHROMID^TM CPS, BIOMERIEUX

chrom iD

00 43 821 / 43 829

Gélose chromIDTM CPS (CPS)

Milieu chromogène pour le dénombrement des germes Enterococcus, KESC et Proteeae.

INTRODUCTION ET OBJET DU TEST

La gélose chromlDT" CPS^c est un milieu d'isolement et d'identification destiné aux prélèvements urinaires- II permet de réaliser:

· le dénombrement microbien du prélèvement grâce â une méthode d'ensemencement standardisée.

· l'identification d'espèce ou des genres bactériens suivants

- Escherichia colt, - Enterococcus,

- Kfebsiela, Enterobacter, Serratia, Citrobacter
(KESC),

- Proteus, Providencia, Morganella (Proteeae). (1, 2, 9, 10)

PRINCIPE

La gélose chromIDTM CPS'' est constituée d'une base nutritive riche associant différentes peptones et 3 substrats chromogènes permettant de révéler l'activité enzymatique correspondante.

La révélation de l'indole est favorisée par l'incorporation de tryptophane dans la gélose.

La concentration élevée en agar évite l'envahissement de la gélose par les Proteus.

L'identification des bactéries les plus fréquemment isolées dans les infections urinaires repose sur ie principe suivant :

· E. cou : coloration spontanée (rose à bordeaux) des souches productrices de f3-glucuronidase (f(-GUR) et/ou 15-galactosidase (15-GAL) (3, 4, 9, 10)_

· Enterococcus : coloration spontanée turquoise des souches exprimant une R-glucosidase (R-GLU) (5).

· KESC : coloration spontanée bleu-vert à bleu-gris des souches exprimant une R-glucosidase (R-GLU).

· Proteeae : coloration spontanée marron des souches exprimant une désaminase.

PRÉSENTATION

REFI PEFI

43 821 43 829

Milieux prêts à l'emploi Coffret de 2x10 boîtes (90 mm) Coffret de 10x10 boites (90 mm) CPS'

imprimé sur chaque boîte

COMPOSITION

Formule théorique :

Ce milieu peut être ajusté et/ou supplêmente en fonction des entraves de performances imposés

Peptone de caséine (bovin) 5 g

Peptone de soja 5 g

Peptone de viande ( bovine vu porcine) 8 g

Hydrates de carbone 1 g

L-Tryptophane 0,9 g

Tampon phosphate 1 g

Substrats chromogènes 1,4 g

Melange nutritif 2.9 g

Agar 18 g

Eau purdiee 1 I

pH 7,4

REACTIFS ET MATERIEL NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS

37

Réactif :

· ID Indole-TDA (Réf. 56 541).

· JAMES (Réf. 70 542).

· Oxydase Reagent (Réf 55 635)

Matériel :

· Oeses calibrées de 10 pl.

· Etuve bactériologique.

· Disques non imprégnés 0 6mm (Réf. 54 991).

PRECAUTIONS D'UTILISATION

· Pour diagnostic in vifra uniquement.

· Pour usage professionnel uniquement.

· Ce coffret contient des composants d'origine animale. La maîtrise de l'origine et/ou de l'état sanitaire des animaux ne pouvant garantir de façon absolue que ces produits ne contiennent aucun agent pathogène transmissible, il est recommandé de les manipuler avec les précautions d'usage relatives aux produits potentiellement infectieux (ne pas ingérer ; ne pas inhaler).

· Les prélèvements, cultures bactériennes et produits ensemencés doivent ètre considérés comme potentiellement infectieux et doivent être manipulés de façon appropriée. Les techniques aseptiques et les précautions usuelles de manipulation pour le groupe bactérien étudié doivent être respectées tout au long de la manipulation ; se référer à "CLSI^e M29-A, Protection of Laboratory Workers from occupationally Acquired Infections; Approved Guideline -- Révision en vigueur". Pour informations complémentaires sur les précautions de manipulation, se référer a "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories -- CDCINIH - Dernière édition ", ou à la réglementation en vigueur dans le pays d'utilisation.

· Les milieux de culture ne doivent pas ètre utilises comme matériau ou composant de fabrication.

· Ne pas utiliser les réactifs après la date de péremption.

· Ne pas utiliser les réactifs dont l'emballage est détérioré.

· Ne pas utiliser des boites contaminées ou exsudées,

· N'utiliser qu'un seul prélèvement par boite.

· L'utilisation du milieu peut être délicate pour des personnes ayant des difficultés d'appréciation des couleurs.

· Les performances présentées ont été obtenues avec la méthodologie indiquée dans cette notice. Toute déviation de méthodologie peut modifier les résultats.

· La réalisation du test indole pratiquée directement sur la colonie est déconseillée du fait de la difficulté observer le virage dans cette condition.

· Il existe une incompatibilité entre le milieu chromIDTM CPS^°) et le test fosfomycine présent sur les galeries ATB staph, du fait d'une tendance à une non détection des souches résistantes.

Schéma [A]

Nombre da permes Ma (10') Schéma [B]

110 `) (10') 110'1

Gélose chrornlD^TM CPS (CPS)

15439 B - Ir - 2010/06

CONDITIONS DE STOCKAGE

· Conserver à l'abri de la lumière.

· Les boites se conservent entre 2^°C et 8^°C dans leur coffret jusqu'à la date de péremption.

· La durée de conservation des boites hors du coffret, en sachet cellophane, est de 2 semaines a 2-8°C.

ECHANTILLONS

Le milieu est ensemencé directement a partir d'urine.

Il convient de respecter les bonnes pratiques en terme de prélèvements et de transport.

38

MODEOPERATOIRE

1. Laisser les boîtes revenir à température ambiante.

2. Sécher si nécessaire la surface de la gélose en plaçant les boîtes à l'étuve à 37°C.

3. Ensemencement - manuel :

Le prélèvement est ensemencé dès son arrivée au laboratoire à l'oese calibrée de 10 pl, de la façon suivante :

· Immerger l'oese dans l'urine en la tenant verticalement,

· Décharger l'oese en réalisant une strie sur un rayon de la boite (a) (vérifier que la goutte a bien été déposée),

· Puis, sans recharger l'oese, faire des stries perpendiculaires très serrées sur toute la surface de la boîte (b).

(a) (b)

- automatique avec PREVI^TM Isola

Suivre les instructions indiquées dans le manuel utilisateur du PREVI^TM Isola

4. incuber à l'étuve, couvercle en bas, à 37°C en aérobiose. Le choix de la température d'incubation est de la responsabilité de l'utilisateur en fonction de i'applicatlon et des normes en vigueur. Les cultures sont examinées généralement après 18 à 24 heures d'incubation

LECTURE ET INTERPRETATION

Après incubation, observer la croissance bactérienne Dénombrement :

Estimer la concentration bactérienne en comparant la densité des colonies présentes sur la moitié supérieure de la boîte à celle du schéma [A] pour un ensemencement manuel, ou à celle du schéma [B] pour un ensemencement automatique sur PREVI^TM Isola (15):

Hnmbre da germa, lm!

(10^') (10') (^10') i^{10 `}1 (^10')

L'interprétation des résultats de la numération doit tenir compte de différents paramètres dont la leucocyturie, les signes cliniques et l'épidémiologie. (6,11,12)

Identification :

	Colonies roses à bordeaux	ô^a a	Colonies bleu vert k bleu gris	Colonies beige avec halo marron		Revelation du test indole	E. coli
+-		-	-			Enrerococcus ·
	+	-	-			Groupe KESC
	-	+	-			P. indologéne Providencia Morganella
-	-	-	+	+		P. mirabilis
-	-	-	+	-

1. Identification directe de E.coli sans réalisation de test indole :

· Colonies de couleur rose à bordeaux ou translucides à centre rose à bordeaux : espèce E. cofi.

2. Identification de groupe ou genre :

· Colonies de couleur turquoise et observation de cocci Gram (+) à l'examen direct : genre Enterocaccus.

Si une de ces conditions n'est pas remplie, [identification du micro-organisme isolé doit être réalisée par des tests complémentaires.

· Colonies de couleur bleu vert à bleu gris et observation de bacilles Gram (-) à l'examen direct : groupe KESC.

L'identification du micro-organisme isolé doit être poursuivie par des tests complémentaires.

·

Gélase chromIDTM CPS (CPS) 15439 B-fr-2010105

Colonies beige avec halo marron ou tapis bactérien marron :

Effectuer alors une recherche de l'indole avec le réactif ID Indole-TDA ou avec le réactif de JAMES : déposer une colonie sur un disque de papier préalablement imbibé d'une goutte de réactif R1 du coffret ID Indole TDA ou d'une goutte du réactif de JAMES. Noter la coloration obtenue au bout de quelques secondes :

Coloration réactif de James	Coloration réactif ID Indole-TDA	Interprétation		Identification	Rose a rouge
Bleue	Indole (+)	Proteus indologène, Providencia ou Morganella		Absence de coloration rose â rouge
Absence de coloration bleue	Indole (-]	Proteus mirabifis Confirmer par le test à l'oxydase qui est nàgatif pour les Proteus

de

3. Présomption d'identification

· Colonies rose clair opaque : Présomption

Staphylococcus saprophyticus.
L'identification du micro-organisme isolé doit être poursuivie par des tests complémentaires.

· Colonies bleu-violet à violette : Présomption de Streptococcus agalactiae

L'identification du micro-organisme isolé doit âtre poursuivie par des tests complémentaires.

4. Absence de coloration caractéristique des colonies

L'identification du micro-organisme isolé doit être réalisée.

CONTROLE DE QUALITE

Protocole :

Les spécifications du milieu peuvent être testées vis-à-vis des souches suivantes :

· Escherichia colt ATCC^® 25922

· Enterococcus faecalis ATCC^® 29212

· Proteus miratillis ATCC^® 12453

Résultats attendus :

Souche		Resultats à 33-37^°C		Escherichia col) ATCC^® 25922
Croissance en 24 heures		Colonies rose à bordeaux	Eriteracoccus faecalis ATCC^® 29212
			Proteus mirabilis ATCC^® 12453

Remarque :

39

Il est de la responsabilité de l'utilisateur de prendre en compte la nature de l'application et la législation locale

en vigueur pour la mise en oeuvre du contrôle de qualité (fréquence, nombre de souches, température d'incubation... ).

PERFORMANCES:

La gélose chromlDTM CPS^® (43821) a été comparée à la gélose chromIDTM CPS^® (43541) et à d'autres milieux chromogènes commercialisés.

· Sur souches caractérisées d' E. cor/

Une étude a été réalisée sur 43 souches pures de E. con présentant des profils enzymatiques différents :

Sensibilité de détection :

	Activité enzymatique			Nb. d' E. Corr avec colonie caractéristique			Nbre de souches E. Coll
a-GUR	a-GAL		4354i	43821	Autres milieux	8
-	+		0	8	8	5
+	-		3	4	0	30
+	+		30	30	30	Total =43
.			33143	42143	38/43

Sur le milieu chromIDTM CPS^® (ref 43821) la détection directe de 97,7% des souches est rendue possible par la combinaison de plusieurs substrats chromogènes dans le milieu.

· Sur prélèvements cliniques

Deux études sur échantillons cliniques ont été réalisées : une en France et une en Allemagne.

Lors de ces études, seuls les échantillons à signification clinique (6,11,12) ont été pris en compte avec un seuil de numération 7 à 10 ° UFC/ml.

Les études n'ont montré aucune différence significative entre les milieux sur le plan de la fertilité, de la sensibilité ou de la spécificité.

Sur les 2 sites, la spécificité obtenue pour E. col/ est de 100%.

1. France,

Sur le site France, 1087 urines ont été ensemencés et incubés pendant 18 à 24 heures à 37°C sur 3 milieux différents: chromIDTM' CPS^® (43821), chromIDTM CPS^® (43541) et un milieu chromogène commercialisé.

93,65% des urines n'ont subi aucun prétraitement par conservateur.

A l'issue de cette étude, 229 échantillons avec signification clinique ont été obtenus et analysés.

40

ANNEXE VIII : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE CHAPMAN,

BIO-RAD

CHAPMAN - MANNITOL SALT AGAR

53647 - 63844 - 64134

Milieu d'isolement et de Différenciation des Staphylocoques

1. APPLICATION

La gélose Chapman - Mannitol Salt Agar est un milieu sélectif pour l'isolement et la numération des staphylocoques. Il permet également de différencier les espèces fermentant le mannitol de celles qui ne le fermentent pas.

2. PRINCIPE

La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence de chlorure de sodium qui inhibe la plupart des bactéries à Gram (+) et à Gram (-). La différenciation des Staphylocoques est basée sur leur capacité à fermenter ou non le mannitol. S'il y a fermentation, cela induit une acidification qui entraîne une coloration jaune du milieu en présence de rouge de phénol (indicateur de pH).

3. PRESENTATION

· Milieu prêt à l'emploi

- coffret de 20 boîtes de Petri (90 mm) (MSA) code 63844

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir)

- 6 flacons de 200 ml (MSA) code 53647

· Milieu déshydraté

- flacon de 500 g code 64134

4. COMPOSITION THEORIQUE (en g/l d'eau distillée)

Le milieu Chapman - Mannitol Salt Agar est preparé selon la formule décrite par Chapman (1).

·	Peptone		10	·
Extrait de viande de boeuf	1		·
Chlorure de sodium	75		·
Mannitol	10		·
Rouge de phénol	0.025		·
Agar	15		·
pH final :	7.4 #177; 0.2

Préparation du milieu :

Homogénéiser la poudre contenue dans le flacon.

Mettre 111 grammes de milieu déshydraté dans un litre d'eau distillée stérile. Mélanger jusqu'à obtention d'une suspension homogène. Chauffer lentement en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu'à dissolution complète. Stériliser à l'autoclave à 121° C pendant 15 minutes. Répartir en boîtes de Petri ou en flacons.

5. CONSERVATION

· Milieu prêt à l'emploi (Petri) : à + 2 - 20°C.

· Milieu prêt à l'emploi (tubes et flacon) : à + 2 - 8°C.

· Milieu déshydraté : flacon soigneusement fermé dans un endroit sec à +15-25°C. La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le conditionnement.

6. UTILISATION

Matériel :

· Matériel fourni : milieu Chapman - Mannitol Salt Agar

Ensemencement :

Ensemencer directement en stries à partir de l'échantillon à étudier. Pour la conservation des échantillons biologiques, se référer aux recommandations en vigueur (2).

1

41

Incubation :

Incuber pendant 24 à 48 heures à 37°C.

Lecture :

· Mannitol (+) : coloration jaune du milieu.

· Mannitol (-) : absence de coloration.

Les souches de Staphylococcus aureus élaborent leur propre pigment. Les colonies s'entourent en 24 à 48 heures d'une auréole jaune due à la fermentation du mannitol. Les souches de Staphylococcus epidermidis et autres Micrococcaceae donnent naissance à de petites colonies, qui, dans la majorité des cas, se développent sans modifier la teinte du milieu. Cependant, une minorité non négligeable de souches de S. epidermidis est capable de fermenter le mannitol.

7. PERFORMANCES 1 CONTRÔLE QUALITE DU TEST

· Aspect du milieu prêt à l'emploi : gélose limpide rouge.

· Aspect du milieu déshydraté : poudre rosée.

· Les performances culturales du milieu de Chapman - Mannitol Salt Agar sont contrôlées à l'aide des souches suivantes :

SOUCHES	RÉSULTAT DE LA CULTURE EN 2448 H à 37°C
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Colonies jaunes
Staphylococcus saprophyticus A TCC 15305	Colonies jaunes
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228	Colonies rosées
Proteus mirabilis ATCC 25933	Inhibition partielle
Escherichia toll A TCC 25922	Inhibition

8. CONTRÔLE QUALITE DU FABRICANT

Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits f nis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

9. LIMITES D'UTILISATION

· Il est nécessaire de faire des tests complémentaires pour une identification d'espèce de la souche isolée.

· Les entérocoques et les streptocoques du groupe D peuvent se développer sur ce milieu et présenter une légère fermentation du mannitol. Cependant les colonies sont petites et peuvent facilement être différenciées des staphylocoques par coloration de Gram ou parle test de la catalase.

10. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. CHAPMAN, G.H., The significance of sodium chloride in studies of staphylococci, J. Bact. 1945. 50 : 201-203.

2. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva.1991. 1st edition.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: [phone] Fax: [phone] www.bio-rad. corn		CE 05/2011

42

ANNEXE IX : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE MACCONKEY,

BD

43

Consulter le document « MODE D'EMPLOI GENERAL » pour connaître les procédures de manipulation aseptique, les risques biologiques, ainsi que les méthodes d'élimination des produits utilisés.

STOCKAGE ET DUREE DE CONSERVATION

Dès réception, conserver les boites de Pétri dans l'obscurité entre 2 et 8 °C, dans leur emballage d'origine, jusqu'au moment de leur utilisation. Ne pas congeler ni surchauffer. Les boites peuvent être ensemencées jusqu'à leur date de péremption (voir étiquette sur l'emballage) et incubées pendant le délai d'incubation recommandé.

Des boîtes provenant d'une pile ouverte de 10 boîtes sont utilisables pour une semaine lorsqu'elles sont conservées entre +2 et +8 °C dans un endroit propre.

CONTROLE DE QUALITE PAR L'UTILISATEUR

Inoculer les échantillons représentatifs avec les souches ci-dessous (pour plus d'informations, voir le document « MODE D'EMPLOI GENERAL »). Incuber les boîtes de Pétri à 35 #177; 2 °C en atmosphère aérobie. Observer les boîtes de Pétri après 18 à 24 h pour mesurer la croissance, la taille des colonies, la pigmentation et la sélectivité.

Souches	Croissance
Escherichia coli ATCC 25922	Croissance, colonies de couleur rose
Proteus mirabiiis ATCC 12453	Croissance, colonies incolores à beiges, essaimage inhibé
Salmonella Typhimurium ATCC 14028	Croissance, colonies incolores à beiges
Salmonella Abony DSM 4224	Croissance, colonies incolores à beiges
Shigella flexneri ATCC 12022	Croissance, colonies incolores
Enterococcus faecalis ATCC 29212	Inhibition partielle à complète
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Inhibition partielle à complète
Non inoculé	Couleur rose clair, légèrement opalescente

METHODE

Matériel fourni

BD MacConkey II Agar (boîtes de Pétri Stacker de 90 mm). Produit soumis à contrôle microbiologique.

Matériel non fourni

Les milieux de culture auxiliaires, réactifs et matériel de laboratoire requis.

Types d'échantillons

Ce milieu sélectif, qui sert à isoler les Enterobacteriaceae ainsi que de nombreux autres bâtonnets Gram-négatifs, est utilisable pour tous les types d'échantillons cliniques et pour de multiples matières non cliniques (voir également la section « CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ET LIMITES DE LA PROCEDURE »).

Mode opératoire du test

Diluer l'échantillon par striation dès que possible après réception par le laboratoire. La boîte à striation sert principalement à isoler les cultures pures des échantillons contenant des flores mixtes.

Si la matière doit être cultivée directement à partir d'un écouvillon, rouler ce dernier sur une petite surface de la boîte de Pétri près du bord, puis strier l'échantillon depuis cette zone inoculée. Il convient d'ensemencer également un milieu non sélectif tel que la Columbia Agar with 5 % Sheep Blood pour signaler la présence d'autres organismes dans l'échantillon. Incuber les boites de Pétri à l'abri de la lumière, à 35 #177; 2 °C pendant 18 à 24 h, davantage si nécessaire (ne pas utiliser la MacConkey II Agar sous une atmosphère enrichie en CO₂).

44

Résultats

Généralement, les colonies isolées sur la BD MacConkey II Agar présentent la morphologie suivante :

Organismes	Croissance
E. coli	Colonies de couleur rose à rose-rouge, parfois cernées par une zone de précipitation biliaire
Enterobacter, Klebsiella	Muqueuse, colonies de couleur rose
Proteus	Colonies incolores, essaimage inhibé autour des colonies isolées*
Salmonella, Shigella	Colonies incolores. Couleur du milieu : orange à ambré
Pseudomonas	Irrégulière, colonies incolores à roses

Les bactéries Gram-positives font l'objet d'une inhibition partielle à complète.

CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES ET LIMITES DE LA PROCEDURE La BD MacConkey II Agar figure parmi les milieux utilisés en standard pour l'ensemencement primaire d'échantillons cliniques et de nombreuses matières non cliniques. Ce milieu favorise le développement de tous les organismes de la famille des Enterobacteriaceae ainsi que de nombreux autres bâtonnets Gram-négatifs, par exemple les Pseudomonas et les genres associés.^5-9 Les non-fermentants ou les autres bâtonnets Gram-négatifs sensibles à ses composants sélectifs ne se développent pas dans ce milieu. Avant d'utiliser ce milieu pour des organismes spécifiques, consulter les chapitres correspondants dans les documents de référence.⁵°⁹

Selon certaines sources, des Enterobacteriaceae et des Pseudomonas aeruginosa sont inhibées sur la MacConkey Agar lorsqu'elle est incubée sous une atmosphère enrichie en CO₂.¹⁰ Il est certes possible de procéder à divers tests diagnostiques directement dans ce milieu, mais, pour obtenir une identification complète, il convient d'employer des tests biochimiques et, si nécessaire, immunologiques, faisant appel à des cultures pures. Consulter les documents de référence appropriés. ^5-7'⁹

REFERENCES

1. MacConkey, A.T. 1900. Note on a new medium for the growth and differentiation of the Bacillus coli communis and the Bacillus typhi abdominales. The Lancet, Part 11:20.

2. MacConkey, A. 1905. Lactose-fermenting bacteria in faeces. J. Hyg. 5:333-379.

3. Levine, M., and H.W. Schoenlein. 1930. A compilation of culture media for the cultivation of microorganisms. The Williams & Wilkins Company, Baltimore.

4. MacFaddin, J.F. 1985. Media for isolation-cultivation- identification-maintenance of medical bacteria, vol. 1. Williams & Wilkins, Baltimore.

5. Baron, E.J., L.R. Peterson, and S.M. Finegold. 1994. Bailey & Scott's diagnostic microbiology, 9th ed. Mosby-Year Book, Inc., St. Louis.

6. Farmer Ill, J.J. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

7. Downes, F.P., and K. Ito. 2001. Compendium of methods for the microbiological

examination of foods. ^4th edition. American Public Health Association (APHA). Washington, D.C. USA.

8. Thomson, R.B., and J.M. Miller. 2003. Specimen collection, transport, and processing: bacteriology. ln: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology,

Washington, D.C.

9. Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). 2003. Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

10. Mazura-Reetz, G., T.R. Neblett, and J.M. Galperin. 1979. MacConkey agar: CO, vs. ambient incubation, abstr. C 179, p. 339. Abstr. 79th Annu. Meet. Am. Soc. Microbial. 1979.

45

ANNEXE X : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE HEKTOEN, BIO-

RAD

HEKTOEN REF 54386

REF I 63894 IR&I 64284

MILIEU D' ISOLEMENT SELECTIF DES SALMONELLA SP. ET SHIGELLA SP.

IVD		CE
	2014104

1- APPLICATION

La gélose Hektoen est un milieu sélectif pour l'isolement et la différenciation des bacilles Gram (-) entéropathogènes, en particulier les Salmonelles sp. et les Shigella sp.

2- PRINCIPE

La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence de sels biliaires, de bleu de bromothymol et de fuchsine acide (inhibition des bactéries à Gram (+), des E cou et dans une moindre mesure, des Proteus et des Citrobacter).

La qualité nutritive des peptones et des sucres neutralise l'effet inhibiteur des sels biliaires vis à vis de certaines bactéries délicates et permet une bonne culture des Shigefla.

La différenciation des entérobactéries est basée sur leur capacité à fermenter différents sucres : le lactose, le saccharose, la salicine. Deux indicateurs permettent de visualiser la réaction : le bleu de bromothymol qui vire au jaune en présence d'acide et la fuchsine qui se colore en rouge en présence d'aldéhyde.

Une différenciation supplémentaire reposant sur la production d'hydrogène sulfuré est possible grace à la présence de thiosulfate de sodium et de citrate de fer. Elle se traduit par des colonies à centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer.

3- PRESENTATION.

· Milieu prêt à l'emploi :

- coffret de 20 boites de Petri (90 mm) (HEKT) code 63894

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir)

- 6 flacons de 100 ml (HEKT) code 54386

· Milieu déshydraté

- Flacon de 500g code 64284

4- COMPOSITION THEORIQUE (en gll d'eau distillée) Le milieu Hektoen est préparé selon la formule décrite par S. Kings et al (1).

Protéose peptone		12	Extrait de levure
3		Chlorure de sodium
5		Thiosulfate de sodium
5		Sels biliaires
9		Citrate de fer ammoniacal
1,5		Salicine
2		Lactose
12		Saccharose
12		Fuchsine acide
0,1		Bleu de bromothymol
0,065		Agar
14		pH final
7,5 #177; 0,2

Préparation du milieu :

Homogénéiser la poudre contenue dans le flacon.

Mettre 75 grammes de milieu déshydraté dans un litre d'eau fraîchement distillée. Chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu'à dissolution complète. Laisser refroidir à 50°C avant répartition en boites de Petri ou en flacon. Précaution d'utilisation : NE PAS AUTOCLAVER.

5- CONSERVATION

· Milieu prêt à l'emploi : à +2-8°C

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir) : à +2-8T

· Milieu déshydraté : flacon soigneusement fermé dans un endroit sec à +15-25°C. La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le conditionnement.

1

46

6- UTILISATION

Matériel :

· Matériel fourni : milieu Hektoen.

Ensemencement:

Ensemencer en stries à partir de l'échantillon à étudier (suspension de selles ou écouvillon). Pour la conservation des échantillons biologiques, se référer aux recommandations en vigueur (2).

Incubation :

Incuber pendant 24-48 heures à 37°C.

Lecture :

La fermentation d'au moins un des sucres se traduit par une coloration "saumon" des colonies. L'absence de fermentation se traduit par une coloration bleue ou verte des colonies.

La production d'hydrogène sulfuré (H2S) est caractérisée par des colonies à centre noir.

· Colonies "saumon" : Escherichta, Levinea, Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Yersinia.

· Colonies "saumon" à centre noir : Proteus vulgaris.

- Colonies bleues-vertes ou vertes : suspicion de Shigefla ou de Salmonella à différencier de Proteus morganti ou rettgeri de Providencia, Hafnia, Levinea, Plesiomonas, Pseudomonas (le test de l'oxydase permet de différencier les Pseudomonas).

· Colonies bleues-vertes ou vertes à centre noir : suspicion de Salmonella ou de Proteus mirabilis (la recherche de l'uréase permet de différencier P. mirabilis).

7- PERFORMANCES f CONTROLE QUALITE DU TEST - Aspect du milieu prêt à l'emploi : gélose limpide verte - Aspect du milieu déshydraté : poudre rosée

· Les performances culturales du milieu Hektoen sont contrôlées à l'aide des souches suivantes :

SOUCHES	RESULTAT DE LA CULTURE EN 24-48h à 37°C
Escherichta colt ATCC 25922	Colonies saumon, inhibition partielle
Enterobacter aerogens ATCC 13048	Colonies saumon
Shigella tfexnert ATCC 12022	Colonies vertes
Shigella sonnet ATCC 25931	Colonies vertes
Proteus mirabilis ATCC 25933	Colonies bleues-vertes à centre noir
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Inhibition totale

8- CONTROLE QUALITE DU FABRICANT

Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

9- LIMITES D'UTILISATION

· Certaines Salmonella arizonae, Shigella sonnet et Vibrio cholerae peuvent se développer en colonies jaunes rosées.

· Les Pseudomonas peuvent se développer en petites colonies brunes et bleuàtres.

· II est nécessaire de faire des tests complémentaires pour une identification d'espèce de la souche isolée.

10- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Kings S. et al, 1968. A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. IL Comparison of hektoen enteric agar with SS and EMB agar. Appl. Microbiol. 16 : p.577-578.

2. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva.1991. 1st edition.

3. TAYLOR W.I et al, 1971. Appl Microbial. 21 : p.32-37.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel_ : [phone] Fax : [phone] www.bio-rad.com		CE 2014/04

47

ANNEXE XI : FICHE TECHNIQUE DE LA GELOSE MUELLER-HINTON, BIO-RAD

MUELLER - HINTON 56137 - 63824 - 63901 - 64884 - 64888

MUELLER-HINTON + SANG DE MOUTON 63825 - 63902

MUELLER-HINTON + SANG DE CHEVAL + I3-NAD 63524

MILIEU DE CULTURE POUR L'ETUDE DE LA SENSIBILITE AUX AGENTS ANTIMICROBIENS

IVD

1- APPLICATION

La gélose Mueller--Hinton est un milieu solide standardisé recommandé pour l'étude de la sensibilité des bactéries aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion ou de dilution en gélose_

2- PRINCIPE

La standardisation du milieu de Mueller-Hinton est nécessaire pour obtenir des résultats fiables au niveau de l'antibiogramme.

Celle-ci concerne la composition du milieu avec des concentrations limites de CaCl2, MgCl2 et ZnClz.

2+ 2+

En effet, il est reconnu que des variations dans les concentrations de cations Mg et Ça affectent les résultats obtenus (diamètres et concentrations minimales inhibitrices ou C.MJ.) sur les Pseudomonas aeruginosa avec les aminosides et sur les staphylocoques avec la tétracycline ra, 4, s, 6y

De plus, la faible teneur en thymidine diminue les phénomènes de repousse autour des disques de fiméthopnme-sulfamides et de tnméthopnme seul.

3- PRESENTATION

· Milieu prêt à l'emploi

- coffret de 20 bottes de Petri rondes (90 mm) (MH) code 63824

- coffret de 10 boites de Petri carrées (120 mm) (MH) code 63901

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir)

- 6 flacons de 200 ml (MH) code 56137

·

code 64884

Milieu déshydraté :

- flacon de 500 g

- fût de 5 kg code 64888

· Milieu au sang de mouton prêt à l'emploi :

- coffret de 20 boîtes de Petri rondes (90 mm) (MHB) code 63825

- coffret de 10 boites de Petri canées (120 mm) (MHB) code 63902

· Milieu au sang de cheval additionné de 13-NAD prêt à remploi

coffret de 20 boites de Petri rondes (90 mm) (MHF) code 63524

4-COMPOSITION THEORIQUE (en g!I d'eau distillée)'

Le milieu Mueller-Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval est préparé selon la formule décrite par W.H.O.

Peptones		3,0	Hydrolysat de caséine
17,5		Agar
15		Ca^z+
20 - 25 mg1L		Mg^t-.
10 - 12,5 mgfL		pH final
7,4 #177; 0,2		Suppléments : + 5% sang de mouton (pour le milieu MHB) ou 5% sang de cheval (pour le milieu MHF)
		13-NAD (pour le milieu MHF)
20 mgfL

p-NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

formule adaptée pour assurer les meilleures performances du milieu.

Préparation du milieu :

Homogénéiser la poudre contenue dans le flacon.

Mettre 35 grammes de milieu déshydraté dans 1 litre d'eau fraichement distillée. Porter à ébullition jusqu'à dissolution complète

1

BIO RAD

48

Stériliser à l'autoclave i 121°C + 1°C pendant 15 minutes. Répartir dans des tubes ou dans des flacons stériles_

Au moment de l'emploi, faire tondre le milieu au bain-mane bouillant et répartir en bodes de Petri rondes l'intégralité du flacon ou des tubes. L'épaisseur de la couche de gélose doit être de 4 mm. Sécher les boites 30 min à 37°C. Le volume de Mueller-Hinton permettant d'obtenir exactement une épaisseur de 4 mm est de 25 ml pour une boite de 90 mm, de 60 ml pour une boite carrée de 120 mm, de 70 ml pour une boite ronde de 150 mm.

Au moment de l'emploi (avant la répartition), il est possible d'ajouter :

· 5 % de sang de mouton ou de cheval pour le milieu Mueller-Hinton au sang,

· 5 % de chlorure de sodium (NaCI) pour le milieu Mueller-Hinton hypersalé_

5- CONSERVATION

· Milieu prêt à l'emploi : à +2-20°C

· Milieu prêt à l'emploi (à répartir) à +2-25°C

· Milieu au sang pré! A l'emploi à +2-8°C

· Milieu déshydraté : tacon soigneusement fermé dans un endroit sec à +15-25°C_ La date de péremption et le numéro de lot sont indiqués sur le conditionnement.

6- UTILISATION

Matériel :

Matériel fourni : Milieu Mueller-Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval Matériel spécifique non fourni :

· Témoin d'opacité équivalent au standard Mac Farland 0.5

· Matériel de laboratoire nécessaire pour la réalisation des antibiogrammes par la méthode de diffusion en milieu gélosé.

Précautions d'utilisation : Suivre les instructions d'utilisation des recommandations en vigueur CLSI ^4,e, CA-SFM ^{91, EUCAST ^(1°11.12r. Observer à tout moment les techniques et précautions en vigueur en matière de protection contre les dangers microbiologiques.

Ensemencement :

A partir d'une culture pure et fraiche prélevée sur milieu gélosé, préparer une suspension d'une opacité équivalente au standard de Mac Farland 0,5. Le protocole de standardisation de l'inoculum est décrit dans les différentes recommandations émises par le CLSI, le CA-SFM ou l'EUCAST pour la méthode en diffusion et la méthode de dilution en gélose.

Si le milieu est conservé à 4°C, le ramener à température ambiante (18-30°C)

Si un excès d'humidité est observé en surface, il est conseillé, avant utilisation, de sécher les boites pendant 10 à 30 min à l'étuve à 35°C_

METHODE EN DIFFUSION

Ensemencement par inondation (méthode préconisée par le CA-SFM)

A partir de l'inoculum standardisé, suivre la procédure indiquée par le CA-SFM concernant la dilution de la suspension initiale

en fonction des espèces bactériennes testées

Inonder la boite entière avec la suspension obtenue puis enlever l'excès de suspension_

Ensemencement par écouvillonnage (méthode de Kirby-Bauer préconisée par le CLSI, le CA-SFM ou l'EUCAST) : A partir de l'inoculum standardisé, suivre les recommandations du CLSI pour ensemencer la boite

· Plonger un écouvillon stérile, non toxique dans la suspension

· L'essorer doucement sur les parois.

· Ensemencer la boite à l'aide de l'écouvillon afin d'obtenir une culture de colonies confluantes_ Appliquer les disques à l'aide d'un distributeur ou à la pince en appuyant légèrement.

METHODE DE DILUTION EN GELOSE

L'ensemencement et le protocole opératoire sont détaillés dans les recommandations du CLSI et du CA-SFM.

Incubation :

Suivre les recommandations en vigueur du CLSI ou du CA-SFM ou de l'EUCAST. Les conditions d'incubation varient selon l'espèce bactérienne testée.

7-INTERPRETATION DES RESULTATS

L'interprétation du test de sensibilité aux antibiotiques selon la méthode des disques ou la méthode de dilution en gélose est détaillée dans les mises A jour périodiques du CASFM, du CLSI ou de l'EUCAST.

8- PERFORMANCES I CONTROLE QUALITE DU TEST

· Aspect du milieu Mueller-Hinton prêt à l'emploi : gélose limpide à opalescente, ambrée.

· Aspect du milieu Mueller-Hinton déshydraté : poudre beige

· Aspect du milieu Mueller-Hinton + sang prêt à l'emploi : gélose rouge_

·	2
1310 RAD

49

Les performances culturales du milieu Mueller Hinton avec ou sans addition de sang de mouton ou de cheval sont contrôlées à l'aide des souches suivantes :

SOUCHES	RÉSULTAT DE LA CULTURE EN 24 H à 37°C
Escherichia coltATCC 259221 CIP 7624	Culture correcte
Pseudomonas aeruginosa ATCC 278531 CIP76110	Culture correcte
Staphylococcus aureus ATCC 259231 CIP 7625	Culture correcte
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619	Culture correcte
Haemophifus intluenzae NCTC 84681 CIP 54.94	Culture correcte

Le contrôle de la composition du milieu MH s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive):

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Escherichia cari ATCC 259221 CIP 7624 - Amikacine 30 pg - Ampicilline 10 pg - Tetracycline 30 pg	Diamètres d'inhibition conformes aux normes en vigueur (CLSI et/ou CA-SFM) ")
Staphylococcus aureus ATCC 25923 i CIP 7625 - Amikacine 30 pg - Cefalotine 30 pg - Tetracycline 30 pg
Pseudomonas aeruginosa ATCC 278531 CIP 76110 - Amikacine 30 pg - Cefotaxime 30 pg - Ciprofloxacine 5 pg

Le contrôle de la composition du milieu MHB s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive) :

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Erythromycine 15 pg - Penicilline 10 UI - Tetracycline 30pg	Diamètres d'inhibition conformes aux normes CLSI en vigueur °.
aeruginosa aeruginosa ATCC 27853 / CIP 76110 - Amikacine 30 pg - Cefotaxime 30 pg - Ciprofloxacine 5 pg

Le contrôle de la composition du milieu MHF s'effectue à l'aide des souches et des disques suivants (liste non exhaustive) :

SOUCHES	ANTIBIOGRAMME
Haemophifus intluenzae NCTC 8468 f CIP 54.94 - Ampicilline 2 pg - Cefaclor 30 pg - Tetracycline 30 pg	Diamètres d'inhibition conformesz1 aux normes EUCAST en vigueur
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Erythromycine 15 pg - Norfloxacin 10 pg - Rifampin 5 pg - Tetracycline 30 pg

9-CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT

Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant.

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10- LIMITES D'UTILISATION

Il est indispensable de procéder à partir de cultures pures et fraîches sous peine de faux résultats_

Certaines bactéries peuvent ne pas se développer sur le milieu MH du fait de leurs exigences nutritionnelles_ II est alors recommandé d'utiliser un milieu approprié HTM pour Haemophilus, Mueller-Hinton additionné de 5% de sang de mouton pour Streptococcus poeumonfae et les streptocoques 13 hémolytiques, GC agar pour Neisseria gonorrhoae_ Ces recommandations sont bien décrites dans les différents référentiels CLSI, CASFM ou EUCAST_

Un certain nombre de facteurs peuvent affecter les résultats (taille de l'inoculum, durée et atmosphère d'incubation _-)_ Il est donc impératif de respecter le protocole décrit dans la procédure en vigueur (CLSI, CASFM, EUCAST._.).

Le milieu Mueller-Hinton au sang frais n'est pas recommandé pour tester la sensibilité de S_ pneumoniae au cotrimoxazole en

11- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization. 1981. Technical report series 673 (Révision 1981) W_H_O_, Geneva - p156-192_

2- World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization_ 1992. Technical report series 822 W_H d_, Geneva

3- Casillas, E,Kenny, M.A., Minshew B.H., Schoenknecht, F. 1981. Effect of ionized calcium and soluble magnesium on the predictability of the performance of Mueller-Hinton agar susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa with Gentamicin. Antimicrob_ Agents Chemother_ 79987-992_

4- Murray, P_R_ Zeitinger, J_ R 1981 Evaluation of Mueller-Hinton agar for disk diffusion susceptibility tests J Clin_ Microbiol_ 18- 1269-1271

5_ D'Amato, RE_, Thomsberry C., Baker C_N_, Kirven, L A_ 1976_ Effect of calcium and magnesium ions on the susceptibility
of Pseudomonas species to Tetracycline, Gentamicin Polymyxin B, and Carbenicillin_ Antimicrob_ Agents Chemother_ 7^.596-600. 596-600.

6_ U'Amato, RE_, Thornsberry C 1979. Calcium and Magnesium in Mueller-Hinton agar and their influence on disk diffusion
susceptibility results. Current Microbiol_2:135-138

7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2010. Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial
susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa.

8_ Clinical and Laboratory Standards Institute_ 2010_ CLSI document M100-S19 Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa.

9. Comité de l'antibiogramme. 2010. French Society of Microbiology.

10. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. Media preparation for disc diffusion testing V1.0.

11. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2009. EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method summary- V1.0.

12. European Committee on Antimicrobial susceptibility testing (EUCAST). 2010. EUCAST QC Tables V1.1.

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