II-3-2-6 Recherche et dénombrement
simultanés des coliformes totaux et d'Escherichia coli dans l'eau
potable avec le milieu de culture MI : méthode par filtration sur
membrane
Appareillage
· Stérilisateur à rayons ultraviolets
· Boîtes de Pétri d'environ 49 mm x 9 mm
· Membranes filtrantes stériles quadrillées de
porosité de 0,45 ìm et de 47 mm de diamètre
· Pincettes en acier inoxydable à bouts plats
· Pipettes stériles de 10,0 ml et 1,0 ml de type TD
· Thermomètre permettant une lecture à 0,5
°C
· Tubes à essais de 16 mm x 125 mm avec bouchons
· Fil à boucle
· stéréoscope
· Autoclave
· Incubateur dont la température est ajustée
à 35 °C #177; 0,5 °C
· Balance analytique avec une précision de 0,0001 g
· Rampe de filtration avec entonnoirs et supports de filtres
· pH-mètre
· Plaque chauffante agitatrice avec barre magnétique
· Réfrigérateur maintenant une
température entre 1 °C et 4 °C
· Pompe à vide
· Hygromètre
· Flacons laveurs pour l'eau de rinçage
· Bouteilles de 150 ml avec bouchon
· Lampe à ultraviolets d'une longueur d'onde de 365
nm et d'une puissance de 4 ou 6 W
· Chambre d'observation à rayons ultraviolets
· . Disque de filtration de 0,2 ìm monté sur
une seringue jetable de 10 ml
Protocole
Tous les échantillons d'eau ou les échantillons
très liquides doivent être homogénéisés en
agitant vigoureusement les bouteilles d'un mouvement vertical.
Les échantillons soupçonnés d'être
plus contaminés (eaux brutes, eaux de puits de surface, captage de
source, etc.) doivent être traités de façon à
obtenir, pour un volume donné d'échantillon, entre 20 et 80
colonies cibles sur la membrane et ainsi permettre une lecture juste et rapide
du nombre de colonies. Pour l'eau potable, un volume d'échantillon de
100 ml doit être vérifié, mais il peut être
réparti en plusieurs volumes plus faibles sur plusieurs membranes.
Des dilutions en série peuvent aussi être
effectuées de la façon suivante :
· en conditions aseptiques, pipetter 10 ml
d'échantillon dans 90 ml d'eau tamponnée de dilution (1 : 10) ou
encore 10 ml de la dilution 1 : 10 d'un échantillon solide dans 90 ml
d'eau tamponnée de dilution (1 : 100);
· bien agiter la bouteille d'eau tamponnée de
dilution afin d'homogénéiser son contenu;
· répéter cette opération
jusqu'à l'obtention de la dilution désirée (1 : 100, 1 : 1
000, 1 : 10 000, etc.);
changer de pipette entre chaque dilution.
ANALYSE DE L'ÉCHANTILLON
· Placer les entonnoirs et les supports dans le
stérilisateur à rayons ultraviolets pendant 2 minutes.
· Mettre les supports et les entonnoirs sur la rampe de
filtration.
Mettre en fonction l'appareil à vide.
· Prendre une membrane filtrante stérile
près du bord à l'aide d'une pincette stérilisée par
flambage à l'alcool et la déposer ensuite sur le support de
filtre.
· Placer l'entonnoir sur le support et le fixer
fermement.
· Verser 100 ml de l'échantillon pour l'eau
potable ou le volume approprié pour les cas particuliers. Pour les
volumes de 10 ml ou moins, introduire de 20 à 30 ml d'eau
tamponnée de rinçage dans l'entonnoir de filtration.
Ensuite, prélever à l'aide d'une pipette stérile le volume
d'échantillon désiré. Laisser couler l'échantillon
en appuyant le bout de la pipette sur l'épaulement interne de
l'entonnoir. Enlever la dernière goutte de la pipette à l'aide de
la poire.
· Faire le vide pour filtrer l'échantillon.
· Rincer au moins deux fois la paroi intérieure de
l'entonnoir avec environ 20 ml à 30 ml d'eau tamponnée de
rinçage stérile (utiliser un flacon laveur). Rincer davantage
s'il y a possibilité de forte contamination.
Retirer l'entonnoir et déposer la membrane filtrante
à l'aide d'une pince stérile sur une gélose MI.
NB - Déposer la membrane en la
déroulant pour obtenir un contact étroit avec la gélose.
La présence de bulles d'air est signalée par des taches
blanches.
· Inscrire sur la boîte de Pétri le
numéro de l'échantillon et le volume filtré.
· placer les boîtes de Pétri en position
inversée dans un incubateur à 35 °C #177; 0,5 °C
pendant 24 heures #177; 2 heures le plus tôt possible après la
filtration. L'inversion des boîtes de Pétri empêche la
condensation sur les membranes.
OBSERVATION DES RÉSULTATS
· Après la période d'incubation, sortir et
ranger les boîtes de Pétri par ordre de numéro
d'échantillon. L'observation des membranes s'effectue le plus tôt
possible après leur sortie de l'incubateur.
· Choisir les membranes sur lesquelles il y a entre 20 et
80 colonies cibles et au maximum de 200 colonies de toutes sortes.
· Observer d'abord les boîtes de Pétri avec un
éclairage normal pour vérifier la présence de colonies
d'E. coli.
· Les colonies d'E. coli sont bleues sous un
éclairage normal.
· Les colonies d'E. coli peuvent être
visibles et dénombrables malgré la présence d'un tapis de
croissance ou de > 200 colonies atypiques ou > 200 colonies de coliformes
totaux. Cependant, lorsque la membrane est très chargée en
colonies, l'absence de colonies bleues typiques d'E. coli ne garantit
pas l'absence de cette bactérie.
· Avec un éclairage normal, dénombrer les
colonies de toutes sortes.
· Observer ensuite les boîtes de Pétri avec un
éclairage fluorescent à 365 nm pour vérifier la
présence de coliformes totaux. Effectuer cette observation dans
l'obscurité lorsque la fluorescence n'est pas nette.
· Les colonies de coliformes totaux sont fluorescentes.
· Les colonies bleues (E. coli) sont aussi des
coliformes totaux.
· Le nombre de coliformes totaux est la somme des colonies
bleues (fluorescentes ou non) et des colonies fluorescentes (non bleues).
- Un résultat positif apparaissant avant une durée
d'incubation de 24 heures est valide.
- Les résultats négatifs ne sont définitifs
qu'après une période d'incubation de 24 heures.
- Un résultat négatif après 24 heures est
valide.
Si la lecture est difficile, effectuer les observations à
l'aide d'un stéréoscope aux grossissements de 10 X à 15 X.
Placer la lampe à un angle minimum de 80° avec le plan de la lame
de microscope. Ne pas vérifier la fluorescence avec le
stéréomicroscope.
Inscrire sur la feuille de travail le nombre de colonies
bleues, de colonies fluorescentes et de colonies atypiques (non bleues et non
fluorescentes) correspondant au volume d'eau filtrée et reporter le
résultat par 100 ml.
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