5.2.4 Les travaux envisagés
Concernant la caractérisation et l'évaluation des
cacaoyers de Guyane, les activités suivantes seront menées dans
le cadre du projet :
- Identification (sur la base de critères
morphologiques) de souches locales de Phytophthora pathogènes
du cacaoyer (P. palmivora et P. capsici). Isolement et mise en culture
des souches pour leur caractérisation moléculaire.
Stratégie identique pour M. perniciosa et C.
fimbriata. (à réaliser en Guyane par un étudiant de
niveau M1 de l'Université Antilles-Guyane).
- Evaluation (au laboratoire) d'environ 190 génotypes
guyanais pour leur résistance aux Phytophthora, sur disques de
feuilles (et sur cabosses détachées pour un échantillon de
clones résistants). Tests en pépinière sur les mêmes
génotypes pour la résistance à M. perniciosa.
(par dépôt d'une goutte gélosée d'inoculum).
Test sur baguettes des mêmes génotypes pour l'évaluation de
la résistance à C. fimbriata. Test au
pénétromètre pour évaluer la dureté des
cabosses (à réaliser en Guyane).
- Transfert du matériel végétal
résistant et/ou intéressant pour d'autres critères au
Cirad à Montpellier pour l'évaluation de son niveau de
résistance vis-à-vis de P. megakarya (espèce
très dangereuse mais non présente en Amérique), et
également de souches plus agressives de M. perniciosa
originaires d'autres pays d'Amérique, voire de souches de
Lasiodiplodia sp. (à réaliser à Montpellier, en
partie par un étudiant M1).
5.2.5 Les protocoles expérimentaux
Tous les protocoles devront faire l'objet d'une adaptation locale
; voici, dans l'état actuel des connaissances, ce que l'on peut proposer
:
A) Evaluation de la résistance aux Phytophthora
- Clones de cacaoyers à tester
L'étude concernera la parcelle S5 de la station de
Combi, installée sous ombrière artificielle. 191 objets seront
testés, dont 186 clones de cacaoyers spontanés guyanais. Les
autres origines sont représentées par deux témoins de
résistance (SCA 6, répété deux fois, et T 60/887)
et GF 24, un clone guyanais "Primitif" (cloné dans les
variétés anciennement cultivées) déjà inclus
dans un essai multilocal CFC/ICCO/IPGRI. Les témoins de
sensibilité sont deux clones spontanés guyanais,
déjà testés à Montpellier.
- Témoins Résistants : SCA 6 et T 60/887
- Témoins Sensibles : ELP 40-B
(répété deux fois) et OYA 2-B
- Matériel fongique : souches de Phytophthora
spp.
On utilisera des souches locales (testées pour leur
virulence) de P. palmivora et de P. capsici.
- Culture des souches : la culture des souches se
réalise sur milieu gélosé PDA ou V8 en boîtes de
Petri ou tubes de verre. La température de stockage doit être
comprise entre 20 et 25°C, à l'obscurité.
- Maintien du pouvoir pathogène : l'alternance, tous
les 6 mois, entre culture en boîtes de Petri et en tubes de verre permet
généralement de maintenir l'agressivité des souches.
Toutefois, si une perte d'agressivité d'une souche était
constatée, il faudrait alors inoculer cette souche sur des cabosses
matures vertes, puis l'isoler à nouveau sur milieu spécifique, en
boîtes ou en tubes, à 25°C et à l'obscurité.
- préparation de l'inoculum : 10 jours avant la date
prévue d'inoculation, les souches à inoculer (3 ou 4) sont
repiquées sur milieu V8 + betasitostérol gélosé en
boites de Petri (diamètre : 10 cm). Les boites sont placées
pendant 3 jours à 25°C et à l'obscurité. Puis elles
sont placées à 25°C et à la lumière
(photopériode 12h/12h) afin d'obtenir la formation des sporocystes qui
seront à l'origine de la production des zoospores.
- Inoculation, incubation, notation des
symptômes
Le jour de l'inoculation, 4 à 5 ml d'eau
distillée stérile seront rajoutés dans chaque boîte.
Les boîtes seront alors placées dans un
réfrigérateur à 4°C pendant 30 mn. Le choc froid
favorise la libération de zoospores contenues dans les sporocystes. Les
boîtes sont ensuite placées à 20°C pendant 2 heures
pour que les zoospores puissent être relâchées dans l'eau.
Puis, pour chaque souche, la solution contenant les zoospores est
récupérée dans un bécher. Un comptage des zoospores
est fait grâce à une cellule de Malassez. La suspension de
zoospores sera diluée afin d'obtenir une concentration de 300 000
zoospores / ml.
L'inoculation avec la suspension calibrée doit se faire le
plus rapidement possible afin d'éviter que les zoospores ne perdent leur
capacité à nager dans l'eau.
L'évaluation de base comprendra 5 à 6
répétitions, séparées par au moins
un mois. Il s'agira en fait de séries, car il est probable que certains
clones manqueront à chaque série.
Lors de chaque répétition, on utilisera :
- Une feuille par clone (on s'efforcera de prendre tous les
clones lors de chaque répétition), avec à chaque fois les
témoins de résistance et de sensibilité) au stade 3,
c'est-à-dire des feuilles de 50 à 60 jours, cueillies le matin
(6h30- 9h00), stockées en glacière et rapportées au
laboratoire le plus rapidement possible.
- 20 disques par feuille (10 pour P. palmivora, 10
pour P. capsici), déposés face inférieure vers le
haut. Dans chaque bac, chaque clone sera représenté par deux
disques (un pour P. palmivora et 1 pour P. capsici). Lors de
chaque répétition, la disposition des disques sera la même
dans chaque bac (d'où la nécessité de faire un plan lors
du placement des disques).
- 1 gouttelette de 10 uL par disque, déposée avec
une micro-pipette à répétition. - Durée
d'incubation : 7 jours à 25°C et à l'obscurité
- Lecture des symptômes suivant une échelle de 0
à 5 :
0 : absence de symptômes
1 : minuscules points nécrotiques (= points de
pénétration)
2 : points nécrotiques nombreux (points en
réseau)
3 : taches se rejoignant (taches en réseau)
4 : grandes taches uniformes (marbrées)
5 : très grandes taches nécrotiques,
dépassant parfois les limites de la goutte d'inoculation (taches
vraies).
Dans un deuxième temps (ou à Montpellier),
quelques répétitions de confirmation seront effectuées
avec une concentration élevée (>1.0 million de zoospores /ml)
pour les clones classés "Très résistants" après les
tests de base.
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