Memoire Online - Impact du pyrène en microcosmes aquatiques

Les daphnies sont élevées dans des béchers de 2 litres contenant 2 litres de milieu M4 auquel est ajouté un certain volume d'une composition mixte de Chlorella vulgaris et Pseudokirchneriella subcapitata. Les élevages sont soumis à un éclairage de type jour long (16 heures d'éclairement par 24 heures, intensité < 1000 lux) et entretenus dans une chambre climatisée à une température de 20 °C.

Le maintien des élevages est assuré par l'entretien d'un lot de daphnies gravides, renouvelé à partir d'individus non utilisés dans les bioessais.

A partir de deux semaine d'élevage, les daphnies atteignent leur maturité sexuelle et produisent une quantité importante de jeunes individus qui sont récupérés par tamisage. Le milieu de culture est renouvelé de moitié une fois par semaine.

2.2. Amphipodes

L'élevage de l'amphipode Hyalella azteca nécessite l'utilisation de 2 bacs type aquarium de 10 litres chacun. Les bacs sont remplis avec 5 litres de milieu M4 et équipés d'un système d'aération par pompe assurant l'oxygénation du milieu d'élevage. Les élevages sont soumis à un éclairage de type jour long (intensité < 1000 lux) et entretenus dans une chambre de culture climatisée à une température de 20 °C. La nourriture est constituée par un apport hebdomadaire de nourriture pour poissons TetraMin® en solution dans du milieu M4. La quantité de nourriture à apporter varie avec le nombre d'individus en élevage, mais doit permettre un bon niveau de reproduction des organismes. Une fois par semaine, les jeunes sont séparés des adultes par tamisage et conservés dans des conditions d'élevage similaire pendant 1 à 2 semaines jusqu'à leur utilisation pour un essai. Le milieu d'élevage est renouvelé de moitié une fois par semaine.

Les chironomes adultes nouvellement émergés sont placés dans des bacs en plastique d'une contenance de 5 litres (enceintes de ponte). Une coupelle remplie de milieu M4 est disposée au fond du bac et permet de recueillir les pontes des femelles (masses). Un deuxième bac est retourné et placé au-dessus du premier de façon à constituer une enceinte d'élevage close et de volume suffisant. Les élevages sont soumis à un éclairage de type jour long (intensité < 1000 lux) et placés dans une chambre climatisée à 20 °C. Les nouvelles pontes sont recueillies et transférées dans du milieu M4. Les masses sont alors incubées à 20 °C jusqu'à éclosion des larves. Les larves écloses et destinées à entrer dans la réalisation des bioessais sont conservées dans leur milieu d'éclosion auquel est ajouté une petite quantité de TetraMin® en suspension dans du milieu d'élevage. Les individus sont ainsi maintenus en élevage jusqu'au deuxième stade de développement, avant d'être introduits dans les microcosmes. Une partie des larves écloses sont également destinées à renouveler les élevages d'adultes. Ces larves sont introduites dans des bacs plastiques d'une contenance de 5 litres contenant environ 500 grammes de sable de Fontainebleau lavé et 3 litres de milieu M4. Un autre bac de 5 L est placé au-dessus du premier de façon à constituer un volume d'air au-dessus et de piéger les adultes émergés. L'air injecté dans le milieu d'élevage par un tuyau de silicone relié à un diffuseur d'air immergé traverse préalablement un filtre de type Sartorius. Les apports de nourriture sont hebdomadaires et constitués par un petit volume d'une suspension de Tetramin. Les chironomes adultes sont retirés deux fois par semaine et introduits dans les enceintes de ponte.

Les lentilles d'eau sont cultivées dans des Erlenmeyers de 300 mL contenant 150 mL de milieu de culture (AFNOR, 1995). Les cultures sont entretenues en chambre climatisée à 20°C et soumises à un éclairage de type jour long d'intensité 3000 lux environ. Le repiquage des cultures intervient toutes les 2 ou 3 semaines suivant la croissance des organismes. Cette opération effectuée en conditions stériles consiste à placer une dizaine de colonies de 2 à 3 frondes par Erlenmeyer; ce dernier ainsi que le milieu de culture sont préalablement autoclavés à 120°C (pression : 1 bar) pendant 20 minutes.

2.5. Chlorella vulgaris et Pseudokirchneriella subcapitata

Les cultures sont entretenues dans un milieu standardisé de type Oligo LC (AFNOR, 1990). Les récipients de culture sont des Erlenmeyers de 500 mL contenant 300 ml de milieu stérilisé (autoclave : 120 °C/1 bar pendant 20 mn). L'ouverture des récipients est obturée par du coton cardé. Une pipette Pasteur délivrant un faible débit d'air filtré (filtre Sartorius) assure l'oxygénation du milieu ainsi que son agitation.

Les sédiments sélectionnés pour cette étude proviennent de prélèvements réalisés au niveau de la zone sud du lac préalpin d'Aiguebelette. Les sites de prélèvement possèdent des environnements très différents, ce qui fournit deux matrices sédimentaires bien distinctes du point de vue de leurs propriétés physico-chimiques :

- un sédiment calcaire (environ 80 à 85% de CaCO₃) appelé « Craie » dans la suite de cette étude. Ce sédiment reçoit essentiellement de la matière organique d'origine phytoplanctonique et zooplanctonique. Ces apports sont faibles ce qui a pour incidence de donner une dominante minérale à ce sédiment. Sa richesse en sels calcaires lui confère un caractère oligotrophe en raison de la chélation facilitée des phosphates. Sa faible granulométrie en fait globalement un sédiment de type anoxique.

- un sédiment organique, appelé « Tourbe » dans la suite de cette étude. Ce sédiment collecté à proximité d'une roselière reçoit d'importants apports en matière organique végétale d'origine allochtone. La décomposition de cette matière organique est à l'origine de la formation de composés de type humiques. La flore bactérienne présente une densité très supérieure à celle du sédiment précédent : l'activité de ces organismes contribue de manière prépondérante au caractère eutrophe de ce sédiment.

Un tableau d'analyse des propriétés physisco-chimiques de ces deux sédiments figure à l'annexe 1.

Les sédiments prélevés au moyen d'une drague à main et transportés au laboratoire où ils sont passés au travers d'un tamis de 0.2 cm de maille afin d'éliminer les débris minéraux et organiques de grande taille, ainsi que les plus gros macroinvertébrés. Le sédiment ainsi traité est ensuite homogénéisé par brassage puis stocké à 4°C dans des flacons en polyuréthane de 2 litres. Certains résultats obtenus lors du premier essai plurispécifique réalisé nous ont incité à effectuer un lessivage des sédiments, ceci afin d'éliminer certains produits de fermentation qui ont pu apparaître durant le stockage des sédiments bruts. Ce lessivage a été réalisé en faisant passer un flux aqueux renouvelé continuellement pendant 24 heures au-dessus des sédiments (eau de nappe).

Le sédiment contaminé utilisé dans le cadre de cette étude est dopé selon la technique décrite par Verrhiest et al (1999). Une solution mère de pyrène à 2 g/L dans l'acétone (acétone de qualité analytique (SIGMA) est préparée juste avant l'opération de dopage.

La quantité de pyrène nécessaire au dopage du sédiment est déposée sur la surface intérieure de bouteilles en verre Pyrex de 2 litres par évaporation de la solution acétonique de pyrène.

L'acétone est éliminé par évaporation sous hotte aspirante à l'aide d'un appareil à rouleaux assurant une rotation horizontale continue et à vitesse constante des bouteilles. Lorsque la totalité de l'acétone s'est évaporé, le sédiment est extrait des flacons de stockage et homogénéisé. La quantité de sédiment voulue est alors introduite dans les bouteilles préparées, ces dernières sont ensuite soigneusement fermées. Les bouteilles sont de nouveau disposées sur les rouleaux pour une durée de 4 heures durant laquelle elles seront vigoureusement agitées toutes les 30 minutes. A l'issue de cette étape, les bouteilles sont stockées à l'obscurité et à 4 °C jusqu'à utilisation.

Le tableau 2 résume les modalités expérimentales mises en oeuvre dans les bioessais présentés dans ce rapport.

Tableau 2 : Principales conditions expérimentales observées dans les bioessai durant cette étude

Bioessais	Type de contenant	Masse de sédiment	Volume de milieu d'essai
Monospécifiques	Bécher de 400 ml	50 grammes	300 ml
Plurispécifiques	Bécher de 2 litres	100 grammes	2 litres

La phase aqueuse utilisée dans ces bioessais est un milieu de type OCDE (OCDE, 1993). Il est introduits dans les béchers après introduction de la phase sédimentaire, en prenant soin de minimiser les turbulences et la remise en suspension du sédiment. Un film alimentaire percé de quelques trous est apposé sur l'ouverture du bécher et maintenu par un élastique. Ce dispositif permet de limiter les pertes par évaporation et de piéger les chironomes émergents. L'oxygène est délivré par une pompe à air couplée à un système répartiteur qui permet l'alimentation de plusieurs béchers. Un filtre à air (maille de 0.22 um) est disposé en amont du réseau d'alimentation. Les systèmes ainsi équipés sont placés pendant 7 jours à l'obscurité et à une température de 20°C. A l'issue de cette période, ils sont soumis à un éclairage de type jour long (16 h/24h) d'une intensité de 2000 à 2500 Lux.

Les organismes sont introduits dans les microcosmes 7 jours après la mise en place de la phase aqueuse et de la phase sédimentaire, à l'exception de la souche Mycobacterium 6PY1 qui est introduite dans le sédiment, par le biais d'une suspension incorporée de façon homogène avant adjonction du milieu d'essai (donc à J0).

Les caractéristiques des organismes introduits dans les microcosmes sont présentées dans le tableau 3.

Tableau 3 : Caractéristiques des organismes introduits dans le cadre des bioessais plurispécifiques en microcosmes

Organismes	Caractéristiques	nombre
*Lemna minor*	Colonies de 2 frondes	6
*Daphnia magna*	Individus âgés de moins de 48 heures.	10
*Hyalella azteca*	Individus âgés de 7 à 14 jours.	10
*Chironomus riparius*	Larves au deuxième stade de développement.	25
Mycobacterium 6PY1	Souche	1.5. 10⁷ individus par gramme de sédiment.

Durant la totalité du test, soit 28 jours, les microcosmes sont maintenus en chambre climatisée à 20°C. L'éclairement d'une intensité comprise entre 2000 et 2500 lux est délivré par des tubes fluorescents de type lumière du jour, la photopériode est de type jour long (16 heures par jour). Les apports en nourriture sont réalisés quotidiennement par adjonction au milieu d'une suspension de TétraMin dans de l'eau distillée. La quantité apportée est de 5 mg par jour ; cette quantité a été retenue à la suite d'essais préliminaires sans contaminant. Aucun renouvellement de milieu n'est réalisé pendant la durée des bioessais.

Le suivi détaillé des paramètres physico-chimiques et biologiques réalisés au cour des essais plurispécifiques est exposé en annexe 2.

Le pH des sédiments est mesuré en trois points lors des sacrifices. Les mesures sont relevées à l'aide d'un pHmètre muni d'une électrode par pénétration adaptée aux sédiments.

5 grammes de sédiment sont introduits dans une coupelle en céramique de poids connue préalablement séchée à l'étuve. L'ensemble est ensuite mis à l'étuve à une température de 105°C pendant au moins 24 heures. A l'issue de cette étape, la coupelle et le sédiment sont pesés. Le poids sec du sédiment, obtenu par soustraction du poids de la coupelle, permet de connaître le poids et donc la teneur en eau exprimée en pourcentage par rapport au poids frais du sédiment.

Les échantillons de sédiments utilisés précédemment sont placés pendant 2 heures à 550°C dans un four réfractaire. Les coupelles en céramique sont ensuite mises à refroidir dans un dessiccateur puis pesées. Les valeurs de pertes au feu déduites sont exprimées en pourcentages par rapport au poids sec du sédiment.

Le dosage de la teneur en pyrène des sédiments est effectuée à l'occasion des sacrifices. Pour chaque traitement, le dosage est réalisé sur un échantillon constitué par homogénéisation de sous-échantillons de trois grammes de sédiment provenant des microcosmes sacrifiés. Les échantillons ont été envoyés au Service Central d'Analyse du CNRS de Solaize (Vernaison, 69). Après homogénéisation des sédiments et déshydratation par addition de sulfate de sodium anhydre, le pyrène est extrait au moyen de toluène à chaud et sous pression (extracteur Dionex Accelerated Solvent Extraction). Les extraits sont dosés selon le même protocole que pour les échantillons aqueux (cf 4.4.2.7).

Le pH des eaux surnageantes est relevé 2 fois par semaine sur 5 microcosmes par traitement.

Les relevés sont effectués à mi-hauteur de la colonne d'eau à l'aide d'un pHmètre de terrain.

La conductivité des eaux surnageantes est relevée 2 fois par semaine sur 5 microcosmes par traitement. Les relevés sont effectués à mi-hauteur de la colonne d'eau à l'aide d'un conductimètre de terrain.

Les teneurs en oxygène et le taux d'oxygène dissous des eaux surnageantes sont relevés 2 fois par semaine sur 5 microcosmes par traitement.

Les relevés sont effectués à mi-hauteur de la colonne d'eau à l'aide d'un oxymètre de terrain qui délivre en même temps la température du milieu aqueux.

Une partie de la colonne d'eau est filtrée à 1.2 um (filtre Whatman GF/C). Le filtre est ensuite broyé à l'aide d'un Potter mécanique dans 5 ml d'acétone (acétone de qualité analytique) enrichi en MgCO₃. Le broyat est centrifugé à une vitesse de 4000 tours par minute pendant 30 minutes et à 4°C. Un ml de surnageant est introduit dans une cuve en verre et placé dans un spectrophotomètre de marque Perkin-Elmer à double cuve. Le témoin est constitué par un ml de solution d'acétone enrichie en MgCO₃. Une première lecture de l'échantillon est effectuée à 750, 665, et 664 nm. L'échantillon est ensuite acidifié par adjonction de 20 uL d'acide chlorhydrique à 1 mol/L. Une deuxième lecture de l'échantillon est alors effectuée à 750 et à 665 nm. La teneur en chlorophylle a (corrigée de la phéophytine a) de l'extrait exprimée en ug par litre est obtenue par la formule suivante (ASTM, 1993) :

Aux mesures effectuées avant et après acidification est retranchée la valeur de DO à 750 nm correspondante afin de corriger le biais induit par la turbidité de l'échantillon.

L'analyse des anions et cations en solution dans les eaux surnageantes et les eaux interstitielles est réalisée par chromatographie ionique sur résine échangeuse d'ions (analyseur de type DIONEX).

Le COT des eaux surnageantes et des eaux interstitielles est analysé à l'aide d'un analyseur de carbone de modèle LAB TOC (SPECTRA-France/ P.P.M). L'échantillon est acidifié puis introduit dans un flux de persulfate de sodium. Le carbone organique contenu dans l'échantillon subit l'action oxydante du réactif plus un traitement aux ultra-violet lors de son passage dans le réacteur. Le gaz carbonique obtenu est séparé de la phase liquide par barbotage d'un gaz vecteur (Azote ou Argon). La concentration en gaz carbonique entraîné par le gaz vecteur est mesurée par détection infrarouge après passage dans un sécheur de gaz qui assure une hygrométrie constante.

L'analyse est réalisée sur des eaux filtrées à 0,7 um (filtres Whatman GF/F en fibre de verre). Les échantillons après préparation sont stockés dans des flacons en verre à l'abri de la lumière et à 4°C. Le dosage du pyrène (Laboratoire Central d'Analyses du CNRS de Solaize) est réalisé par HPLC sur colonne Hypersil ODS C18 5 um (200 x 2,8 mm) couplée à un détecteur d'UV à 240 nm. La séparation des composés est obtenue par passage dans la colonne d'un gradient d'élution eau/acétonitrile. Avec cette méthode, les eaux sont injectées directement, il n'y a pas d'étape d'extraction liquide-liquide.

Le sédiment obtenu après sacrifice des microcosmes est poolé pour chaque traitement. Les quatre lots de sédiment sont ensuite centrifugés à 4000 tours/minute à 4 °C pendant 30 minutes. Le sédiment de type tourbe fournit un volume d'eaux interstitielles suffisant pour les analyses ultérieures. Dans le cas du sédiment de type craie, le volume récupéré peut être relativement faible. Il est dans ce cas ajusté à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. Les eaux interstitielles sont ensuite filtrées à 0,7 um sur un filtre Whatman GF/F. Les échantillons d'eau interstitielles sont stockés à 4 °C et à l'obscurité.

Précision : les mesures ont été réalisées par un stagiaire de l'IUT de Biologie de Lyon, Clément LAVIGNE, sous la direction de Bernard CLEMENT.

Les organismes utilisés dans cette partie de l'étude sont des daphnies juvéniles âgées de moins de 48 heures provenant des élevages entretenus au laboratoire.

Le tableau 4 présente les différents modes d'exposition auxquels ont été soumis les organismes ainsi que les temps d'exposition retenus.

Tableau 4 : Modalités et durée d'exposition des organismes pour le bioessai monospécifique ((*) : eaux surnageantes récupérées lors de sacrifices dans lesquelles les daphnies sont donc exposées en l'absence de sédiment)

Date d'exposition	Mode d'exposition	Temps d'exposition
J17 à J18	Eaux surnageantes (*)	24 heures
J0 à J1, J0 à J2, J2 à J3, J7 à J8, J14 à J15	Eaux surnageantes (*) filtrées à 0,8 um.	24, 48 et 72 heures
J-4 à J-3, J-3 à J0, J0 à J1, J0 à J2, J2 à J3, J7 à J8, J14 à J15	Sédiment et eaux surnageantes des microcosmes	24, 48 et 72 heures

15 daphnies (préalablement séchées ou humides) sont broyées dans un tube à essai en verre au moyen d'une tige de verre, puis 2 mL de méthanol sont ajoutés. La suspension obtenue est introduite dans une seringue et filtrée à 0,45 um (Minisat, SARTORIUS). Le filtrat est ensuite introduit dans une cuve en quartz poli pour permettre la lecture de l'échantillon au spectrofluorimètre. L'excitation du pyrène en solution est réalisée à une longueur d'onde de 332 nm ; le spectre d'émission résultant est obtenu entre 350 et 475 nm. Le pic de fluorescence retenu pour la quantification se situe à une longueur d'onde de 393 nm. En parallèle à la lecture de chaque échantillon, une gamme étalon de solutions de pyrène dans du méthanol est également lue afin de déterminer la relation entre fluorescence et teneur en pyrène des solutions.

Le suivi et la numération des daphnies sont réalisés par prélèvement des individus au moyen d'une pipette graduée retournée. Les daphnies sont alors placées dans un peu d'eau surnageante de leur microcosme d'origine, puis dénombrées et observées (croissance, couleur, présence d'oeufs chez les daphnies mères, présence de mâles). Le milieu d'essai et les daphnies sont alors réintroduits avec précaution dans le microcosme.

Lors du dénombrement des adultes, les jeunes daphnies éventuellement présentes sont dénombrées après les avoir récupérées par aspiration (siphonnage d'une partie de la colonne d'eau et tamisage). Les individus issus de microcosmes ayant reçu le même traitement sont placés dans un tube à essai contenant 2 mL de méthanol à 90%. Les échantillons sont ensuite placés à 4°C à l'obscurité en attendant de fournir des mesures de bioaccumulation du pyrène chez les jeunes daphnies.

Le taux de survie des amphipodes est déterminé lors des sacrifices des microcosmes. Les amphipodes sont capturés à l'aide d'une oeuse ou d'une pince à la surface du sédiment et stockés dans une petite quantité d'eau surnageante de leur microcosme d'origine. Les individus sont alors dénombrés et observés (croissance, formation de couples).

Le taux de survie des larves de chironomes est déterminé lors du sacrifice des microcosmes. Les larves sont extraites du sédiment et placées dans une petite quantité d'eau surnageante provenant de leur microcosme d'origine. Les individus sont alors dénombrés et observés (croissance). Les adultes qui ont émergé sont triés par sexe et dénombrés tous les jours à partir de J10. Les individus sont ensuite placés dans des piluliers en polyuréthane et stockés au congélateur pour dosage ultérieur du pyrène.

Les organismes survivants sont rapidement essuyés sur une feuille de papier absorbant, leur poids frais est mesuré, puis ils sont placés pendant 24 heures dans une étuve à 60°C. Les mesures de poids frais et sec sont réalisées sur la totalité des individus d'un microcosme. Le poids moyen est obtenu par division de la valeur obtenue par le nombre d'individus.

Le développement des lentilles est suivi lors du dénombrement des daphnies mères. Les colonies sont dénombrées, le nombre de frondes qui composent chaque colonie est également relevé. Une observation de l'aspect général est ensuite réalisée afin de noter l'éventuelle apparition de signes de dégénérescence(frondes jaunies ou chlorotiques).

Les mesures d'activités enzymatiques bactériennes retenues dans cette partie de l'étude sont l'activité leucine-aminopeptidase et l'activité -glucosidase. Les protocoles de mesures mis en oeuvre sont basés sur l'utilisation de l'épifluorescence de groupements chromophores greffés à des substrats enzymatiques (tableau 5). L'hydrolyse de ces complexes permet la libération du groupement chromophore qui émet alors un rayonnement fluorescent après excitation des longueurs d'ondes de fluorescence.

Tableau 5 : Substrats chromophores utilisés dans les mesures d'activités exoenzymatiques leucine-aminopeptidase et -glucosidase.

Activité enzymatique

Gamme étalon

Concentration saturante en substrat

Mesure de l'activité enzymatique des échantillons

Lecture des échantillons

Leucine-Aminopeptidase

7-amino-4-méthyl-coumarine (MCA)

L-Leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine (Leu-MCA)

L-Leucine-7-amino-4-méthyl-coumarine

Excitation : 380

Emission :440

-D-glucosidase

4-Méthylumbelliférone (MUF)

4-Méthylumbelliféryl ß-D-glycopyranoside (MUF-Glp)

4-Méthylumbelliféryl ß-D-glycopyranoside

Excitation : 365

Emission :460

- détermination du niveau d'activité enzymatique des échantillons en référence à une gamme étalon de chromophore

Les protocoles expérimentaux mis en oeuvre lors de ces deux étapes figurent en annexe 3.

Les différentes gammes de substrats sont réalisées à partir de solutions mères de substrats dissous dans du Méthylcellosolve. Les dilutions successives sont réalisées avec de l'eau distillée.

La concentration saturante en substrat est définie comme la concentration minimale non limitante pour les consortiums bactériens. Cette valeur est estimée graphiquement : elle correspond à la plus forte concentration en substrat utilisée, avant le plateau de saturation de la courbe exprimant le niveau de fluorescence relative en fonction de la concentration en chromophore. Cette concentration saturante, évaluée lors de mesures préliminaires sur des échantillons de sédiment, a été fixée à 1500 umol/L pour les deux sédiments utilisés. Cette concentration a été ensuite utilisée dans l'ensemble des mesures effectuées au cours de cette étude. Lors de la lecture des échantillons au fluorimètre, la réalisation de tubes stériles permet de s'affranchir du bruit de fond de fluorescence lié à la nature du sédiment. Les unités de fluorescence relatives sont donc calculées par soustraction de ces stériles :

La quantité de substrat hydrolysée par les échantillons est déterminée grâce à la gamme étalon. Les tubes Eppendorf sont étuvés 24 heures à 105°C, le poids sec des échantillons de sédiment est déterminé par soustraction du poids des tubes vides au poids de l'ensemble tube + sédiment sec. Les résultats sont exprimés en uM de substrat hydrolysé par heure et par gramme de sédiment sec.

L'estimation de la densité bactérienne des sédiments s'effectue en microscopie à épifluorescence après marquage des bactéries au DAPI (4'-6 diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure). Le DAPI est un chromophore fluorescent qui se fixe aux acides nucléiques après diffusion passive dans les cellules bactériennes. Le complexe ADN-DAPI est excité sous UV à 340-380 nm. Le protocole expérimental mis en oeuvre figure en annexe 3 .

Selon Trousselier (1985), il faut retenir la dilution permettant de compter 30 bactéries par champ, et en comptant 300 bactéries la précision finale de la numération est de 10%.

Les souches dégradant le pyrène sont mises en évidence dans des boîtes de Pétri en verre contenant 30 mL d'un milieu gélosé sur lequel 0,175 mL d'une solution de pyrène dans l'acétone à 2 mg/l a été évaporé. Pour chaque microcosme sacrifié, 0.1 mL de suspension bactérienne diluée 100 et 1000 fois est déposé dans les boîtes de Pétri stérilisées. L'opération est effectuée sous hotte stérile et dans des conditions d'asepsie maximum. Les boîtes sont ensuite mises en incubation à 30°C et à l'obscurité. Une observation régulière des boîtes est réalisée afin de déceler le développement de colonies et la disparition de l'opacité due à la couche de pyrène se trouvant déposée sur le milieu gélosé.

Par convention, les traitements mis en place dans le cadre des bioessais plurispécifiques réalisés seront désignés dans le texte par le code suivant : C1 : sédiment Craie non contaminé ; C2 : sédiment Craie contaminé à 50 ppm de pyrène ; T1 : sédiment Tourbe non contaminé ; T2 : sédiment Tourbe contaminé à 50 ppm de pyrène ; MC2 : sédiment Craie contaminé à 50 ppm de pyrène + 10⁷ cellules de Mycobacterium 6PY1 ; MT2 : sédiment Craie contaminé à 50 ppm de pyrène + 10⁷ cellules de Mycobacterium 6PY1

Les résultats obtenus dans le cadre de l'essai sur microcosmes témoins Craie portaient sur l'influence seule ou croisée de la quantité de nourriture apporté quotidiennement (5 ou 10 mg de TetraMin en solution) et d'un renouvellement partiel et hebdomadaire de la colonne d'eau sur la survie des organismes et la stabilité des systèmes vis-à-vis de phénomènes d'enrichissement et d'eutrophisation (Rapport d'étude intermédiaire, mars 2002). Pour des raisons d'espace, ces résultats ne seront pas présentés dans ce manuscrit mais cités de manière ponctuelle à titre de référence ou de compléments d'information. Les résultats présentés ici ont été analysés par un test ANOVA (significativité statistique) et par un test de Bonferroni/Dunn (interaction entre paramètres étudiés).

Impact du pyrène en microcosmes aquatiques

2.1. Daphnies

2.2. Amphipodes

2.5. Chlorella vulgaris et Pseudokirchneriella subcapitata

Monospécifiques