Memoire Online - Evaluation de l’activité antibactérienne d’extrait de jatropha multifida et de artemisia annua sur quelques souches cliniques responsables d’infections urinaires

Une infection urinaire est une infection qui peut toucher une ou plusieurs parties du système urinaire : les reins, les uretères, la vessie et l'urètre. Elle se manifeste le plus souvent par des douleurs ou une sensation de brûlure lors de la miction (l'émission de l'urine), parfois par des douleurs abdominales et de la fièvre (Solano, 2014). Les bactéries les plus souvent impliquées sont par ordre décroissant Escherichia coli, Enterococcus spp, Pseudomonas aeruginosa et les staphylocoques (Riegel, 2003). Dans plus de 80 % des infections urinaires, le germe en cause est une bactérie intestinale de type Escherichia coli (Lumbroso J.R. et al., 2018). Quant à Staphylococcus aureus, elle est souvent diagnostiquée à un stade avancé des infections génito-urinaires (43 %) (Moussa et al., 1999).

L'antibiothérapie est la méthode utilisée dans le traitement de cette infection. Mais de nos jours la résistance bactérienne aux antibiotiques devient récurrent et pose un problème mondial de santé publique. La fréquence de résistance globale des souches d'entérobactéries hospitalières et communautaires à l'amoxicilline associée aux inhibiteurs de bêtalactamases, quinolones, fluoroquinolones, sulfaméthoxazole + triméthoprime et nitrofuranes est élevée (Lahlou Amine et al., 2009).

En Afrique et en Asie, 80% de la population continue d'utiliser des médicaments traditionnels plutôt que des médicaments dits modernes pour les soins de santé primaire. L'usage répandu de la médecine traditionnelle dans les pays en voie de développement est due à la disponibilité des ressources végétales utilisées et au coût souvent abordable. Aux quatre coins du monde, décideurs professionnels de la santé et grand public se débattent avec les questions d'innocuité, d'efficacité, de qualité, de disponibilité, de préservation et du

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quelques souches cliniques responsables d'infections urinaires.

développement futur de ce type de soins de santé (O.M.S., 2002). Ainsi, bon nombre de plante médicinale sont utilisées en médecine traditionnelle parmi lesquelles figurent Jatropha multifida et Artemisia annua.

Jatropha multifida ayant des propriétés médicinales très reconnues est utilisée pour traiter diverses maladies en Afrique, en Asie, ou en Amérique latine (Aiyelaagbe, 2001). L'effet antibactérien des feuilles, tiges, racines a été rapporté par diverses études (Van der Berg et al., 1995 ; Aiyelaagbe, 2001 ; Aiyelaagbe et al., 2008). La prescription de son jus dans la gestion des candidoses buccales est une pratique courante chez les habitants des zones rurales de l'ouest du Nigeria. En médecine chinoise, l'écorce et les feuilles sont utilisées contre les démangeaisons cutanées et l'eczéma (Hamza et al., 2006). Jatropha multifida Linn est l'une des plantes médicinales dont la sève est largement utilisée pour la cicatrisation des blessures au Bénin. (Klotoe et al., 2014). Quant à Artemisia annua L. (Asteraceae), est utilisée depuis des siècles dans la médecine traditionnelle asiatique pour le traitement et la prévention de la fièvre et des frissons (Hien et al., 1993). Des propriétés anti-oxydantes, anti inflammatoires, et antimicrobiennes des extraits de la feuille de Artemisia annua ont été raportées (Kim et al., 2015).

C'est dans le but de trouver une alternative naturelle, une solution abordable, accessible à tous et efficace pour lutter contre la résistance des bactéries responsables des infections urinaires que le présent travail est initié. Ainsi, cette étude s'est fixée pour objectif général d'évaluer l'activité antibactérienne des extraits de Jatropha multifida et Artemisia annua sur quelques souches cliniques incriminées dans les infections urinaires.

- Tester l'activité antibactérienne de la sève de Jatropha multifida et de l'extrait aqueux de la feuille de Artemisia annua sur quelques souches cliniques responsables d'infection urinaire.

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Les manipulations se sont déroulées à l'Hôpital de zone de Allada où s'est déroulé notre stage et au laboratoire de l'URMAPha

L'Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des Substances Naturelles (U.R.M.A.Pha) a été créée en 2017 en tant qu'Unité de recherche trans-facultative. Elle est physiquement et administrativement située dans l'Université d'Abomey-Calavi, au sein du Laboratoire de Recherche en Biologie Appliquée (L.A.R.B.A) de l'Ecole Polytechnique d'Abomey-Calavi (EPAC). Sa vision est d'être une unité nationale d'excellence où les scientifiques travaillent ensemble pour trouver des solutions aux problèmes sanitaires et environnementaux d'importance majeure au Bénin et en Afrique. L'unité est constituée d'un accueil, du bureau de Directeur, d'un laboratoire et d'une salle de travail. Le laboratoire est composé de deux paillasses de manipulation. Les analyses Biochimiques, hématologiques et bactériologiques y sont réalisées. Le laboratoire dispose d'un Poste de Sécurité en Microbiologie, d'un microscope et

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d'un microscope à camera, d'un autoclave, d'un agitateur magnétique, d'un agitateur voltex, d'un spectrophotomètre et d'un automate.

L'Hôpital de zone d'Allada est un établissement sanitaire public à caractère social. Il est compétent pour assurer la prise en charge des urgences médicales, pédiatriques, obstétricales et chirurgicale dans la zone sanitaire couvrant une superficie de 1526 Km² dont Allada 381 km², Toffo 492km², et Zè 663 km². Actuellement dirigé par Mr Christian Modeste VIGAN. Il est composé du service administratif et des services médicaux et techniques.

Le laboratoire d'analyses biomédicales se situe à côté du bureau des urgences. Il se retrouve sur un bord technique en face du bloc administratif et du service de consultation. Il est actuellement dirigé par Mme Pélagie ZODOME WOUEKPE.

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Tout autre prélèvement au-delà de 10h est réalisé dans les salles d'hospitalisations et acheminé en un bref délai au laboratoire pour la manipulation. On distingue plusieurs types de prélèvements à savoir :

- Prélèvements vaginaux (PV) ; - Prélèvements urétrales (PU) ; - Prélèvements des selles ;

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Après cette phase, les échantillons sont triés et envoyés dans les différentes sections pour la manipulation.

Les examens sont réalisés de 10h à 16h et de 16h à 06h pour la garde.Voici décrites ci-dessous certaines analyses par section.

Dans cette section on utilise deux méthodes pour les examens : la méthode automatisée utilisée dans la journée et la méthode manuelle utilisée à la garde et également dans la journée pour certains examens. Plusieurs examens sont effectués dans cette section. Il s'agit par exemples de : Glycémie, Bilirubine Totale, Bilirubine Indirecte, Bilirubine Directe, Transaminases GO, Transaminase, Cholestérol Total, Cholestérol HDL, Uricémie, Urémie, Calcium, Magnésium, Sodium, Potassium, Chlorure, Protides, Phosphore, Triglycérides, Electrophorèse des protéines, Etc..... Les examens ci-dessus mentionnés s'effectuent sur le sérum.

Les prélèvements en biochimie se font dans des tubes secs. Après les prélèvements, les échantillons sont centrifugés à 3500tours/min pendant 5min pour obtenir le sérum. La méthode manuelle utilise comme appareil le spectrophotomètre. Il permet de faire également tous les examens en biochimie tout comme l'automate. Voici présenté ci-dessous le mode opératoire de quelques examens que nous avons nous-même réalisés.

Il est basé sur la réaction de Jaffé. La créatinine forme, en présence de l'acide picrique en milieu alcalin, du picrate de créatinine. La vitesse d'apparition du complexe jaune orangé formé est proportionnelle à la concentration en créatinine dans l'échantillon. (Lecture à 505nm)

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Mélanger le contenu du flacon R1 et du flacon R2 (volume à volume). Les volumes peuvent être mesurés avec une éprouvette graduée.

- Lorsque la concentration du dosage est inférieure à la valeur normale, on parle d'une hypocréatininémie

- Lorsque la concentration du dosage est supérieure à la valeur normale, on parle d'une hypercréatininémie

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L'hématologie est l'étude du sang sur les plans anatomique, physiologique et pathologique. Dans cette section, plusieurs examens sont réalisés. Il s'agit par exemples de : La numération formule sanguine (NFS), la Numération des réticulocytes, La Vitesse de Sédimentation (VS), le Temps de Saignement (TS), le Temps de Céphaline Activé (TCA), le Temps de Prothrombine (TP), Etc...

Les examens réalisés dans cette section s'effectuent sur le sang prélevé sur un tube contenant un anticoagulant. Chacun des examens est spécifique d'un anticoagulant donné. On a comme anticoagulants : l'Ethylène diamine tétra acétique (EDTA), le citrate de sodium etc.

Parmi tous ces examens, nous avons eu à réaliser nous-même les examens suivants :

L'automate Spincell 3 de SPINREACT (compteur) détecte le changement de la résistance électrique lorsque l'on fait passer un électrolyte contenant des particules ou des cellules au travers d'une petite ouverture que l'on peut calibrer. Les cellules, n'étant elles-mêmes pas conductrices, génèrent de ce fait une

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variation de la résistance. Cette variation dépend de la taille de chaque particule comptée.

- Présenter verticalement le tube d'échantillon et actionner en même temps l'aspiration en appuyant sur le bouton START UP

- Attendre la rentrée de l'aiguille d'aspiration et retirer verticalement le tube d'échantillon.

- L'impression automatique du résultat signale la fin du processus. Résultats et interprétation Anémie :

Elle se définit par la diminution du taux de l'hémoglobine ; lors de l'interprétation d'une NFS. Une fois l'anémie confirmée par un taux d'Hb bas, il faut analyser le VGM et le taux de réticulocytes afin de classer cette anémie en régénérative, arégénérative, microcytaire ou macrocytaire. Globalement, il existe trois grands mécanismes des anémies :

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Plusieurs examens sont réalisés dans cette section. Il s'agit de : - Goutte épaisse - densité parasitaire (GE-DP)

Ces deux examens cités sont les plus pratiqués à l'Hôpital de Zone de Allada. Nous avons-nous même fait la goutte épaisse tandis que pour l'AKOP on a juste assisté nos supérieurs lors de la manipulation.

Un frottis sanguin est un sang étalé sur une lame porte-objet, dans le but d'observer des cellules et aussi de les dénombrer. Le frottis doit subir une coloration pour rendre bien visible les cellules. Il permet également de repérer un éventuel parasite dans le sang comme l'agent du paludisme, le plasmodium falciparum. Il est aussi indiqué dans l'établissement de la formule leucocytaire.

- Placer une lame ou une lamelle au-devant de la goutte en la touchant pour permettre que la goutte de sang soit étalée sur l'extrémité de la lame ou de la lamelle.

- Incliner la lame ou la lamelle (30-45° avec le plan de la lame qui porte la goutte de sang) et tirer la lamelle jusqu'à l'autre extrémité de la lame

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sur laquelle se fait l'étalement. Le sang suit alors le mouvement de la lamelle tout en s'étalant sur la lame.

Plusieurs examens sont effectués sur cette paillasse tels que : TPHA (Essay d'hemagglutination du tréponème pale), VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) , SDW (sérodiagnostic de Widal), ASLO (Anticorps antistreptolysine), AgHBs (Antigène de l'Hépatite virale B), Sérologie HIV, TBG sérique, Etc... Tous les examens réalisés dans cette section s'effectuent sur le sérum. Les prélèvements se font donc sur des tubes secs.

Nous avons eu à réaliser tous les examens cités. Voici détaillés deux de ces examens :

C'est un test qui permet de détecter la syphilis. Il est basé sur le phénomène d'agglutination. Il utilise trois réactifs dont le diluant, la cellule-contrôle et la cellule-test.

- Prélever 25ul du mélange qu'on met dans le puits 2 (témoin négatif) et dans le puits 3 (test)

- Ajouter 75ul de la cellule contrôle et de la cellule test respectivement dans les puits 2 et 3

- Homogénéiser et le mettre à l'abri de la lumière et des vibrations pendant 45-60 minutes

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- Lorsqu'il y a apparition de fines agglutinations dans le puits 3, alors le test est positif et donc le sujet est atteint de la syphilis.

- Lorsqu'il y a absence d'agglutination dans le puits 3 et donc semblable au puis 2 (témoin), alors le test est négatif. D'où le sujet est sain.

Les infections urinaires sont les infections bactériennes les plus fréquentes. Elles viennent en second rang des motifs de consultation de prescription d'antibiotiques après les infections respiratoires, et au premier rang des infections nosocomiales.

En effet la résistance accrue de nos jours des souches isolées des infections urinaires à l'antibiothérapie usuellement utilisés constitues un problème mondiale de santé publique.

Artémisia annua et Jatropha multifida sont deux plantes utilisés en médecine traditionnelle dont les propriétés antibactériennes ont été rapportées. Cela étant à pousser notre curiosité à évaluer l'activité antibactérienne des extraits de Jatropha multifida et de Artemisia annua, sur quelques souches cliniques responsables d'infection urinaire.

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L'infection urinaire peut toucher plusieurs organes du système urinaire (vessie, rein, urètre, prostate). Pour des raisons anatomiques, les femmes sont plus souvent touchées par ces infections qui prolifèrent au niveau de la vessie. Chez la femme, le méat urinaire est proche de l'anus où sont toujours présentes des bactéries. Ces bactéries peuvent remonter le long de l'urètre vers la vessie et proliférer dans l'urine. Un défaut d'hygiène locale peut donc favoriser les infections urinaires de la femme.

L'homme est relativement protégé des infections urinaires par la distance qui sépare l'anus et son méat urinaire - orifice situé à l'extrémité du gland. L'infection urinaire est donc plus souvent chez lui la traduction d'une anomalie au niveau des voies urinaires, en particulier l'existence d'un adénome de la prostate (qui provoque une stase des urines dans la vessie). Très fréquentes, les cystites ce caractérisent pas des brûlures lors des mictions et une fréquente envie d'uriner. Le

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plus souvent causée par la bactérie Escherichia Coli ou Staphylococcus aureus, elles se traitent par des antibiotiques. (Solano, 2014).

7.2. Notion sur quelques bactéries responsables de l'infection urinaire 7.2.1. Bactéries à Gram négatif

Les Enterobacteries appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Cette fammille est composé de bacteries caractérisées par : des bacilles à coloration de Gram négative, mobile péritriche ou immobile, cultivable sur des milieux ordinaires, fermentent le glucose avec ou sans production de gaz, absence de cytochrome oxydaseC, produisent de catalase, réduisent les nitrates en nitrites, aéro-anaérobies facultatives, vivant au niveau du tube digestif de l'Homme (Abdoulaye, 2002 ; Bousseboua, 2005 ; Yabi, 2006 ; Meziani, 2012)

Toutes les entérobactéries ont une morphologie habituellement typique de bacilles à coloration de Gram négative de 2-3u de long sur 0,6u de large, généralement polymorphes. La presence d'une capsule visible au microscope est habituelle chez les Klebsielles. La plupart des espèces pathogènes pour l'homme possèdent des fimbriae ou pili qui sont des facteurs d'adhésion (Bakhoum, 2004).

Les entérobactéries se développent facilement sur les milieux ordinaires en 24heures à 37^oC en aérobiose et en anaérobiose. Sur milieux géloses, les colonies d'entérobactéries sont habituellement lisses, brillantes, de structure homogène «type S : smooth ». Cet aspect peut évaluer après cultures successives pour donner des colonies à surface sèche rugueuse (Brooks et al., 2003 ; Bakhoum, 2004).

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Ce sont des coques, immobiles acapsulés et non sporulés, réunis en amas ou en grappe de raisin régulier. Ils peuvent avoir aussi des courtes chainettes, des tétrades et même des cocci isolés, de 0,8 à 1u de diamètre, aéro-anaérobies facultatifs, à coloration de Gram positive. Staphylococcus aureus est un germe mésophile cultivable sur des milieux ordinaires de 6°C à 46°C. la température optimale est de 37°C. Il est cultivable à un pH qui va de 4 à 9,8. Le pH optimal se situe entre 6 et 7. Il est un germe halophile qui supporte des taux de sel allant de 7 à 20%. Il tolère une activité en eau très réduite (Arnal, 2003 ; Kouta, 2009).

Il possède un métabolisme aérobie facultatif, il est caractérisé par sa capacité à produire une catalase et à fermenter le glucose ainsi que par l'absence de production d'oxydase. Il est sensible à la lysostaphine et à la nitrofurantoine (collomb, 2011).

S.aureus exprime de nombreux facteurs de virulence : protéines de surface qui initialisent la colonisation des tissus hôte, facteurs inhibant la phagocytose, toxines qui nuisent les cellules et provoquent les syndromes pathologiques (Stark, 2013 ; Aliou, 2015).

La résistance aux antibiotiques est la capacité d'un micro-organisme à résister aux effets des antibiotiques. Ce phénomène constitue un problème grave qui touche l'essence des activités de lutte contre les maladies infectieuses, et peut

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mettre un frein aux progrès accomplis dans ce domaine. Bien qu'elle constitue une réaction naturelle aux microbes, la résistance peut être endiguée par un recours prudent et approprié aux antibiotiques. Bien que l'utilisation excessive des antibiotiques ait été la principale cause de la résistance dans les pays développés, ce seul phénomène ne peut expliquer l'émergence croissante des microorganismes résistants dans le monde en développement. Les facteurs favorisants la résistance en Afrique sont liées aux ressources humaines, à l'hygiène, au diagnostic inapproprié avec pour conséquence une sur utilisation des antibiotiques, aux mauvaises pratiques en matière de prescription d'ordonnance, à la vente non réglementée de médicaments et l'absence de programme de lutte contre les infections. D'où la nécessité d'une réforme croissante avec la mise en place d'une surveillance bactériologique, à la mise en place et à l'application stricte d'une réglementation sur les antibiotiques. (C. Walsh, 2003)

Le laboratoire de microbiologie est au coeur de la lutte contre la résistance bactérienne. Sans lui sa stratégie serait aveugle. Quelle que soit la région du monde, le laboratoire est attendu à plusieurs niveaux : Face au malade suspect d'infection, le clinicien a besoin d'un diagnostic pour guider le choix du traitement. Dans l'incertitude, la pression pour la prescription d'un antibiotique à large spectre est forte : Ne pas le prescrire alors qu'il est réellement requis aurait des conséquences graves. Plus les possibilités diagnostiques sont limitées, plus grande est alors l'utilisation des antibiotiques, entraînant une expansion de la résistance bactérienne..(Chaouche, 2015)

7.3.2. Nouvelles stratégies pour la recherche de nouveaux antibiotiques et l'extension de leur durée de vie

Le développement rapide de résistances nécessite la poursuite des recherches en vue de trouver de nouveaux antibiotiques et de prolonger la durée d'utilisation des antibiotiques existants. Parmi les stratégies envisageables, il y a

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la recherche de nouvelles cibles, la découverte de nouvelles molécules et le sondage de composés non-antibiotiques pouvant soigner les infections. (Walsh, 2003).

7.3.2.2. Place des plantes médicinales dans la lutte contre les résistances aux antibiotiques

La résistance des microorganismes aux antibiotiques est devenue un sérieux problème de santé publique. Si les méthodes classiques permettent d'évaluer l'effet antimicrobien des composés testés, une fois l'activité établie, des méthodes plus élaborées sont requises pour élucider le mécanisme d'action de ces composés.

Les nouveaux composés actifs peuvent être recherchés dans les plantes médicinales, car celles-ci constituent une source potentielle de composés antimicrobiens et inhibiteurs des mécanismes de résistances aux antibiotiques. En effet, de nombreux composés d'origine végétale ont déjà démontré des propriétés (Walsh, 2003; Murray et al., 2009).

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Alovi aton (Fon) ; Arbre corail (Francais) ; Noisette purgative, Koray, Medecinier d'Espagne (Antilles) ; coral bush, Guatemala rhubarb, physic nur (Anglais).

La plante possède des propriétés antibactériennes et antifongiques. Le latex comporte des peptides cycliques, des phénols, un cyanoglucoside (la multifidine) et divers glucosides. La tige contient des diterpénoïdes, une flavone, et une coumarino-lignane.

Au Mexique, les jeunes feuilles sont consommées comme légume. Les graines, purgatives, sont utilisées en médecine traditionnelle.

En Tanzanie, les guérisseurs l'utilisent contre les infections fongiques. En médecine traditionnelle chinoise, l'écorce et les feuilles sont utilisées contre les démangeaisons cutanées et l'eczéma.(«Jatropha multifida, également appelé Arbre corail, Koray (Antilles), Médicinier, Médicinier d'Espagne, Noisette purgative (Antilles), sa description et les photos de ses fleurs, fruits et feuilles,». 2012).

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Image3 : Plante de Artemisia annua. (Source;NineteenGroupe, .2014.) 7.4.2.1. Famille

Armoise annuelle , Absinthe chinoise (Fr) ; qinghao (Chn), annual wormwood (Eng), Assenzio annuale(Ital)

Artemisia annua L. est une plante herbacée annuelle, originaire de Chine, où elle est connue sous le nom de qinghao. C'est une espèce qui peut atteindre jusqu'à 2 m de hauteur. Ses rameaux et ses feuilles sont alternes, de 2,5 à 5,0 de long, elles sont glabres, segmentées, dentées et pourvues d'un appareil sécréteur aromatique. Ses fleurs, réunies en capitule, sont jaunes et de très petite taille, 2 à 3 mm de diamètre, et les capitules sont assemblés en panicules verdâtres à jaunâtres. Les ovaires sont infères et uniloculaires, chacun donnant un akène, sans pappus, d'environ 1mm de diamètre. Les trichomes glandulaires, présents dans les feuilles et les fleurs, contiennent une huile volatile. C'est précisément dans ces trichomes que l'on retrouve l'artémisinine. La pollinisation se fait par le vent et par les insectes ce qui est rare chez les Asteraceae.(«Baxter et al.,» 2008.)

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Le matériel végétal est constitué de la sève de Jatropha multifida Linn qui a été recueillie dans la commune d'Abomey-Calavi. Le prélèvement a été fait directement dans les tubes stériles après la coupure des branches de Jatropha multifida Linn sans aucune contamination externe. Ces échantillons ont été maintenus à 4°C au réfrigérateur.

En ce qui concerne Artemisia annua, les feuilles et tige séchés de la plante conditionnée et vendu dans le commerce par par la maison de l'Artemisia.a été utilisés

Il est constitué de 45 échantillons d'urines de patients collectés pendant deux semaines au laboratoire de l'Hôpital de Zone de Allada, de l'Hôpital de zone de Menontin, de l'hôpital de zone de Calavi. Tous ces patients étaient venus au laboratoire pour raison de recherche d'étiologie d'infection. Deux souches de références (Escherichia coli ATCC 2552 et Staphylococcus aureus ATCC 2552) fournies par le laboratoire de L'U.R.M.A.Pha ont également été exploitées.

Les milieux de cultures usuels en bactériologie ont été utilisés pour cette étude.

Plusieurs réactifs ont été réalisés comme pour citer : réactif de Kovacs, le violet de gentiane, le lugol, l'alcool de 9Ø°, la solution de fuschine diluée au 1/10^ème, Bleu de méthylène, l'eau oxygénée et le plasma frais de lapin.

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Plusieurs équipements ont été utilisés tels que : le microscope optique, le réfrigérateur, le l'étuve, l'autoclave, le poupinel, la centrifugeuse, la balance de précision, le bec bunsen et le portoir. Les boites de Pétri stériles, les tubes à hémolyse et tubes à vis stériles, les plaques de TPHA, les écouvillons, les disques d'antibiotiques, la jarre d'anaérobiose et les gants ont également été utilisés.

L'étude s'est déroulée sur une durée d'un mois allant du 18 Mars au 18 Avril 2019, l'étude était prospective à visé analytique. Elle a pris en compte l'examen cytobactériologique des échantillons d'urines collectés chez les patients reçus pendant la période de collecte.

Un flacon stérile de 20mL a été remis la veille au patient après sensibilisation sur les conditions de prélèvement, pour recueillir les urines matinales. Au laboratoire, les échantillons ont été identifiés.

- Faire une toilette intime soigneuse (région vulvaire chez la femme et région du méat urinaire chez l'homme) à l'aide de savon (antiseptique si possible) ;

- Ouvrir le flacon en prenant soin de ne pas toucher le bord supérieur du flacon,

- Commencer à uriner dans les toilettes (cela contribue à laver la partie inférieure de l'urètre),

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Elle a été consacrée à la réception des échantillons biologiques, à l'identification des échantillons, à l'examen macroscopique et microscopique et à la mise en culture.

Après acheminement des échantillons au laboratoire, un numéro d'ordre est attribué à chacun d'entre eux. Les renseignements cliniques des patients ont été pris au moment de la réception avant l'acheminement vers le laboratoire.

- Examen macroscopique : Il Consiste à observer l'aspect des échantillons à savoir la couleur et la turbidité l'odeur et autres.

- Examen microscopique : Elle regroupe l'ensemble des observations microscopiques faites à l'état frais et à l'état coloré.

- La Culture : Elle est basée sur les résultats obtenus à la coloration de GRAM. La culture tient compte des géloses sélectives des entérobactéries (gélose EMB), et des Staphylocoques (gélose Chapman).

Elle a été consacrée à la lecture des milieux ensemencés, à la réalisation du Gram contrôle et à l'isolement pour l'obtention de souche pure.

Elle a été consacrée à l'identification des germes et à la réalisation de l'antibiogramme

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L'identification des germes a été faite en réalisant des tests biochimiques tels que la galerie classique de Leminor. Aussi, les souches de références utilisées ont été confirmées avant utilisation. Toutes les souches identifiées et isolées ont été conservées pour la suite de l'étude dans la souchetèque du laboratoire de l'URMAPha.

La réalisation de l'antibiogramme a eu pour but de déterminer le profil de résistance aux antibiotiques sur les germes isolés.

A l'aide d'un traceur, des diamètres des zones d'inhibition autour des disques ont été mesurés. Par comparaison aux diamètres inscrits sur l'abaque de lecture correspondant, le profil de résistance des différentes souches testées a été déterminé. Une souche bactérienne est dite multi-résistante lorsqu'elle présente à au moins trois familles différentes d'antibiotique.

La sève de Jatropha multifida Linn. a été directement testée sur les souches isolées. Quant à Artemisia annua, seul l'extrait aqueux des feuilles et tiges de la plante a été testée sur les souches isolées.

L'extraits totaux aqueux ont été obtenus par une adaptation de la méthode mise au point par (Guede-Guina et al., 1995). Cinquante (50) grammes de poudre ont été macérées dans 500 ml d'eau distillée. Le mélange est mis sous agitation continue(agitateur Stuart Bioblock Scientific Fisher) pendant 72 heures à la température ambiante. L'homogénat obtenu a été filtré trois fois sur du coton

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hydrophile et une fois sur papier Wattman N^o 1. Ce filtrat a été ensuite séché à 45°C au four. La poudre ainsi obtenue est l'extrait total aqueux utilisé.

L'extrait aqueux de Artemisia annua a été repris dans de l'eau distillée à raison de 100 mg pour 1ml. Les solutions mères ainsi concentrées à 100 mg/ml ont ensuite été stérilisées à l'autoclave à 121°C pendant 15 mn. La stérilité des solutions mères d'extraits a été vérifiée en ensemençant des aliquotes de chaque solution sur le milieu Mueller Hinton et incubée à 37°C pendant 24 heures. L'absence de colonies sur le milieu Mueller Hinton après 48 heures a confirmé la stérilité de ces solutions mères d'extraits. En ce qui concerne Jatropha multifia, la sève entière a été utilisée. La concentration de la sève entière de cette plante a été estimé à 320mg/ml selon les travaux réalisés par Klotoe et al.,2014 sur l'exploration des propriétés antibactériennes et du pouvoir cicatrisant de la sève de la sève de Jatropha multifida linn chez le rat albinos de souche.

Le rendement de l'extrait brut est définit comme étant le rapport entre la masse de l'extrait sec obtenue et la masse du matériel végétal traité (Baxter et al., 1998). Ce rendement a été calculé via l'équation:

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9.4.3. Test de l'activité antimicrobienne réalisé sur gélose par la méthode de diffusion

Une pré-culture bactérienne (1 colonie dans 5 ml d'eau distillée stérile) de 18h a été diluée pour obtenir une turbidité de 0,5 sur l'échelle de McFarland (soit 10⁸ UFC/ml). Chaque inoculum a été ensemencé par écouvillonnage sur des boites de Pétri contenant la gélose Mueller Hinton (CA-SFM, 2012). A l'aide du bout de pipette pasteur stérile des puits de 6 mm de diamètre ont été creusés. Ensuite à l'aide d'un cône stérile et d'une micropipette 50 ul de chaque extrait a été déposé dans les puits précédemment creusés. Un puits contenant de l'eau distillée stérile a servi de témoin négatif. Des disques d'antibiotiques standards ont également été utilisés pour servir de témoins positifs. Les boîtes ont été laissées pendant 15 mn à la température ambiante pour une pré-diffusion avant d'être incubées à 37 °C pendant 24 h. Après la période d'incubation, les boîtes ont été examinées pour noter les éventuelles zones d'inhibition (diamètre mesuré en mm). Tous les essais ont été réalisés en double.

Tableau II : Norme utilisée pour la lecture des résultats des tests d'antibiogramme des extraits végétaux.

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9.4.4. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) par micro dilution et de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB)

Une solution mère d'extrait a été préparée à la concentration de 100 mg/ml dans de l'eau distillée. 100 ul de milieu Mueller-Hinton Broth (MHB) ont été déposés dans chaque puits de la microplaque (puits 1 à puits 8). 100 ul de la solution mère d'extrait ont été déposés dans le 1^er puits. Après homogénéisation par aspiration-refoulement à l'aide d'une micropipette on obtient 200 ul d'une solution d'extrait à 100 mg/ml. 100 ul de cette nouvelle solution ont été prélevés et mélangés au milieu MHB contenu dans le 2^nd puits et on poursuit cette série de dilution de raison 2 de puits en puits jusqu'au 6ième puits dont on jette les 100 ul. Enfin 100 ul de la suspension bactérienne ont été ajoutés dans chaque puits. Les 7ième _et^8ième puits ont été respectivement le témoin positif et le témoin négatif et contiennent 100 ul de MHB + 100 ul de suspension bactérienne pour le témoin positif et 100 ul de MHB pour le témoin négatif. Les microplaques ont été recouvertes placées pendant 24heures à l'étuve à 37°C. Les CMI ont été estimées à l'oeil nu comparativement aux témoins. Quant à la CMB, elle a été déterminée après ensemencement du contenu de chaque puits sur la gélose MH et incubé à 37°C pendant 24 heures. La CMB a correspondu à la plus petite concentration d'extrait pour laquelle il n'y a pas eu de colonies bactériennes.

Image 4: Photo d'une plaque de détermination de la CMI. Source personnelle (Travaux de laboratoire, Avril 2019)

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La collecte des informations et l'analyse des tableaux ont été réalisées grâce au logiciel Excel 2013.

Au terme des manipulations, les résultats obtenus ont été interprétés selon les tableaux suivants.

Sur 45 échantillons collectés, 10 ce sont révélés positifs (22,22%) et 35 négatifs (77,78%)

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Sur 45 échantillons collectés la plupart des échantillons provenaient de femme (78%) dont 20% positifs et 58% négatifs. Seulement 22% des échantillons provenaient d'homme avec 2% d'échantillons positifs contre 20% d'échantillons négatif.

45%
40% 40%
35%
30%	30%
25%
20% 20%
15%
10% 10%
5%

0%
K.oxytoca K.pneumoniae Citrobacter freundii Microorganismes isolées		S. aureus

Citrobacter freundii était la bactérie la plus isolée (40%) suivi par Staphylococcus aureus (30%).

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Tableau III : Profil de résistance des souches de Staphylococcus aureus isolées

AMP= Ampicilline ; AMC= Amoxicilline + Acide clavulanique ; NFE= Nitrofurantoin ; GMN= Gentamycine ; ERY= Erythromycine ; LCN= Lincomycine ; FOX= Cefoxitin ; CHL= Chloranphénicol

Les souches de Staphylococcus aureus isolées présentes des résistances à plusieurs familles d'antibiotiques dont la plupart excède trois familles différentes d'antibiotiques. Ces souches sont donc toutes multi-résistantes.

Tableau IV : Profil de résistance de la souche de Klebsiella oxytoca isolées

AMC= Amoxicilline + Acide clavulanique ; NFE= Nitrofurantoin ; CRO=Ceftriaxone ; COX= Cefotaxime; GMN= Gentamicine ; CIP= Ciprofloxacine ; FAD= Acide Fusidique ;

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La souche de Klebsiella oxytoca isolée présente une résistance à plus de trois familles d'antibiotiques, elle est donc multirésistante.

Tableau V: Profil de résistance des souches de Klebsiella pneumoniae isolées

AMC= Amoxicilline + Acide clavulanique ; NFE= Nitrofurantoin ; CHL=Chloranphénicol ; COX= Cefotaxime; GMN= Gentamicine ; CIP= Ciprofloxacine ; CRO=Ceftriaxone ; SXT= Sulfamethoxazol + Trimethoprim

Toutes les souches de Klebsiella pneumoniae testées sont résistantes à au moins trois familles différentes d'antibiotiques, elles sont multirésistantes.

Tableau VI : Profil de résistance des souches de Citrobacter freundii isolées

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AMC= Amoxicilline + Acide clavulanique ; NFE= Nitrofurantoin ; CHL=Chloranphénicol ; COX= Cefotaxime; GMN= Gentamicine ; CIP= Ciprofloxacine ; CRO=Ceftriaxone ; SXT= Sulfamethoxazol + Trimethoprim ; FAD= Acide Fusidique

Toutes les souches de Citrobacter freundii isolées sont toutes multi résistantes.

L'extrait aqueux des feuilles et tiges de Artemisia annua présente un rendement de 23,72 %. Les tests de stérilité ont révélé l'absence de contamination au niveau de l'extrait et de la sève de Jatropha multifida.

Les souches testées, à la concentration de 100mg/ml ont présenté une sensibilité variable à l'égard des extraits testés. Les diamètres d'inhibition des extraits ont varié entre 7 et 21mm. La sève de Jatropha multifida, a été active sur toutes les souches bactériennes testées. Contrairement à l'extrait aqueux de Artemisia annua qui n'a présenté aucune activité antimicrobienne.

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Tableau VII : Diamètre d'inhibition des extraits des plantes étudiées sur les souches cliniques bactériennes isolées

Espèces Plantes / bactériennes		*C.freundii* *K. pneumoniae* *S. aureus* *C.freundii* *K. pneumoniae* *S. aureus* *S. aureus* C.freundii *C.freundii* *K. oxytoca* *E.coli ATCC* *2552* *S.aureus* *ATCC 2552*
SE Jatropha multifida (320mg/ml/plaq ue de gélose)	16		10	17	11	18	16	13	9	10	12	07	21

E. Artemisia annua(100mg/m l/plaque de gélose)	0		0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

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Image5: Photo de détermination des D.I. Source personnelle (Travaux de laboratoire, Avril 2019)

L'augmentation de la concentration de l'extrait aqueux de Artemisia annua n'a aucune effets sur les souches isolées y compris les souches de référence. Ainsi nous avons testés l'extrait aqueux à diverses concentration (100, 200, 400 et 600mg /ml,) sur les souches isolées et sur les souches de référence (E. coli ATC552 et S. aureus ATC552) mais aucune activité antimicrobienne a été notée.

Images 6 : Photo de détermination des D.I. Artemisia annua Source personnelle (Travaux de laboratoire, Avril 2019).

10.2.3 Concentration Minimale Inhibitrice, Concentration Minimales Bactéricides et pouvoir antibiotique de la sève de Jatropha multifida

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Les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) obtenues sont variables en fonction des types de souches. Les CMI les plus faibles ont été obtenues à la concentration de 40mg. Les concentrations minimales bactéricides (CMB) ont aussi varié en fonction du type des souches sensibles. Le pouvoir antibiotique (a.p) a été déterminé grâce au rapport CMB/CMI. Les tableaux et présentent les concentrations minimales inhibitrice, bactéricides et le pouvoir antibiotique des extraits aqueux.

Le rapport CMB/CMI de la sève de Jatropha multifida sur Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii , Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca est inférieure à 4. La sève de Jatropha multifida a donc un pouvoir bactéricide sur ces souches.

Tableau VIII : CMI, CMB et pouvoir antibiotique (a .p.) de la sève de Jatropha multifida

Sève de CMI		40 -	20 -	80	40 -	40	40	80	-	40
*Jatropha*	CMB	40 -	40 -	160	40 -	80	80	160	80	40
*multifida* p. a.		1 -	2 -	2	1 -	2	2	2	-	1

P.a= Pouvoir antibiotique ; CMB= Concentration minimal inhibitrice ; CMI= Concentration minimal Bactéricide

La présente étude a permis d'évaluer les propriétés antibactériennes des extraits de plantes de Artemisia annua (feuille et tige), Jatropha multifida (sève) sur des espèces bactériennes responsables d'infections Urinaires. L'étude ressort

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que les bacteries les plus isolées sont respectivement Citrobacter freundii (40%) Staphylococcus aureus (30%), Klebsiella pneumoniae (20%), Klebsiella oxytoca (10%). Le profil de résistance des souches isolées montre qu'elles sont toutes multirésistantes. L'extrait aqueux de feuille et tige de Artemisia annua ne possède aucune activité antibactérienne sur les souches testées peu importe la concentration. Par contre majoritairement avec une concentration minimale bactéricide de 40mg/ml, la sève de Jatropha multifida a eu une activité bactéricide sur la majorité des souches testées malgré leurs multi-résistances aux disques d'antibiotiques usuelle.

Les résultats obtenus de l'activité antibactérienne ont montré que les 12 souches étudiées ont été sensibles à la sève de J. multifida y compris les deux souches de références mais à degrés divers. En effet, la croissance de la plupart des souches étudiées a été totalement inhibée par la sève de Jatropha multifida avec une CMI minimal de 20mg/ml alors que la souche de Escherichia coli n'en n'a été sensible que moyennement. En effet, les flavonoïdes, les tanins, les terpènes mis en évidence lors du screening phytochimique aurait une fortes activités antimicrobiennes (Klotoé et al., 2012 ; James et Friday, 2010). Ces composés étaient responsables de l'activité antimicrobienne de l'extrait des feuilles de Melastoma malabathricum en raison de leurs propriétés antibactériennes (Nurdiana et Marziana, 2013).

D'autres auteurs ont obtenu des résultats similaires aux nôtres en étudiant l'activité antimicrobienne de différentes parties de Jatropha multifida. En effet, la sève de Jatropha multifida provenant de l'Université d'Ibadan au Nigéria a totalement inhibé S. aureus, E. coli et d'autres bactéries (Aransiola et al., 2014). En 2007, les extraits aqueux et éthanolique des feuilles de J. multifida étaient actifs sur E. coli et sur S. aureus (Adesola et Adetunji, 2007). Des résultats similaires ont été notés dans une étude sur les feuilles, tiges, racines de Jatropha multifida (Aiyelaagbe, 2008). Même si ces résultats sont similaires, les CMI diffèrent en termes d'effet sur les souches. Au Nigeria, une CMI de 0,78ug/ml

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pour S. aureus a été obtenu en 2008 avec les feuilles et racines de la plante (Aiyelaagbe, 2008)16mg/ml ,66mg/ml et 263 mg/ml ont été noté respectivement pour S. aureus , E. coli et K.pneumoniae avec la sève de Jatropha multifida en 2014 (Aransiola et al., 2014). La différence de sensibilité obtenue entre les sèves de Nigeria et du Bénin pourrait être liée aux facteurs environnementaux (pédographiques, climatiques), aux souches testées et à la méthode utilisée (Djeddi, 2012).

En ce qui concerne l'extrait aqueux de Artemisia annua, ces résultats sont contraires au résultat obtenus lors des travaux réalisés sur l'activité antibactérienne, antioxydant et anti inflammatoire de l'Artemisinin extrait de Artemisia annua linn (Kim et al 2015). Ces résultats s'expliquent par le fait que notre étude na prise en compte que l'extrait aqueux de cette plante et que les souches testés sont différentes. La qualité de l'extrait variant en fonction du solvant utilisés lors de l'extraction (Souhila and Mustapha, 2013). Il faudra donc réaliser d'autres extraits de la plante avec différents solvant outre que l'eau distillée afin de mieux évaluer les propriétés antibactérienne de cette plante.

Les plantes médicinales constitueraient donc une bonne alternative aux antibiotiques faisant face à la multirésistance bactérienne observée ce jour. Il s'avère très important d'effectuer diverses investigations sur les propriétés nécessaires à une meilleure qualification de ces plantes afin de minimiser tout risque à la santé.

Evaluation de l'activité antibactérienne d'extraits de Jatropha multifida et Artemisia annua sur
quelques souches cliniques responsables d'infections urinaires.

Evaluation de l’activité antibactérienne d’extrait de jatropha multifida et de artemisia annua sur quelques souches cliniques responsables d’infections urinaires

INTRODUCTION