4.4- Polymorphisme de Longueur des Fragments
Amplifiés (AFLP)
Les AFLP sont des marqueurs moléculaires
nucléaires dominants qui mettent en évidence un polymorphisme de
sites de restriction et un polymorphisme d'hybridation d'amorce arbitraire. Ils
sont reproductibles et révèlent un grand nombre de locus,
régulièrement répartis sur le génome et très
polymorphes. La technique des AFLP a été mise au point en 1995
(Vos et al., 1995). Elle est apparentée à la technique
des RAPD et basée sur une amplification sélective de fragments de
restriction obtenus par digestion d'ADN génomique. Le principe
général de cette technique repose sur trois phases successives :
une digestion-ligation, une amplification pre-sélective et une
amplification sélective. Dans un premier temps, l'ADN total est
digéré à l'aide de deux enzymes de restriction. La
première de ces deux enzymes sectionne fréquemment l'ADN, la
deuxième de façon plus rare. Des adaptateurs double brin,
spécifiques des extrémités issues des coupures
enzymatiques, sont ensuite fixés aux extrémités
cohésives de l'ADN grâce à une ADN ligase. Afin de
réduire le grand nombre de fragments d'ADN engendrés par la
digestion, deux amplifications sélectives successives sont ensuite
réalisées. La première, dite amplification
pre-sélective est effectuée grâce à des amorces
complémentaires des adaptateurs et du site de coupure des amorces
auxquelles ont été ajouté en 3' une base sélective
(nucléotide supplémentaire arbitraire). Ces amorces se fixent sur
les extrémités pourvues d'un adaptateur et permettent une
amplification par PCR et une réduction par 16 du nombre de fragments. Le
produit de l'amplification presélective est à nouveau
amplifié (amplification sélective) grâce à deux
types d'amorces présentant la même organisation que celles
utilisées lors de la phase précédente, mais
possédant deux bases sélectives supplémentaires (soit
trois au total). Cette seconde amplification réduit de nouveau par 256
le nombre de fragments de restriction. L'amorce spécifique du site de
l'enzyme EcoRI présente en 5' une extension fluorescente
détectable sur séquenceur automatique. Apres migration sur un gel
de polyacrylamide, entre 30 et 200 fragments de 50 a 500 pb sont visibles
(fragments ayant au moins un site de coupure EcoRI). En faisant varier la
composition des bases sélectives, un grand nombre de couples d'amorces
sélectifs est disponible. Tout comme la technique des RAPD, celle AFLP
ne requiert aucune connaissance préalable du génome
étudie, synthèse d'amorces ou caractérisation de sondes.
Elle permet ainsi une mise au point rapide, présente une bonne
reproductibilité et génère une grande quantité de
marqueurs (Vos et al., 1995 ; Ajmone-Marsan et al., 1997).
AjmoneMarsan et al. (1997) montrent qu'au travers l'utilisation du
couple enzymatique EcoRI/MseI, les AFLP peuvent générer des
marqueurs codominants et un très fort polymorphisme au sein
des races bovines. Ils suggèrent d'utiliser ces marqueurs
pour les études de diversité génétique et de
parente des races domestiques.
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