3.3- Electrophorèse
C'est une technique de séparation des molécules
chargées en fonction de leur taille. Tous les fragments d'ADN sont
chargés négativement par perte de H+ en milieu
tamponné basique. L'application d'un champ électrique va les
faire migrer vers le pôle positif de la cuve. Les fragments vont se
déplacer dans l'épaisseur d'un support, dans ce cas un gel
d'agarose dont la maille est assez régulière et adaptée
à la taille des fragments à séparer. Cette
migration sera facilitée d'autant plus que la taille du
fragment sera petite, ce dernier migrera plus loin. La lecture d'un
électrophorégramme nécessite une coloration ou une
révélation. Dans le cas de l'agarose, la visualisation des
fragments d'ADN sur le gel nécessite la présence de bromure
d'éthidium, agent intercalant de l'ADN, Il doit être
manipulé avec d'extrêmes précautions. Fixée à
la double hélice d'ADN, cette molécule a la
propriété d'émettre un rayonnement lumineux suite à
une irradiation par les UV. Alors que dans le cas du gel de polyacrylamide, la
coloration se fait généralement avec la nitrate d'argent ou
l'utilisation de radio-isotopes, ou par l'intermédiaire de
séquenceurs automatiques, en utilisant des amorces marquées
préalablement avec des fluorophores.
3.4- Amplification en Chaîne par Polymérase
(PCR)
Au cours du dernier siècle, les progrès de la
science notamment ceux enregistrés en biologie moléculaire ont
été considérables. En effet, la découverte de l'ADN
et de l'ARN et le développement de la technique de polymérisation
en chaîne (PCR) permettant d'obtenir de grandes quantités d'ADN
ont profondément marqué les sciences animales. Maudet (2001)
relate qu'en 1986 Mullis et al., ont développé un
procédé permettant une application spécifique d'un
fragment d'ADN grâce à une enzyme polymérase
thermo-resistante bactérienne (la Taq polymérase) : la PCR. La
PCR est une technique de biologie moléculaire mise au point en 1985, par
Karry Mullis. C'est une technique d'amplification génique,
c'està-dire qu'elle permet de repérer un fragment d'ADN ou de
gène précis, même présent en quantité infime
dans un mélange, puis de le multiplier rapidement. Auparavant, une telle
opération nécessitait impérativement le clonage de la
séquence, son isolement, son amplification dans une cellule hôte
et sa purification. Cette méthode extrêmement lourde et longue a
été dès que possible abandonnée au profit de la PCR
qui a certainement connu le développement le plus spectaculaire et le
plus rapide dans l'histoire de la biologie. Le principe de la technique PCR est
bien illustré dans la figure (5). Pour initier le processus de
réplication de l'ADN, deux oligonucleotides complémentaires des
extrémités du fragment d'ADN à amplifier (amorces), ainsi
que des nucléotides (dNTP) sont utilisés. La reproduction (ou
amplification) d'une portion d'ADN peut alors être obtenue en utilisant
une répétition de cycles de température comprenant trois
phases : une dénaturation de l'ADN double brin (94°C), une
hybridation spécifique des amorces (selon la composition des amorces) et
une synthèse de l'ADN (72° C). Ce procédé est
exponentiel (en fait, sigmoïde) et permet d'obtenir des millions de copies
d'un fragment d'ADN en quelques dizaines de cycles d'amplification.
La complémentarité des amorces avec les
extrémités du fragment cible assure la spécificité
de l'amplification au seul fragment désiré. La découverte
de la PCR a révolutionné la biologie moléculaire et a
ouvert la porte à de nombreuses méthodes d'investigation de
l'ADN.
Figure 5 : Principe de la Réaction de
Polymérisation en Chaîne (PCR)
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