Validation de procédé de production d'antigène viral sur culture cellulaire bhk21

Annexe 2: Préparation de Milieu pour contrôle de stérilité

Préparation de Milieu Thioglycolate

Dans 500 ml d'eau distillée ajouter 15g Thioglycolate (Scharlau)

Faire une agitation par l'agitateur magnétique jusqu'à homogénéisation du Milieu

Visser légèrement le flacon

Autoclaver à 120°C pendant 15 min

Laisser le flacon refroidir jusqu'au lendemain

Garder à température ambiante

Préparation du Milieu Bouillon Trypto-caséine soja

Dans 500 ml d'eau distillée ajouter 15g Bouillon Trypto-caséine soja (BIOKAR)

Faire une agitation par l'agitateur magnétique jusqu'à homogénéisation du Milieu

Visser légèrement le flacon

Autoclaver à 120°C pendant 15 min

Laisser le flacon refroidir jusqu'au lendemain

Garder à température ambiante

Annexe 3: Préparation des Tampons pour Extraction de
l'HA rubéolique

Préparation de Tampon Glycine 1M

Glycine .75,07g/L

Eau distillée qsp 1000 ml

Ajuster le pH à 10 avec NaOH N Préparation de la solution Tween 80 à 1,25%

Tween 80 1,25g

PBS qsp 100ml

Annexe 4: Préparation des Tampons pour le Titrage de l'HA

rubéolique

Préparation de Tampon de lavage GGB

Barbital 0,58g/L

Gélatine 0,60g/L

Barbital sodique .0,38g/L

Glucose 10g/L

NaCl 8,50g/L

CaCl2 anhydre 0,02g/L

MgSO4 7H2O 0,12g/L

H2O qsp 1000 ml

Conservation à +4°C

Ajouter l'Albumine bovine avant l'emploi

.4g/L

Ajuster le pH à 7,4 -7,6 Stérilisation par filtration

Préparation de Tampon Tacetal Tampon Acide:

NaCl 8,7g/L

Na2HPO4 (12H2O) 15,75g/L

NaH2PO4 anhydre 24, 34g/L

H2O qsp 1000 ml
Filtrer sur 0,45 um et 0,22 um Garder à +4°C

pH 5,8

Tampon Alcalin:

NaCl .7,02g/L

BO3H3 3,09g/L

NaOH N 24 ml

Albumine bovine 4,0g/L

H2O qsp 1000 ml
Filtrer sur 0,45 um et 0,22 um Garder à +4°C

pH 9,0

Préparation de Tampon Tacetal

Mélanger un volume de Tampon Acide avec un volume de Tampon Alcalin

Régler le pH à 6,2

Garder à +4°C

Annexe 5: Préparation et fonction des Tampons ELISA

Tampon Phosphate ? Solution 1:

KH2PO4 1M 136g

H2O qsp 1L
? Solution 2:

K2HPO4 1M .174g

H2O qsp 1L

Ajouter sous pH-mètre la solution 1 à la solution 2 jusqu'à atteindre pH 7,4

Tampon PBS

? PBS (0,15 M NaCl + 0,01 M Tampon Phosphate 7,4)

-NaCl .87,6g

H2O qsp .1L

-Tampon Phosphate 10ml

H2O qsp ..1L
? PBS Tween 20 à 0,1%

Tween 20 1ml

PBS qsp 1L

? PBS Tween 20 Gélatine 0,5%

-Gélatine (sigma) 0,5%

-5g de Gélatine dissoute par chauffage dans 100ml d'eau distillée

-Gélatine 5% 10ml

-PBS Tween 20 qsp .100ml

Tampon Citrate 1M

? Citrate de sodium 1M (C6H5Na3O72H2O)

C6H5Na3O72H2O 294,10 g

H2O qsp .1L

? Acide citrique 1N C(OH) (COOH) (CH2COOH) 2H2O

C(OH) (COOH) (CH2COOH) 2H2O ..210,14g

H2O qsp 1L

Ajouter sous pH-mètre la solution d'Acide citrique 1N à la solution 1M de Citrate de sodium jusqu'à obtenir un pH 5

Tampon Carbonate/Bicarbonate ? Solution 1:

NaHCO3 1M .84,01g

H2O qsp .1L

? Solution 2:

Na2CO3 1M .105,99g

H2O qsp .1L

Ajouter sous pH-mètre la solution 1 à la solution 2 jusqu'à obtenir pH 9,6

Solution Substrat chromogène

OPD 5 mg

H2O2 30% 10ul

Tampon Citrate pH 5 0,1 M 10ml

Fonction des Tampons pour le test ELISA

? Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine 5%

Le Tampon de saturation PBS-Tween-Gélatine 5% est un Tampon de saturation utilisé dans le test ELISA indirect pour occuper les sites qui sont restés vides après fixation de l'Ag rubéolique au fond des puits de la plaque ELISA. Il est utilisé aussi pour diluer les sérums à tester et le Conjugué anti IgG humain couplé à l'enzyme peroxydase.

? Tampon de lavage PBS-Tween (Phosphate Buffered saline-Tween)

Le Tampon de lavage PBS-Tween est utilisé pour faire le lavage après chaque étape du test ELISA.

? Tampon Carbonate/Bicarbonate (0,1M, pH=9,6)

Le Tampon Carbonate/Bicarbonate est utilisé pour effectuer les différentes dilutions de l'Ag rubéolique dans l'étape de sensibilisation de la plaque.

? Substrat chromogène OPD (Orto-Phénylène-Diamine)

Le Substrat chromogène OPD est une solution révélatrice du complexe immun (Ac-Ag). Suite à la rencontre du Substrat chromogène OPD avec l'enzyme peroxydase fixé déjà sur le Conjugué anti IgG humain couplé à l'enzyme peroxydase, il va y avoir une réaction de dégradation et apparition de couleur orangée.

? Pour les résultats faux positifs il y a virage vers la couleur jaune.

? Le Conjugué anti IgG humain

Le Conjugué anti IgG humain (SIGMA A-6029, LOT 84117381) est couplé a l'enzyme peroxydase. Ce Conjugue ne peut se fixer que sur le complexe immun (Ac-Ag).

La révélation du complexe immun (Ac-Ag) se fait grâce à l'enzyme peroxydase au contact avec le Substrat chromogène OPD.

? Solution d'arrêt (acide sulfurique 112SO4 4N)

L'acide sulfurique 112SO4 4N permet l'arrêt de la réaction ELISA.

Résumé: La culture cellulaire a été introduite dans les années 1920 et s'est grandement étendue au

cours des années 1940. Cette discipline est devenue importante dans divers domaines comme le domaine de virologie. La culture de certains virus a permis de résoudre plusieurs problèmes comme le diagnostic des maladies causées par ces virus.

L'objectif de notre projet de fin d'études consiste à maitriser les techniques de culture cellulaire pour cultiver le virus de la rubéole sur la cellule BHK21. La culture de ce virus va nous permettre ensuite de réaliser le diagnostic de la maladie de la rubéole.

Les cellules BHK21 ont été infectées par le virus de la rubéole afin de produire l'hémagglutinine rubéolique. Cette étape va nous permettre d'assurer les autres étapes du procédé de la préparation d'un Kit de sérodiagnostic de la rubéole.

Pour le lot d'HA produit nous avons pratiqué la technique d'hémagglutination pour connaitre le titre de l'hémagglutinine rubéolique. Cette technique a donné un titre compris entre 512 et 1024 UHA. Ce titre est considéré comme élevé. La deuxième technique était le test ELISA. Ce test nous a permis de valider l'hémagglutinine rubéolique et de connaitre la dilution la plus élevée de l'antigène qui est de 1/100 avec une dilution de 1/50 pour le sérum. Avec ces dilutions nous avons trouvé une bonne concordance entre le Kit local et le Kit commercial moyennant des sérums de malade à titres préétablis par le Service de Virologie Clinique à L'Institut Pasteur de Tunis.

Abstract: Cell culture was introduced in the 1920's and was greatly expanded in the 1940's.

This discipline became increasingly important in various fields such as the field of virology. Culture of certain viruses allowed to solve several problems such as the diagnosis of diseases caused by these viruses.

The aim of our final studies project is to study end master the techniques of cell culture to grow rubella virus on BHK21 cell. The culture of this virus will then allow us to make the diagnosis of the rubella disease.

BHK21 cells were infected with rubella virus to produce rubella hemagglutinin. This step will allow us to ensure the further process steps for preparing a kit rubella serodiagnosis.

For the produced batch of HA we practiced the technique of hemagglutination to know the titer of the hemagglutinin rubella. This technique gave a titer between 512 and 1024 UHA. This titer is considered high. The second technique was the ELISA test. This test allowed us to validate the hemagglutinin rubella and to know the higher dilution of the antigen which is 1/100 and 1/50 of serum. With these dilutions we found good agreement between the local Kit and the commercial kit through infected serums of predetermined titer by the Pasteur Institute of Tunis's Clinical Virology Department.