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Helicobacter pylori: etude bactériologique des premières souches isolées à l'hôpital Bologhine Ibn Ziri( Télécharger le fichier original )par Lydia Neà¯la DJOUADI Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene - Master 2 Microbiologie et Contrôle de Qualité 2011 |
I- Généralités
1-Historique : En 1906 Walter Krienitz, un médecin allemand, observe pour la première fois des bactéries spiralées dans l'estomac d'un patient. (Ferrand, 2009) Les scientifiques de l'époque étant convaincus de la stérilité de l'estomac, vu la très forte acidité qui y règne, n'accordent pas d'importance à cette observation pensant qu'il ne peut s'agir que de contaminants. (Mégraud, 2005) Ce n'est qu'au début des années 1980 que de telles bactéries sont cultivées et étudiées : Robin Warren, un pathologiste australien constate la présence de bactéries spiralées, dans la moitié des biopsies gastriques qu'il prélève. Il fait l'hypothèse qu'elles sont à l'origine de gastrites chroniques et d'ulcères gastroduodénaux, pathologies que l'on pensait, jusque là, liées au stress ou à la nourriture épicée. (Ferrand, 2009) Intéressé par ces résultats, Barry Marshall, un étudiant de Robin Warren, est le premier à cultiver cette bactérie en 1982. (Mégraud, 2005) Cette dernière est baptisée dans un premier temps Campylobacter pylordis puis Campylobacter pylori (après correction grammaticale latine) en raison de ces similitudes avec Campylobacter jejuni (notamment son caractère microaérophile). Cependant, différentes études portant sur les caractères génétiques (séquences des ARNr 16S, pourcentage de G+C) et phénotypiques (morphologie, structure, composition en acides gras, activités enzymatiques) ont permis d'individualiser cette bactérie dans un nouveau genre, et de la renommer Helicobacter pylori (Ferrand, 2009). La communauté scientifique, sceptique quant au rôle de H.pylori dans les ulcères gastriques, commence à changer d'avis après des études complémentaires, conduites par Marshall, dont la plus décisive est celle durant laquelle il ingurgite un tube à essai de H. pylori, contracte une gastrite et guérit avec des antibiotiques. En 1994, le National Institute of Health publie un texte soutenant que la plupart des ulcères gastriques récurrents sont causés par H. pylori, et recommande que des antibiotiques soient inclus dans le traitement. En 2005, Warren et Marshall obtiennent le prix Nobel de médecine pour leur découverte. (Mégraud, 2005)
Figure n°1 : Photo de Warren et Marshall * *: http://cours.francocite.ca/courslaf/SBI3Uweb/SBI3Cwebunite3- anatomie/digestion/estomac/SBI3Cdigestionestomaculc%C3%A8re%20de%20l'estomac.htm 2- Epidémiologie : L'infection à Helicobacter pylori est l'une des infections les plus répandues dans le monde, près de la moitié de la population mondiale est porteuse de la bactérie. Toutefois, la prévalence varie de 20 à 90% selon les pays, l'infection étant plus fréquente dans les pays en voie de développement. (Leclerc, 2006) (Figure n°2)
Figure n°2 : Prevalence de l'infe ction a Helicobacter pylori dans le monde* L'infection survient généralement pendant l'enfance. La réaction immunitaire qui s'en suit détermine probablement l'évolution de l'infection au cours du temps. (Raymond et al.,2005). En effet, plusieurs études tendent à montrer qu'un individu a très peu de risques d'être infecté après l'âge de 10 ans. (Mitchell et Megraud, 2002) Le seul réservoir significatif de Helicobacter pylori est l'estomac humain, bien que la bactérie soit retrouvée chez le chat domestique et certains primates. (Ferrand, 2009) Les facteurs de risque de l'acquisition de l'infection par Helicobacter pylori sont fréquemment liés à la pauvreté. Ils comprennent la promiscuité, le manque d'hygiène, le partage de lits pendant l'enfance et le faible niveau d'éducation des parents. En outre, des facteurs comportementaux propres à certaines sociétés, tel que la pré-mastication des aliments par la mère, semblent également jouer un rôle significatif. De nombreuses études épidémiologiques suggèrent une transmission de personne à personne par voie féco-orale ou plus vraisemblablement par voie oro-orale. Le fait que la promiscuité soit un facteur de risque d'acquisition de l'infection, plaide en faveur d'une transmission de personne à personne et les études concernant l'influence de la pré-mastication des aliments suggèrent une transmission oro-orale. Le risque pour un enfant d'être infecté augmente de façon significative avec le nombre de personnes infectées dans la famille. Il dépend en priorité de l'infection de la mère suivie de celle du père et de la place des enfants dans la fratrie. Ceci montre l'importance de la transmission intrafamiliale. Il a été en effet prouvé, par des techniques de biologie moléculaire de séquençage de gènes, que des souches identiques circulaient chez les différents membres d'une même famille, parents et fratrie. (Raymond et al., 2005) L'une des conséquences les plus inattendues de cette transmission intrafamiliale est la possibilité de retracer les grandes migrations humaines à partir de l'Afrique de l'Est en étudiant la diversité génétique des souches de H.pylori. Ainsi, ces résultats montrent la co-évolution de la bactérie avec l'Homme depuis plus de 58 000 ans. (Ferrand, 2009) * : http://www.nature.com/onc/journal/v23/n38/figtab/1207726f7.html#figure-title 8 3- Rappel anatomique sur l'estoma c humain : L'estomac est constitué de plusieurs régions: (Figure n°3)
* : http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/physiogerland/sysdigestif/page%20html/aa%2024.html
Figure n°4 : Histologie de l'estoma c humain *
Helicobacter pylori est un petit bacille (0,5 pm de diamètre sur 2 pm de longueur) de forme hélicoïdale, Gram négatif, mobile grâce à de multiples flagelles (5 à 7) entourés d'une gaine et disposés selon une ciliature polaire. La bactérie ne forme pas de spores mais peut adopter une forme coccoïde lorsqu'elle atteint la phase du plateau de croissance. (O'Rourke et Günter, 2001) (Figure n°5)
Figure n°5 : Helicobacter pylori observe au Microscope électronique a balayage** * : http://nte-serveur.univ lyon1.fr/physiogerland/sysdigestif/page%20html/aa%2024.html ** : http://preveengeorge.blogspot.com/2011/02/h-pylori-and-peptic-ulcers.html 10 5-2-Caracteres bio chimiques : Helicobacter pylori est micro-aérophile (mais capable de croître en anaérobiose en présence de CO2) et possède une catalase, une oxydase, une nitrate réductase ainsi qu'une uréase très active. Elle n'acidifie pas les sucres, et cultive à une température comprise entre 33 et 40°C. Elle est RM et VP négatifs. (Ferrand, 2009) 5-3-Caracteres culturaux : Elle croît lentement (3 à 4 jours minimum) et exige des conditions de culture particulières (micro-aérophile) et des milieux de culture additionnés de sang, de sérum ou de suppléments d'enrichissement (Flandrois,1997) tels que la gélose PYL (sélective pour H.pylori) ou Columbia additionnée de sang. Les colonies sont petites (0.5 mm) ou en nappes brillantes et non hémolytiques.* (Figure n°6)
Figure n°6 : Aspect des colonies de H.pylori sur gelose Columbia au sang frais* 5-4-Genetique : Le génome de H. pylori est séquencé depuis 1997 : il possède 1 667 867 paires de bases codant pour 1590 protéines essentielles. Environ trente pour cent des gènes de Helicobacter pylori sont spécifiques à l'espèce et une grande variabilité génétique peut être retrouvée entre les différentes souches. Cette hétérogénéité se manifeste par des taux de mutation et de recombinaison importants, par l'acquisition d'ADN étranger (endogène ou exogène à l'espèce) et par des différences au niveau de l'organisation des gènes. Helicobacter pylori possède environ 1200 gènes communs à toute l'espèce et 200 à 400 gènes présents de manière variable selon les souches. La majorité des différences génétiques est retrouvée dans la zone de plasticité et dans l'îlot de pathogénicité cag. (cf. § 6-1) L'importance des taux de mutation et de recombinaison serait due au manque d'efficacité du système de réparation de H.pylori. De plus, Helicobacter pylori peut possèder des plasmides ou des systèmes d'import d'ADN qui lui permettent d'augmenter son adaptabilité. Ainsi, les analyses in silico ont permis de montrer que les gènes de ménage ou de virulence peuvent être transférés entre bactéries. Ces gènes peuvent provenir d'autres espèces du genre Helicobacter mais également d'autres genres bactériens. (Ferrand, 2009) * : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf 11 La diversité génétique de Helicobacter pylori s'explique aussi par des différences notables, entre les souches, dans l'organisation générale du génome, l'ordre des gènes et les séquences protéiques théoriques. La grande variabilité génétique de Helicobacter pylori pourrait être due à sa voie de transmission intrafamiliale et à sa grande adaptation à un hôte unique. (Fauconnier,1998) 6- Pouvoir pathogène de Helicobacter pylori : 6-1-Fa cteurs de virulence : Helicobacter pylori dispose de tout un arsenal de propriétés lui permettant de résister à l'acidité gastrique, de se mouvoir dans le mucus gastrique d'une grande viscosité et d'échapper aux réponses du système immunitaire de l'hôte (facteur de colonisation et de persistance). Les facteurs de colonisation sont généralement exprimés par l'ensemble des souches cliniques. D'autres facteurs sont plus spécifiquement associés à la genèse des lésions et interviennent en altérant l'intégrité de la muqueuse ou en déclenchant, puis modulant la nature de la réaction inflammatoire (facteurs de pathogénicité). La présence ou non des gènes codant ces facteurs, ou leur expression, est une composante variable. (Ferrand, 2009) (Tableau I) Tableau I : Fa cteurs de virulence de Heli coba cter pylori (Amir-Tidani, 2003)
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* Ces flagelles sont Constitués de 2 protéines distinctes FlaA et FlaB et sont recouverts d'une gaine permettant une protection contre l'acidité gastrique. (Fauconnier, 2002) ** L'uréase transforme l'urée en dioxyde de carbone et ammoniac permettant de neutraliser localement l'acidité gastrique et
créer ainsi un microenvironnement favorable rôle essentiel de cette molécule. (Gerhard et al., 2002) *** La cytotoxine vacuolisante VacA tient son nom de sa capacité à induire l'apparition de vacuoles dans certaines lignées de cellules épithéliales. (Lamarque, 2001) **** l'îlot de pathogénicité « cag » code pour un système de sécrétion de type IV : le TSS4 qui permet d'injecter, dans le cytoplasme de la cellule cible, la protéine CagA (Ferrand, 2009). 6-2- Physiopathologie :
Figure n°7 : Résumé de la pathogenicite de H. pylori (Ferrand, 2009) 1/ Les flagelles et la forme spiralée de H. pylori permettent une mobilité dans le mucus. L'uréase bactérienne permet de créer un microenvironnement tamponné favorable à sa survie. 2/ La présence d'adhésines permet une adhérence à la surface cellulaire. 3/Cette liaison induit la production de cytokines pro inflammatoires. 4/ Ces cytokines pro-inflammatoires recrutent les cellules de l'immunité circulante. 5/ Ces cellules sont responsables d'une inflammation locale entraînant des lésions cellulaires. (Figure n°7) 6/ D'autre part, H. pylori secrète la cytotoxine vacuolisante, VacA. Ses effets sont nombreux sur les cellules : (Figure n°8)
Figure n° 08 : Effets de la cytotoxine va cuolisante Va cA. (Ferrand, 2009) 8/In vivo, l'administration de la protéine Vac A purifiée à des souris est responsable d'une dégénération de la muqueuse gastrique. (Figure n°7) 9/ Les bactéries retrouvées sur la face basale des cellules épithéliales se lient spécifiquement aux intégrines alpha5beta1 et injectent la protéine CagA et le peptidoglygane (PGN) via le TSS4. 10/CagA perturbe les voies de signalisation cellulaire et modifie la morphologie épithéliale en désorganisant les jonctions intracellulaires. La perturbation des jonctions serrées peut jouer un rôle dans le développement tumoral. 11/ La sécrétion de NapA et la production de cytokines pro-inflammatoires induite par CagA et le PGN sont responsables d'un recrutement de cellules immunitaires. 12/ H. pylori bloque également la maturation des lymphocytes et induit leur apoptose. (Ferrand, 2009) 6-3- E chappement a la reponse immunitaire de l'hate : Toute infection entraîne une réponse immunitaire à la fois humorale et cellulaire de la part de l'hôte. Toutefois H.pylori persiste pendant longtemps dans l'estomac, en échappant aux systèmes de défense de l'organisme. Différents mécanismes expliquent l'échec de la réponse immunitaire : Le premier repose sur la saturation des anticorps opsonisants, par une libération abondante, programmée ou non par H.pylori, d'antigènes extrêmement immunogènes tels que l'uréase, la catalase ou encore la protéine de choc thermique Hsp B. (AmirTididani, 2003) En outre le lipopolysaccharide de H.pylori caractérisé par un faible pouvoir endotoxique, est capable de mimétisme par la présence de motifs antigéniques de type Lewis X ou Lewis Y également présents à la surface des cellules épithéliales gastriques. (Szczepanik,2006) De plus, lors d'une infection, H.pylori est phagocyté par les macrophages mais peut retarder cette internalisation et rester viable après fusion des phagosomes. La bactérie est également capable d'induire l'apoptose des macrophages permettant une évasion de la réponse immunitaire innée. Ces mécanismes de résistance seraient portés par des facteurs de virulence, les souches dépourvues de l'îlot de pathogénicité cag et du gène vacA étant plus sensibles à la phagocytose. (Lamarque et Peek, 2003) Enfin, H.pylori sécrète une catalase, une superoxyde dismutase (SOD) et une alkylhydroperoxyde-réductase qui lui permettent d'échapper aux réactions humorales et à la phagocytose. Ces enzymes convertissent les radicaux libres bactéricides (en particulier H2O2) libérés par les lysosomes des polynucléaires neutrophiles en réponse à l'infection par H.pylori, en composés inoffensifs tels que l'oxygène, alors que l'uréase neutraliserait l'environnement phagolysosomial. (Ferrand, 2009) 6-4- Aspects cliniques : La lésion de base de l'infection à H. pylori est une gastrite, c'est-à-dire une inflammation de la muqueuse gastrique. Elle peut persister des décennies, voire toute la vie du sujet mais n'est pas forcément symptomatique. Par contre, elle peut évoluer vers les maladies suivantes : Maladie ulcéreuse: L'infection à H. pylori peut évoluer dans environ 5% des cas, vers la maladie ulcéreuse. Elle va fragiliser la muqueuse qui devient alors sensible à l'acide. Cancer gastrique: L'infection à H. pylori est la première infection bactérienne associée au développement de cancers chez l'homme. Dans moins de 1% des cas, la gastrite va évoluer vers un carcinome gastrique. Le lymphome du MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue), autre cancer gastrique, encore plus rare a vu son pronostic transformé depuis la connaissance de H. pylori. (Megraud ,2004)
Infection chronique à Helicobacter pylori Gastrite chronique, Gastrite surtout au niveau du acidité normale, pas corps. Acidité réduite. Atrophie
d'atrophie. (85%) (10%)
Gastrite surtout au niveau de l'antre, pas d'atrophie, acidité accrue.
(5%) Pas de signe Lymphome du MALT Clinique (0.1%) Ulcère duodénal Gastrite atrophique
Métaplasie ulcère gastrique Intestinale (1%) (10%)
Dysplasie
Adénocarcinome Figure n° 09: Pathologies gastro-intestinales induites par l'infe ction a H. pylori. (Ferrand, 2009)
Les méthodes de recherche de Helicobacter pylori sont classées en « invasives » ou « non invasives » selon qu'elles nécessitent ou non une fibroscopie gastro-duodénale. 8-1-Méthodes invasives (dire ctes) : Elles consistent à pratiquer plusieurs biopsies de la muqueuse antrale ou fundique au cours d'un examen endoscopique et à rechercher les bactéries dans ces prélèvements biopsiques. La mise en évidence des germes se fait par trois méthodes différentes, souvent combinées. En règle générale, trois biopsies sont examinées au laboratoire, chacune d'entre elle servant à réaliser une des méthode suivantes : ( Mégraud , 1997) - Recherche de l'activité uréasique : Cette technique consiste à rechercher l'activité uréasique des germes contenus dans un fragment de biopsie en plaçant celui-ci dans un milieu urée-indole (contenant un indicateur coloré). En présence de l'uréase bactérienne, l'urée est hydrolysée en ammoniac et CO2 en quelques minutes à quelques heures. La réaction s'accompagne de l'alcalinisation du milieu et du virage de l'indicateur.* (Figure n°10) * : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf
Figure n°10: Test de l'urease en milieu Uree-Indol.* - Examen direct : Les biopsies sont soit broyées soit dilacérées stérilement au scalpel. Le produit, étalé sur une lame, est coloré par la méthode de Gram. Cette méthode permet de mettre en évidence H.pylori à la surface de l'épithélium de la muqueuse.* (Figure n°11)
Figure n°11 : Fragment de biopsie gastrique colore par la methode de Gram.** - Culture : La culture est théoriquement l'examen de référence pour le diagnostic d'une infection à H.pylori. Elle permet essentiellement l'étude de la sensibilité aux antibiotiques. (AmirTididani, 2003) La biopsie est dilacérée ou broyée puis ensemencée en milieu solide (enrichi en suppléments et agents sélectifs). Après une incubation de 2 à 5 jours à 37° C et dans une atmosphère appauvrie en oxygène, la croissance obtenue sur une gélose enrichie au sang se traduit par l'apparition de colonies translucides, non pigmentées d'un diamètre d'environ 1 mm.* (Figure n°9)
Figure n°12 : Aspects des colonies de Helicobacter pylori sur gelose Columbia au sang. ** * : http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf ** : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html L'identification de H.pylori passe par deux étapes :
Figure n°14: Bandelette ELISA pour le serodiagnostic. ** Le sérodiagnostic est utile en dépistage mais a l'inconvénient de rester positif de nombreux mois après éradication de la bactérie, les anticorps étant toujours présents dans le sérum des patients. *: http://bacterioweb.univ-fcomte.fr/bibliotheque/remic/23-Helic.pdf ** : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html - Recherche des antigènes fécaux : Cette méthode récemment proposée, est un test ELISA qui consiste à rechercher les antigènes de Helicobacter pylori sur un échantillon de selles. Elle est indiquée dans le contrôle de l'éradication à condition de respecter un intervalle de 8 semaines après arrêt du traitement. Il est surtout très performant chez les enfants de tout âge : c'est la méthode non invasive de choix pour ce groupe de patients. (AmirTidadini,2003) Tableau II : Sensibilite et Specificite des methodes de diagnostic bacteriologique (AmirTidadini,2003) Méthodes Sensibilité Spécificité Test rapide à l'urée 85 à 95% 99% Culture 80 à 90% 95 à 100% Test respiratoire à l'urée marquée 90 à 98% 99% Recherche des antigènes fécaux 89 à 98% > 90% Sérologie 85 à 95% 80 à 95% 9- Traitement : sensibilite aux antibiotiques : Le traitement consiste en une trithérapie de 7 jours associant un inhibiteur puissant de l'acidité gastrique : l'IPP (inhibiteur de la pompe à protons) et deux antibiotiques, le plus souvent l'Amoxicilline et la Clarithromycine (macrolide) ou encore le Métronidazole, si possible guidé par l'antibiogramme. (Vilaichone et al~,2006) (Figure n°15) La bactérie est éradiquée dans plus de 70 % des cas après un premier traitement. Les facteurs d'échec sont : résistance à la clarithromycine retrouvée dans 12 à 14 % des cas, mauvaise observance du traitement, âge inférieur à 50 ans et tabagisme. Après un traitement de deuxième ligne, 90 % des patients sont guéris de leur infection.*
Figure n°15 : Exemple d'antibiogramme pour les ma crolides dont l'erythromycine (E) * * : http://www.microbe-edu.org/professionel/diag/helicob.html Tableau III : Resistance de Helicobacter pylori aux antibiotiques, selon les pays. (Botuna Eleco, 2003)
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